無機(jī)元素的指紋圖譜分析在透明質(zhì)酸鈉來源鑒別中的應(yīng)用

劉航瑞 陳玉娟 臧洋 陸艷麗 周希蕊 黃思玲 李紅梅 郭學(xué)平* 馮流星*

1（中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029）

2（北京化工大學(xué)，北京 100029)

3（華熙生物科技股份有限公司，濟(jì)南 250101)

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是一種高分子材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料[1-2]、美容護(hù)膚[3-4]、藥物傳遞[5]和組織工程[6-7]等領(lǐng)域。透明質(zhì)酸鈉（Sodium hyaluronate，SH）是透明質(zhì)酸的鈉鹽，具有更好的水溶性和穩(wěn)定性，更易于加工和應(yīng)用于化妝品中。HA 的制造方法包括化學(xué)合成、酶促反應(yīng)合成、動物組織提取和生物發(fā)酵等?；瘜W(xué)合成HA 存在的主要問題是化學(xué)交聯(lián)劑的污染[8]，酶促反應(yīng)的缺點(diǎn)是這些酶缺乏絕對的底物特異性[9]，而動物組織提取則存在純化困難和交叉病毒感染等風(fēng)險[10]。目前，在HA 產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中，更多采用鏈球?qū)倬纳锇l(fā)酵模式，原料選擇、發(fā)酵和提純等環(huán)節(jié)均可能引入不同類型的元素[11]，導(dǎo)致不同廠家生產(chǎn)的SH 質(zhì)量參差不齊，并且不同廠家及不同工藝的HA 產(chǎn)品具有顯著的元素指紋特征。

近年來，無機(jī)元素指紋圖譜分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品[12-14]、藥品[15-17]和化妝品[18-20]等領(lǐng)域的質(zhì)量控制，通過對樣品中的無機(jī)元素含量進(jìn)行分析，可以為樣品建立一個獨(dú)特的指紋圖譜，從而實(shí)現(xiàn)對樣品的快速鑒別和質(zhì)量評估。目前，在化妝品的質(zhì)量控制中側(cè)重于測量少數(shù)有害元素（如Pb、Hg 和As 等），以保證產(chǎn)品的安全性，但不能提供足夠的信息對產(chǎn)品來源進(jìn)行分類和鑒別，而無機(jī)元素指紋圖譜分析技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、可靠、高靈敏度和高分辨率等特點(diǎn)，能夠?yàn)闃悠返馁|(zhì)量控制提供重要信息[14,21-23]。

本研究選取市場占有率較高的6 個廠家共計(jì)13 個批次的SH 產(chǎn)品，建立了SH 產(chǎn)品無機(jī)成分的分析方法。對于含量相對較高的Na 元素，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）進(jìn)行外標(biāo)法測量，Cl 元素采用離子色譜（IC）以外標(biāo)法測量。對于含量較低的其它無機(jī)元素，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）對樣品進(jìn)行全定量分析。將70 種元素的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行指紋圖譜分析，并選取含量較高的23 種元素繪制SH 指紋圖譜；采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各樣品間的相似性和差異性，并通過變量重要性投影（VIP）找出造成差異的關(guān)鍵元素；通過系統(tǒng)聚類分析（HCA）將樣品按照其無機(jī)成份相似度進(jìn)行分類，并繪制出聚類樹狀圖。通過元素指紋圖譜分析可清楚了解各批次之間的異同，為產(chǎn)品優(yōu)化和改進(jìn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7700x series 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；iCAP 7000 series 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀和Thermo-ICS-5000+型離子色譜儀（美國ThemoFisher Scientific 公司）；KDF S80 馬弗爐（日本SANSYO 公司）；ETHOS D 消解儀（意大利Milestone 公司）。

濃HNO3和H2O2（BV-Ⅲ級，北京化學(xué)試劑所）；ICP-MS 調(diào)諧液（10 μg/L Ce、Co、Li、Tl 和Y，美國Agilent 公司）；鈉單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）080260）、水中氯根成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）080269）和多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW（E）082431、GBW（E）082429 和GBW（E）082430）（中國計(jì)量科學(xué)研究院）。

13 批SH 樣品（編號H1～H13）分別來自6 個生產(chǎn)廠家：公司1（H1～H5），公司2（H6～H8），公司3（H9），公司4（H10～H11），公司5（H12），公司6（H13）。樣品均為白色粉末。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 微波消解

稱取0.1 g 樣品于消解罐中，依次加入7 mL 重蒸HNO3和1 mL H2O2，按照表1 中消解程序進(jìn)行微波消解，消解后的樣品呈透明清透的微黃色。將消解后的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，加水稀釋至33 g，采用ICPMS 測量無機(jī)元素，每個樣品測量3 次；由于樣品中Na 元素含量較高，需再稀釋40 倍用于ICP-OES 測量Na 元素，每個樣品重復(fù)測量3 次。

表1 透明質(zhì)酸鈉（SH）樣品的微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure for sodium hyaluronate (SH) samples

1.2.2 馬弗爐灰化

將0.1 g 樣品置于馬弗爐中加熱干燥灰化，程序如表2 所示。首先，在加熱干燥灰化前，加入適量KOH，盡可能保存Cl–。第一步為干燥樣品，第二步和第三步為碳化樣品，第四步為灰化樣品。灰化后，加入適量稀HNO3以調(diào)節(jié)pH=7。最后，加入適量超純水將樣品稀釋至適當(dāng)濃度，并稱量溶液質(zhì)量，采用IC測量Cl 元素，每個樣品測量3 次。

表2 SH樣品使用馬弗爐灰化程序Table 2 Muffle furnace ashing procedure for SH samples

1.3 儀器條件和分析方法

1.3.1 ICP-OES儀器條件

射頻功率為1150 W，泵速為50 r/min，輔助氣流速為0.5 L/min，霧化器氣體流速為0.5 L/min，冷卻氣流速為12 L/min，無輔助氣體。將鈉單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）080260）分別稀釋至1.0、2.0、5.0 和10.0 μg/g，采用ICP-OES 測量，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.9999。

1.3.2 IC儀器條件

采用自動抑制外加水模式的抑制器和電導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測。色譜柱為Dionex IonPac AS19 陰離子柱，柱箱溫度為30 ℃；抑制電流為50 mA；樣品進(jìn)樣量為25 μL；流速為1 mL/min。淋洗程序采用24 mmol/L KOH 溶液等度洗脫，運(yùn)行時長為10 min。采用水中氯根成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）080269）作為樣品中Cl?的定量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 ICP-MS儀器條件

使用調(diào)諧液（1 μg/L）調(diào)諧，使ICP-MS 儀器滿足靈敏度、雙電荷、氧化物和分辨率等工作指標(biāo)的要求，再進(jìn)行樣品中70 種元素的全定量分析。射頻功率1500 W；等離子體流速15 L/min；載氣流速（Ar）1.01 L/min；采樣錐深度8.0 mm，積分時間為0.1 s；碰撞模式為NoGas 模式。將多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液GBW（E）082431、GBW（E）082429 和GBW（E）082430 混合后稀釋至合適濃度，建立每種元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)均需大于0.999。

1.3.4 熱圖分析處理和指紋圖譜繪制

熱圖分析是一種可視化數(shù)據(jù)方法，采用不同種類、不同深淺的顏色呈現(xiàn)矩陣數(shù)據(jù)中每種元素的值，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。將13 批SH 中70 種元素全定量數(shù)據(jù)取平均值后導(dǎo)入Origin 程序，使用Z值均一化減少數(shù)據(jù)差異，提高數(shù)據(jù)的可比性，然后繪制熱圖。從70 種元素全定量分析結(jié)果中挑選含量較高、有代表性的22 種元素（Li、B、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Br、Se、Rb 和Sr）繪制指紋圖譜，由于不同元素之間含量相差多個數(shù)量級，因此，將Mg、Si、P、K 和Ca 含量縮小100 倍，將Mn 和Sr 含量縮小10 倍。

1.3.5 數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析處理

數(shù)據(jù)處理軟件為Microsoft Excel、Origin 2021 和MetaboAnalyst。

PCA 是一種將高維數(shù)據(jù)降維的方法，高維數(shù)據(jù)通過線性變換投影到一個新的低維空間中，減少變量，降低維數(shù)并同時盡可能地保留數(shù)據(jù)的信息。PCA 分析不依托數(shù)據(jù)的分組信息，是一種無監(jiān)督的分析方法。PLS-DA 是一種有監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)方法，結(jié)合偏最小二乘回歸和判別分析的思想，尋找對分組有顯著影響的變量。OPLS-DA 通過正交化進(jìn)一步放大變量的影響，能更好地解釋樣本分類，但是OPLS-DA 可能過度擬合數(shù)據(jù)，導(dǎo)致預(yù)測性能下降。

將13 批SH 樣品的70 種元素全定量分析的3 次平行數(shù)據(jù)導(dǎo)入到MetaboAnalyst，使用Z 值均一化后進(jìn)行PCA 和PLS-DA。PCA 采用協(xié)方差矩陣；PLS-DA 依托的分組信息為生產(chǎn)廠家，分為1～6 組；對PLS-DA 分不開的組再單獨(dú)進(jìn)行OPLS-DA 分析。

1.3.6 HCA處理和指紋圖譜繪制

HCA 是一種無監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析方法，通過測量樣本之間的距離（相似性）將其分為不同的群組，可以直觀地從樹狀圖中看出樣本之間的相似程度。將上述熱圖使用的Z值均一化后的數(shù)據(jù)，采用平均聚類方法和Euclidean 平方距離類型進(jìn)行HCA 處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 SH樣品主要元素的測定結(jié)果

13 批SH 樣品中的Na 元素和Cl 元素檢測結(jié)果見表3。SH 中Na 元素含量大于400 mg/g，其中，H6～H9 樣品中Na 元素含量較低（＜450 mg/g），其它樣品的Na 元素含量較高；Cl 元素含量在不同廠家樣品中的差異較明顯，其中，公司4 的H10 的含量超過3000 μg/g，公司6 的H12 的含量超過7000 μg/g，其余樣品均超過2000 μg/g，含量最高的H12 與含量最低的H11 相差近68 倍。

表3 SH樣品中Na和Cl含量測量結(jié)果Table 3 Measurement results of Na and Cl content in SH samples

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 熱圖與指紋圖譜結(jié)果

采用ICP-MS 對樣品中70 種元素進(jìn)行全定量分析，所得數(shù)據(jù)再進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見圖1A。通過熱圖可直觀地看出所有樣品中的無機(jī)元素含量，紅色代表此樣品中該元素的含量相對其它樣品偏高，藍(lán)色則代表偏低。由圖1A 可見，公司1 的H2 樣品中B、P、Ni 和I 等元素含量顯著低于其它樣品，H3、H4樣品中Zn、Ru、Rh、Au 和Pb 含量相似，均高于其它樣品。公司2 的H6～H8 樣品中Ga、I、La、Tb、Ba～Er 等多種元素含量相似，均高于其它樣品。公司6 的H13 樣品中多種無機(jī)元素含量顯著高于其它樣品。13 批SH 樣品全定量分析結(jié)果中22 種含量較高的元素繪制的指紋圖譜見圖1B，樣品的指紋圖譜峰型總體走勢基本一致，但是Al、Si、P、Ca、Ti 和Cr 等元素含量差異明顯。綜上所述，通過ICP-MS 全定量分析數(shù)據(jù)的熱圖和指紋圖譜分析可以快速了解樣品中無機(jī)元素的相對含量，發(fā)現(xiàn)樣品之間的差異性和相似性，為質(zhì)量控制和生產(chǎn)優(yōu)化提供有力支持。

圖1 （A）13 批SH 樣品中70 種元素全定量分析結(jié)果；（B）13 批SH 樣品中22 種元素指紋圖譜Fig.1 (A)Semi-quantitative results of 70 kinds of elements in 13 batches of SH samples;(B)Fingerprint map of 22 kinds of elements in 13 batches of SH samples

根據(jù)我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）[24]要求，化妝品中相關(guān)元素限定標(biāo)準(zhǔn)分別為Pb ≤10 mg/kg，Hg ≤1 mg/kg，As ≤2 mg/kg，Cr ≤5 mg/kg。根據(jù)測定結(jié)果可知，這6 個生產(chǎn)廠家的13 批SH 樣品中相關(guān)元素含量均未超過限定標(biāo)準(zhǔn)。但是，有一些分析結(jié)果值得注意：公司2 的H6～H8 樣品中鑭系元素（La～Lu）含量均高于其它樣品；公司5 樣品中H12 的Cl 元素含量遠(yuǎn)超其它樣品；公司3 的H9樣品和公司6 的H13 樣品中多種元素含量超過其它樣品，并且個別重金屬元素也接近我國標(biāo)準(zhǔn)限定水平。這些元素含量過高的產(chǎn)品可能會對人體造成潛在危害，因此，生產(chǎn)廠家應(yīng)格外重視生產(chǎn)原材料的安全和生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。

2.2.2 PCA結(jié)果

對數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 的結(jié)果見圖2A，主成分貢獻(xiàn)率見圖2B。此模型中，主成分PC1 和PC2 分別占比26.3%和20.8%，累計(jì)貢獻(xiàn)率47.1%，占比過小，說明這兩種主成分不能完全解釋原始數(shù)據(jù)中的變化，SH樣品中多種元素含量具有較大的方差，使得主成分解釋力度較弱。由PCA 圖可知，公司2 和公司6 的數(shù)據(jù)點(diǎn)與其它公司距離較遠(yuǎn)，能明顯區(qū)分開；但公司1、3、4 和5 的數(shù)據(jù)點(diǎn)在圖中距離較近，不能完全分開，說明PCA 模型構(gòu)建效果欠佳，需要使用其它方法進(jìn)一步分析。

圖2 （A）來自6 家公司的SH 中70 種元素含量的PCA 圖，不同顏色代表來自不同公司（下同）；（B）前5 個主成分因子的貢獻(xiàn)率（PC1～PC5），橫坐標(biāo)表示主成分順序Fig.2 (A) Principal component analysis (PCA) score plots of 70 kinds of elements in SH from 6 companies,different colors represent from different companies (the same below);(B) The contribution rate of the first 5 principal component factors (PC1?PC5),the abscissa represents the principal component order

2.2.3 PLS-DA和OPLS-DA結(jié)果

對全定量分析數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA 的結(jié)果見圖3A，圖3B 為VIP 得分圖，公司3～公司6 的樣品都得到了較好分離，公司4 和公司5 的樣品有少許重疊可以忽略，但是公司1 和公司2 的樣品還有較大區(qū)域重疊，較難分類，需要進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA 放大兩者的差異。由圖3B 可見，多種元素（Li、Ca、Nb、P、Mg、Sr、Zr、Al、Pd 和As 等26 種元素）對樣品分類非常重要（VIP ＞1），熱圖分析也表明這些元素在不同樣品之間顏色變化明顯（圖1A），含量差異較大。PLS-DA 的交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率為84.6%，可以較好地評估和鑒別公司3～公司6 生產(chǎn)的SH 的廠家來源。

圖3 來自6 家公司的SH 中70 種元素含量的（A）PLS-DA 圖和（B）PLS-DA 的VIP 得分圖；來自公司1和公司2 的SH 中70 種元素含量的（C）OPLS-DA 圖和（D）OPLS-DA 的VIP 得分圖Fig.3 (A) PLS-DA score plots of 70 kinds of elements of SH from six companies and (B) corresponding VIP plot of PLS-DA;(C) OPLS-DA score plots of 70 kinds of elements in SH from companies 1 and 2,and (D)corresponding VIP plot of OPLS-DA

對公司1 和公司2 的樣品使用OPLS-DA 方法進(jìn)一步分類，以探究對這兩組樣品分類起重要作用的元素。將公司1 和公司2 的數(shù)據(jù)單獨(dú)進(jìn)行Z值均一化后再進(jìn)行OPLS-DA 分析，結(jié)果如圖3C 所示，VIP得分圖見圖3D?？梢姽? 和公司2 的樣品得到很好分離，其中，Ho、Y、Eu、Dy、U、La 和Er 等元素對這兩個樣品分類起到重要作用（VIP ＞1）。OPLS-DA 的交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率為97.8%，表明這些變量包含足夠的信息用于區(qū)分這兩種樣品的來源。綜上，采用PLS-DA 和OPLS-DA 方法對全定量分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以鑒別SH 的廠家來源，并確定影響樣品分類的重要變量。

2.2.4 HCA結(jié)果

HCA 結(jié)果如圖4 所示，橫坐標(biāo)代表距離，節(jié)點(diǎn)越向右代表樣品關(guān)系越遠(yuǎn)，在距離100 處，可將13 批樣品分為6 組：H1～H5、H10～H11、H12、H9、H6～H8 和H13，恰好對應(yīng)6 家公司，表明同一公司的SH 產(chǎn)品具有較高的相似程度，不同公司生產(chǎn)的SH 具有較大的差異。在距離150 處，公司1 的H1～H5、公司3的H9、公司4 的H10～H11 和公司5 的H12 可以歸為一類；公司2 的H6～H8 為一類；公司6 的H13 為一類，這與PCA 中公司1、3、4、5 的位置相互重疊，而公司2、6 分離較好的結(jié)論一致。

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram

3 結(jié)論

探討了無機(jī)元素指紋圖譜分析技術(shù)在SH 鑒別和質(zhì)量評估中的應(yīng)用。采用ICP-MS 等方法對13 個不同廠家不同批次的SH 樣品中的Na 元素和Cl 元素進(jìn)行定量分析，對70 種無機(jī)元素含量進(jìn)行了全定量分析，并采用熱圖、指紋圖譜、PCA、PLS-DA、OPLS-DA 和HCA 建立了SH 中的無機(jī)元素指紋圖譜。結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的SH 樣品中的無機(jī)元素含量和種類存在明顯差異，通過無機(jī)元素指紋圖譜可對SH 進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，在SH 的來源鑒別、質(zhì)量控制、生產(chǎn)管理和監(jiān)管等方面具有重要意義。本研究涉及的樣品數(shù)量較少，對市場上銷售的SH 產(chǎn)品的代表性不足，未來需要增加樣品數(shù)量和種類，并考慮更多維度的指紋圖譜特征，以提高方法對SH 產(chǎn)品的鑒別和評價能力。