基于傳感/信號(hào)分離的雙極電極-電化學(xué)發(fā)光酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)膽固醇

劉利陽 黃聲秀 姚清達(dá) 楊偉強(qiáng) 倪建聰

（閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，漳州 363000）

膽固醇（Cholesterol，CHOL）也稱膽甾醇，是多種疾病診斷的重要生理指標(biāo)[1-2]。體內(nèi)高水平的CHOL是誘發(fā)高血壓[3]、動(dòng)脈硬化[4]和心肌梗塞[5]等多種疾病的主要因素，而低水平的CHOL 也可能會(huì)導(dǎo)致低脂蛋白[6]、敗血癥[7]、甲亢[8]和肝病[9]等疾病。因此，準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)體內(nèi)CHOL 含量對(duì)臨床診斷和疾病預(yù)防非常重要。目前，常用的CHOL 檢測(cè)方法包括酶法[10]、比色法[11]、高效液相色譜（HPLC）法[12]、熒光法[13]、電化學(xué)法[14]、電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）法[15]等。其中，ECL 法是在電極表面施加一定的電壓，使發(fā)光體電激發(fā)形成激發(fā)態(tài)，在回到基態(tài)過程中以光的形式釋放能量，從而獲得ECL 響應(yīng)信號(hào)[16-17]。ECL 具有高靈敏、低背景、簡(jiǎn)單可控等特點(diǎn)，在臨床分析診斷領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[18-19]。但是，在檢測(cè)生物樣本時(shí)，ECL 傳感過程易受到復(fù)雜基質(zhì)的干擾，產(chǎn)生非特異性檢測(cè)信號(hào)。雙極電極（Bipolar electrode，BPE）是在外加電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下導(dǎo)體兩端發(fā)生極化的現(xiàn)象，將其與ECL 結(jié)合可以構(gòu)建傳感端和信號(hào)端分離的雙極電極-電化學(xué)發(fā)光（BPE-ECL）檢測(cè)方法[20]。如Lu 等[21]在印刷電極上設(shè)計(jì)一段碳基雙極電極，其陰極端修飾的核酸探針在靶標(biāo)赭曲霉毒素A 的存在下引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并結(jié)合辣根過氧化物酶，催化苯胺/過氧化氫的聚合反應(yīng)；陽極端信號(hào)池中的釕聯(lián)吡啶/三正丙胺（Ru（bpy）32+/TPrA）發(fā)光體系的信號(hào)受陰極端催化過程的電子轉(zhuǎn)移調(diào)控。通過構(gòu)筑分離的傳感檢測(cè)池和信號(hào)收集池，可以避免樣本基質(zhì)對(duì)發(fā)光體系的直接干擾。BPE-ECL 傳感模式近年來受到了廣泛關(guān)注，并已被開發(fā)用于DNA[22]、癌癥標(biāo)志物[23]和細(xì)菌[24]等靶標(biāo)的檢測(cè)，但尚無將BPE-ECL 體系用于人體內(nèi)CHOL 含量檢測(cè)的報(bào)道。

本研究開發(fā)了一種酶催化的BPE-ECL 傳感平臺(tái)用于測(cè)定人血清中CHOL 的含量，此傳感器具有傳感/信號(hào)分離的特點(diǎn)。如圖1 所示，利用光刻法在氧化銦錫（Indium tin oxide，ITO）導(dǎo)電玻璃電極上刻蝕出導(dǎo)電ITO（綠色部分）的雙極電極及外接驅(qū)動(dòng)電極，并在驅(qū)動(dòng)電極負(fù)極和BPE 陰極電沉積納米金（AuNPs，黃色部分）；利用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）在BPE 的陰極端和陽極端分別構(gòu)筑獨(dú)立的傳感檢測(cè)池和信號(hào)收集池（白色部分）。在BPE 陰極端電聚合殼聚糖（CS）并固定膽固醇氧化酶（Cholesterol oxidase，CHOx），在信號(hào)池中加入Ru（bpy）32+/TPrA 作為發(fā)光信號(hào)源。當(dāng)檢測(cè)池中存在CHOL 時(shí)，CHOx催化氧化CHOL 分解并生成H2O2；在外電壓的驅(qū)動(dòng)下，BPE 保持電荷守恒但兩端發(fā)生極化[25]，陰極端的H2O2發(fā)生還原反應(yīng)，并將電子轉(zhuǎn)移至BPE 陽極端，引發(fā)信號(hào)池中Ru（bpy）32+/TPrA 的氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的ECL 響應(yīng)。隨著檢測(cè)池中CHOL 濃度增大，BPE 陰極端的CHOx 催化產(chǎn)生更多的H2O2，從而使信號(hào)池的ECL 信號(hào)更強(qiáng)，由此建立了一種傳感/信號(hào)分離的CHOL 檢測(cè)新方法。

圖1 雙極電極-電化學(xué)發(fā)光膽固醇酶?jìng)鞲衅鞯臉?gòu)建及傳感原理示意圖Fig.1 Schematic of construction and sensing mechanism of BPE-ECL enzymatic biosensor for detection of cholesterol

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660E 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；BPCL-1-T 微弱發(fā)光儀（北京亞泊斯儀器公司）；FR224CN 電子天平（上海奧斯豪儀器有限公司）；JSM-IT510 掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社公司）；DZF-6050 真空干燥箱（上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司）；KDC-40 高速離心機(jī)（美國瓦里安公司）；ITO 電極（華南湘城科技有限公司）；Direct-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

CHOL、CHOx、Ru（bpy）32+、TPrA、HAuCl4、K3Fe（CN）6、K4[Fe（CN）6、正性光刻膠（AZP4620）和PDMS 購自上海阿拉丁試劑有限公司；HNO3、HCl、HAc、NaOH、KCl、戊二醛（GA）、抗壞血酸（AA）、尿酸（UA）、檸檬酸（CA）、多巴胺（DA）、葡萄糖（Glu）、維生素E（VE）、CS 和磷酸鹽緩沖溶液（PBS）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；人血清樣本由福建省漳州市醫(yī)院提供，患者知情同意，相關(guān)研究經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ITO電極的圖案化制備

參照文獻(xiàn)[26]，利用光刻法對(duì)ITO 電極進(jìn)行圖案化處理。將ITO 電極粘附在甩膠機(jī)的旋轉(zhuǎn)圓盤上，并涂覆正性光刻膠，以3000 r/min 甩膠40 s 使之均勻；將ITO 電極置于110 ℃烤膠機(jī)上加熱3 min，冷卻至室溫后，將光刻掩版置于ITO 電極表面并在紫外燈下曝光4 min；將ITO 電極浸沒在0.7%NaOH 溶液中顯影；將光膠圖案化的ITO 電極浸入HNO3/HCl/H2O 刻蝕液（4∶5∶5，V/V）中，刻蝕掉暴露的ITO 層，超聲20 min 除去表面的光膠，即可得到導(dǎo)電部分圖案化的ITO 電極。

1.2.2 BPE傳感器的制備

在驅(qū)動(dòng)電極負(fù)極和BPE 陰極電沉積AuNPs。在檢測(cè)池與信號(hào)池中分別加入100 μL HAuCl4溶液（2.4 mmol/L，含0.1 mol/L KCl），施加6.0 V 的外電壓300 s，然后用水將ITO 電極沖洗干凈。

將PDMS 預(yù)聚物和固化劑按質(zhì)量比10∶1 進(jìn)行混合，攪拌，真空脫氣30 min 后倒入模具，于60 ℃固化3 h。用打孔器將固化后的PDMS 制成方形池（直徑10 mm，孔深3 mm），并粘貼于ITO 雙極電極部分的兩端，即制得BPE 傳感器。

1.2.3 CHOx的固定

在檢測(cè)池中加入CS 的1%乙酸溶液，信號(hào)池中加入100 mmol/L PBS 緩沖液，施加?0.4 V 的外電壓200 s，即可在BPE 的陰極端電聚合上CS 薄膜。在BPE 陰極端滴加20 μL CHOx（1.0 mg/mL）與2 μL 戊二醛（1%）的混合溶液，待電極干燥后，重復(fù)該操作3 次。

1.2.4 CHOL的ECL檢測(cè)

在檢測(cè)池中加入100 μL 含不同濃度CHOL 的PBS 溶液（100 mmol/L，pH=7.0），在信號(hào)池中加入100 μL 含1 mmol/L Ru（bpy）32+和5 mmol/L TPrA 的PBS 溶液（100 mmol/L，pH=7.0）。將傳感器在37 ℃孵育25 min 后進(jìn)行ECL 測(cè)試，每個(gè)樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)試。ECL 檢測(cè)條件：BPCL 工作電壓為800 V；循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）掃描電壓范圍為1.0～4.0 V，掃速為100 mV/s。采用本方法檢測(cè)血清中的CHOL，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并與HPLC 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同修飾電極的表征

BPE 陰極端位于檢測(cè)池內(nèi)，其上負(fù)載的CHOx 催化CHOL 水解生成H2O2，其表面修飾情況對(duì)傳感器的性能有重要影響。利用掃描電鏡（SEM）對(duì)BPE 陰極端修飾過程進(jìn)行了表征。由圖2A 可見，裸ITO 電極表面非常潔凈；由圖2B 可見，BPE 陰極端電沉積AuNPs 后，AuNPs 比較致密且基本覆滿電極表面。電沉積AuNPs 避免了ITO 電極在高負(fù)電位下?lián)p壞，并加快電子轉(zhuǎn)移速率。為了給CHOx 提供有效負(fù)載位點(diǎn)，在BPE 陰極端電聚合一層CS 薄膜得到CS/AuNPs/ITO，在電極的表面和截面（圖2C）均可見CS 薄膜均勻地覆蓋在BPE 陰極端。采用滴涂的方式將CHOx 固定在BPE 陰極端得到CHOx/CS/AuNPs/ITO，滴涂后的CHOx 呈圓球形且?guī)缀鯇㈦姌O表面覆滿，上層表面還具有凹陷的活性位點(diǎn)（圖2D），表明CHOx 成功修飾在BPE 陰極表面。

圖2 BPE 陰極端修飾電極表面的掃描電鏡（SEM）圖：（A）ITO；（B）AuNPs/ITO；（C）CS/AuNPs/ITO；（D）CHOx/CS/AuNPs/ITO。插圖為對(duì)應(yīng)的電極截面圖Fig.2 Surface and cross-sectional scanning electron microscopy (SEM) images of modified BPE cathode:(A) Bare ITO;(B) AuNPs/ITO;(C) CS/AuNPs/ITO;(D) CHOx/CS/AuNPs/ITO.Insets are corresponding cross sections of different electrodes

采用電化學(xué)方法研究BPE 陰極端的傳感性能。[Fe（CN）6]3–/4–探針在不同修飾BPE 陰極上的CV 曲線如圖3A 所示，與裸ITO（曲線a）相比，電沉積AuNPs 的電極界面（曲線b）具有更高的電化學(xué)信號(hào)，說明AuNPs 的沉積增強(qiáng)了電極的導(dǎo)電性；電聚合CS 后，CS/AuNPs/ITO（曲線c）的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)降低，這是由于CS 導(dǎo)電性較差，阻礙了電極表面的電子傳遞；滴涂CHOx 后，CHOx/CS/AuNPs/ITO（曲線d）的電化學(xué)信號(hào)進(jìn)一步降低，說明CHOx 成功固定在電極表面。電化學(xué)交流阻抗譜（EIS）表征結(jié)果如圖3B 所示，裸ITO（曲線a）的Nyquist 曲線在高頻區(qū)呈現(xiàn)較小的半圓，表明電極的電子傳遞阻抗（Ret）較小，探針[Fe（CN）6]3?/4?在該界面的電子傳遞速率較快；電沉積AuNPs 后，阻抗譜圖中半圓直徑減?。ㄇ€b），表明AuNPs 有利于促進(jìn)電子傳遞；由于CS 導(dǎo)電性差，CS/AuNPs/ITO 的半圓直徑明顯增大（曲線c）；CHOx/CS/AuNPs/ITO的半圓直徑進(jìn)一步增大（曲線d），表明大量不導(dǎo)電的酶固定在電極表面。以上EIS 結(jié)果表明，BPE 陰極傳感端已成功構(gòu)建。

圖3 BPE 陰極端不同修飾電極在含1.0 mmol/L 的[Fe（CN）6]3–/4–的0.1 mol/L KCl 溶液中的（A）循環(huán)伏安（CV）圖和（B）交流阻抗（EIS）圖：（a）ITO；（b）AuNPs/ITO；（c）CS/AuNPs/ITO；（d）CHOx/CS/AuNPs/ITOFig.3 (A) Cyclic voltammetry (CV) and (B) electrochemical impedance spectroscopic (EIS) characterization of different BPE cathodes in 100 mmol/L KCl solution containing 1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3–/4–: (a) Bare ITO;(b) AuNPs/ITO;(c) CS/AuNPs/ITO;(d) CHOx/CS/AuNPs/ITO

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了使傳感器性能達(dá)到最佳，對(duì)檢測(cè)池BPE 陰極端的CHOx 的固載量、酶催化反應(yīng)的溫度、緩沖液pH 值和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。首先考察了BPE 陰極端CHOx 固載量對(duì)傳感器性能的影響。如圖4A 所示，隨著滴加的CHOx 酶固定液濃度增加，ECL 信號(hào)逐漸增大，表明CHOx 固載量增多，能夠有效催化CHOL 并產(chǎn)生大量的H2O2，使陽極端的ECL 信號(hào)增強(qiáng)；當(dāng)酶固定液濃度超過1.0 mg/mL 時(shí)，ECL 信號(hào)基本維持穩(wěn)定。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇CHOx 酶固定液濃度為1.0 mg/mL。催化反應(yīng)溫度的影響如圖4B 所示，ECL 信號(hào)隨著催化反應(yīng)溫度上升而增強(qiáng)，并在37 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后隨溫度增加而逐漸下降。這是因?yàn)槊复呋磻?yīng)通常有一個(gè)最適溫度。本研究中CHOx 催化反應(yīng)的最適溫度為37 ℃。檢測(cè)池中溶液pH 值對(duì)傳感器的ECL 信號(hào)的影響如圖4C 所示，隨著檢測(cè)池溶液pH 值逐漸升高，ECL 信號(hào)先上升，在pH ＞7.0 后下降。因此，選取pH=7.0 的PBS 緩沖溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。酶的催化反應(yīng)時(shí)間也是影響電極ECL 信號(hào)的重要因素，如圖4D 所示，在5～25 min 的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著酶催化反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，ECL 信號(hào)不斷增大，這是因?yàn)榇呋磻?yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，CHOx 催化CHOL 生成的H2O2越多；但是，酶催化反應(yīng)時(shí)間超過25 min 后，ECL 信號(hào)反而減弱，這可能是一部分H2O2分解所致。綜合考慮響應(yīng)信號(hào)和檢測(cè)時(shí)效，選擇25 min 作為CHOx 最佳催化反應(yīng)時(shí)間。

圖4 （A）CHOx 濃度、（B）催化反應(yīng)溫度、（C）pH 值和（D）催化反應(yīng)時(shí)間對(duì)傳感器ECL 信號(hào)強(qiáng)度的影響；檢測(cè)池：1 mmol/L CHOL 溶液;信號(hào)池：1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.4 Effects of (A) concentration of CHOx,(B) temperature,(C) pH value and (D) incubation time on ECL signal intensity.1 mmol/L cholesterol in sensing cell;1mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol TPrA in reporting cell

2.3 傳感器的分析性能

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的CHOL 溶液進(jìn)行了檢測(cè)。隨著檢測(cè)池中CHOL 溶液濃度增大，BPE 信號(hào)池ECL 信號(hào)逐漸增大（圖5A）。以ECL 信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、CHOL 濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，如圖5B 所示，ECL 強(qiáng)度與CHOL 濃度（1 μmol/L～10 mmol/L）的對(duì)數(shù)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為I=2372.4×lg[C/（μmol/L）]+1081.4（R2=0.998），檢出限為0.13 μmol/L（S/N=3）。與文獻(xiàn)報(bào)道的其它CHOL 檢測(cè)方法相比（表1），本方法檢測(cè)時(shí)間短、檢出限低、線性范圍寬。本方法采用的BPE 傳感信號(hào)分離模式有效避免了發(fā)光試劑與待檢測(cè)溶液的干擾，可獲得靈敏且穩(wěn)定的檢測(cè)信號(hào)。

表1 不同CHOL檢測(cè)方法性能比較Table 1 Comparison of analytical performances of different CHOL assays

圖5 （A）傳感器對(duì)不同濃度CHOL 的ECL 響應(yīng)信號(hào)；（B）ECL 信號(hào)強(qiáng)度隨CHOL 濃度對(duì)數(shù)值變化的線性關(guān)系曲線。檢測(cè)池CHOL 濃度（a →l）：1、5、10、25、50、100、250、500、1000 μmol/L，2.5、5、10 mmol/L；信號(hào)池：1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.5 (A) ECL response of different concentrations of CHOL;(B) Linear relationship between ECL intensity and logarithmic concentrations of CHOL.Concentrations of CHOL (a →l) are 1,5,10,25,50,100,250,500,1000 μmol/L,2.5,5,10 mmol/L,respectively.1 mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol TPrA in reporting cell

2.4 傳感器的抗干擾性、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

為了考察此BPE-ECL 酶生物傳感器的選擇性，在檢測(cè)池中加入10 mmol/L 的AA、UA、CA、DA、Glu 和VE 等潛在干擾物，并與1 mmol/L CHOL 溶液的陽極ECL 信號(hào)進(jìn)行對(duì)比。由圖6A 可見，此傳感器對(duì)CHOL 溶液具有良好的ECL 響應(yīng)，而對(duì)上述干擾物無明顯ECL 響應(yīng)，說明此傳感器對(duì)CHOL 具有良好的選擇性。在檢測(cè)池分別加入1、100 和1000 μmol/L CHOL 溶液，進(jìn)行3 次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果如圖6B 所示，各濃度下ECL 響應(yīng)信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.2%、1.4%和1.8%，說明傳感器具有良好的重現(xiàn)性。如圖6C 所示，在檢測(cè)池中加入100 μmol/L CHOL 溶液，8 次連續(xù)掃描的ECL 信號(hào)的RSD 為2.3%，表明此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

圖6 傳感器的（A）選擇性（CHOL 濃度為1 mmol/L，干擾物濃度為10 mmol/L）、（B）重現(xiàn)性（CHOL 濃度分別為1、100 和1000 μmol/L）和（C）穩(wěn)定性（100 μmol/L CHOL）實(shí)驗(yàn)結(jié)果，信號(hào)池中均為1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.6 (A) Selectivity (1 mmol/L CHOL,and 10 mmol/L each interferent),(B) reproducibility;(1,100 and 1000 μmol/L CHOL,respectively)and(C)stability(100 μmol/L CHOL)of the sensor.All reporting cells contain 1 mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol/L TPrA

2.5 實(shí)際樣品分析

利用此傳感器對(duì)3 個(gè)人血清樣本中的CHOL 濃度進(jìn)行測(cè)試，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，評(píng)估此傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)性能，結(jié)果如表2 所示，加標(biāo)回收率在98.4%～104.0%之間，RSD ＜4.7%。將此傳感器檢測(cè)結(jié)果與HPLC 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，二者無明顯差異，表明此傳感器可準(zhǔn)確測(cè)定復(fù)雜血清樣品中的CHOL 濃度。

表2 人血清樣品中CHOL的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of CHOL in human serum samples

3 結(jié)論

基于BPE-ECL 技術(shù)構(gòu)建了一種酶?jìng)鞲衅脚_(tái)并用于CHOL 的檢測(cè)。構(gòu)筑了空間獨(dú)立的傳感檢測(cè)池和信號(hào)收集池，將CHOx 固定在BPE 陰極端，催化CHOL 分解，由產(chǎn)生的H2O2在陰極端的還原過程誘導(dǎo)陽極端的Ru（bpy）32+/TPrA 發(fā)生氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生ECL 檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同濃度CHOL 的檢測(cè)。將此傳感器用于人血清中CHOL 的檢測(cè)，表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確性和抗基質(zhì)干擾能力。這種傳感/信號(hào)分離的模式避免了樣本基質(zhì)對(duì)發(fā)光信號(hào)的直接干擾，在生物傳感檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。