水凝膠在人造細(xì)胞體系中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李書(shū)彬 董明東 韓曉軍*

1（哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001）

2（奧胡斯大學(xué)納米科學(xué)交叉研究中心，丹麥DK-8000）

生命起源的過(guò)程紛繁復(fù)雜，人類(lèi)至今尚未完全理解細(xì)胞的產(chǎn)生、結(jié)構(gòu)的變化以及功能的形成。合成生物學(xué)提供了認(rèn)識(shí)生命的起源及運(yùn)行機(jī)制的方法[1-4]。通過(guò)構(gòu)建人造細(xì)胞能夠簡(jiǎn)化生命系統(tǒng)中的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，更好地模擬細(xì)胞的行為[5-10]。構(gòu)建的人造細(xì)胞通常需要具備區(qū)室化、分裂和代謝等部分或全部生命特征，人造細(xì)胞的構(gòu)建基元包括磷脂[11-16]、聚合物[17]和聚電解質(zhì)[18]等。通過(guò)外加刺激或在人造細(xì)胞中封裝具有特定功能的酶，這些人造細(xì)胞表現(xiàn)出簡(jiǎn)單的細(xì)胞行為。為了使人造細(xì)胞能夠執(zhí)行更復(fù)雜的功能，在體系中引入其它功能性材料尤為重要。

水凝膠是一種具有多種官能團(tuán)的高度含水的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)改變官能團(tuán)的種類(lèi)和數(shù)量調(diào)節(jié)水凝膠的特性和含水量[19-22]。這種特性和結(jié)構(gòu)可賦予人造細(xì)胞特定的功能。水凝膠的組成成分可以分為天然成分和合成成分，雖然天然成分更具生物相容性，但合成成分能對(duì)官能團(tuán)種類(lèi)和數(shù)量進(jìn)行精確定制，因而在人造細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用更為突出。將水凝膠應(yīng)用于人造細(xì)胞領(lǐng)域不僅能使人造細(xì)胞更具真實(shí)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，在藥物控釋和組織工程方面也顯現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。目前，關(guān)于水凝膠的綜述主要集中于水凝膠結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)及制備方法等方面，有關(guān)水凝膠在人造細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用的綜述較少。隨著人造細(xì)胞領(lǐng)域研究的快速發(fā)展和對(duì)多功能構(gòu)件的需求，對(duì)水凝膠在人造細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)歸納尤為重要，可為今后的研究提供理論參考。本文綜述了近十年來(lái)應(yīng)用于人造細(xì)胞研究和應(yīng)用中的水凝膠組成及水凝膠的加工方法，重點(diǎn)闡述了其在細(xì)胞結(jié)構(gòu)模擬、藥物控釋和組織工程方面的應(yīng)用，并探討了該領(lǐng)域目前存在的問(wèn)題及未來(lái)的研究方向。

1 用于人造細(xì)胞領(lǐng)域的水凝膠成分

1.1 天然成分

用于人造細(xì)胞領(lǐng)域的水凝膠的天然成分主要為天然聚合物（藻酸鹽、葡聚糖和瓊脂糖）。天然聚合物具有高生物相容性、環(huán)境友好性、可降解性和可持續(xù)性等優(yōu)點(diǎn)，然而其中所含有的活性官能團(tuán)較少，無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)水凝膠功能的調(diào)節(jié)。對(duì)天然聚合物進(jìn)行修飾和改性能夠使其在保留自身優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，可以滿(mǎn)足制備功能多樣的水凝膠的要求。

1.1.1 海藻酸

海藻酸是從褐藻類(lèi)的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇后的副產(chǎn)物，其分子由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按（1→4）鍵連接而成[23]。海藻酸在水溶液中表現(xiàn)出聚陰離子行為，因而可在其溶液中加入Ca2+等陽(yáng)離子促使水凝膠生成[24]。

海藻酸水凝膠通常被封裝在人造細(xì)胞內(nèi)部模擬細(xì)胞結(jié)構(gòu)，或?qū)⑷嗽旒?xì)胞包裹在水凝膠內(nèi)作為細(xì)胞外基質(zhì)[25-27]。1995 年，Monshipouri 等[25]首次利用脂質(zhì)體擠出法將海藻酸鈉溶液包封到人造細(xì)胞中，外部溶液中的Ca2+進(jìn)入人造細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行交聯(lián)，最終形成包封海藻酸水凝膠的人造細(xì)胞，開(kāi)拓了海藻酸水凝膠在人造細(xì)胞領(lǐng)域中的應(yīng)用。此后的研究多集中于對(duì)包封海藻酸溶液方法的改進(jìn)和對(duì)Ca2+進(jìn)入人造細(xì)胞方式的調(diào)控[28-30]。

海藻酸水凝膠具有交聯(lián)速度快和性能優(yōu)異等諸多優(yōu)點(diǎn)，但其水溶液粘度較高，給封裝造成一定困難；并且海藻酸含有的活性官能團(tuán)較少，無(wú)法賦予水凝膠更多的智能性。對(duì)海藻酸進(jìn)行修飾改性，引入更多種類(lèi)的活性官能團(tuán)，能使海藻酸水凝膠功能更加豐富。

1.1.2 葡聚糖

葡聚糖是以葡萄糖為單糖組成的同型多糖，具有良好的生物相容性，常用于水凝膠的制備[31-33]。根據(jù)交聯(lián)方式的不同，水凝膠分為由氫鍵、靜電作用、親疏水作用和主-客體相互作用等非共價(jià)鍵方式進(jìn)行交聯(lián)的物理交聯(lián)和通過(guò)自由基聚合和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)等形成的共價(jià)鍵交聯(lián)的化學(xué)交聯(lián)。葡聚糖具有良好的水溶性，但單獨(dú)的天然葡聚糖很難形成水凝膠，需要加入其它聚合物形成氫鍵進(jìn)行物理交聯(lián)，或?qū)ζ暇厶沁M(jìn)行改性，利用改性官能團(tuán)的特性實(shí)現(xiàn)化學(xué)交聯(lián)[34-36]。葡聚糖水凝膠多利用人造細(xì)胞作為模板，以實(shí)現(xiàn)由宏觀尺度的水凝膠向微觀尺度微凝膠顆粒的轉(zhuǎn)變。乳液法是最常用的將葡聚糖衍生物溶液包封到人造細(xì)胞中的方法，F(xiàn)ranssen 等[37]利用乳液法實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡聚糖水凝膠的包封，之后利用Triton X 100等表面活性劑破壞人造細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，獲得人造細(xì)胞大小的微凝膠顆粒，對(duì)模型蛋白表現(xiàn)出良好的控釋能力。此外，具備各種響應(yīng)能力的葡聚糖衍生物的合成也使葡聚糖水凝膠的交聯(lián)方式更加豐富多樣。葡聚糖基水凝膠通常具有穩(wěn)定性和高生物相容性，但需要對(duì)葡聚糖進(jìn)行修飾改性，以滿(mǎn)足不同的用途需要。這種修飾或改性會(huì)增加操作的復(fù)雜性，并且引入的化學(xué)成分對(duì)生物相容性的影響還有待考察。

1.1.3 瓊脂糖

瓊脂糖是一種電中性聚合物，溫度達(dá)到90 ℃以上即可溶解，溫度下降到35～40 ℃時(shí)形成凝膠，這是其具有多用途的基礎(chǔ)。瓊脂糖水凝膠因具有良好的穩(wěn)定性、生物相容性和成膠性已廣泛應(yīng)用于食品、紡織、化工和生物分離等領(lǐng)域。然而，瓊脂糖在人造細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于探索的初級(jí)階段。2017 年，Bayoumi 等[38]利用模具構(gòu)建了瓊脂糖凝膠，并將人造細(xì)胞封裝到凝膠內(nèi)部。水凝膠不僅為人造細(xì)胞提供了溫和的外界環(huán)境，還有助于人造細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，因而成為構(gòu)建人造細(xì)胞外基質(zhì)的理想材料。由于瓊脂糖特殊的成膠模式，對(duì)包封在內(nèi)的人造細(xì)胞的穩(wěn)定性提出了更高的要求。

1.2 合成成分

制備水凝膠的材料主要為經(jīng)過(guò)化學(xué)聚合反應(yīng)得到的高分子聚合物。用于人造細(xì)胞領(lǐng)域的合成高分子聚合物主要包括聚（N-異丙基丙烯酰胺）、聚乙二醇衍生物、聚丙烯酸和聚縮水甘油等。在制備過(guò)程中能夠通過(guò)修飾調(diào)節(jié)聚合物的官能團(tuán)種類(lèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)水凝膠性能的調(diào)控。然而，水凝膠合成過(guò)程中通常需要加入對(duì)人體有害的催化劑，并且制得的聚合物生物相容性和降解性較差，極易損害環(huán)境，不利于生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展。因此，需要對(duì)水凝膠的合成過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)，或選擇更高生物相容性和環(huán)境友好性的聚合物。

1.2.1 聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)

PNIPAM 是典型的溫度響應(yīng)聚合物，當(dāng)環(huán)境溫度低于臨界相轉(zhuǎn)變溫度（LCST）時(shí)，PNIPAM 鏈處于伸展構(gòu)象[39]。當(dāng)溫度高于其LCST 時(shí)，PNIPAM 鏈轉(zhuǎn)變?yōu)榫砬鸂顟B(tài)。這種構(gòu)象的轉(zhuǎn)變使PNIPAM 水凝膠可在溫度的調(diào)控下展現(xiàn)出孔隙率、尺寸和折光率等性質(zhì)的變化，在生物醫(yī)學(xué)、傳感器制備和人造細(xì)胞領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[40-41]。

2002 年，Kazakov 等[40]首先將N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）單體及光引發(fā)劑包封到人造細(xì)胞中，外加紫外光使聚合物單體在人造細(xì)胞內(nèi)聚合形成水凝膠[42]。獲得的水凝膠在溫度調(diào)控下表現(xiàn)出尺寸變化對(duì)內(nèi)容物的有效控釋?zhuān)瑸槿嗽旒?xì)胞作為智能藥物載體提供了參考。

PNIPAM 基水凝膠對(duì)智能人造細(xì)胞的構(gòu)建提供了思路，然而交聯(lián)過(guò)程加入的小分子交聯(lián)劑或引發(fā)劑具有一定的毒性且不易被去除，使其生物相容性不佳。另外，紫外光的照射可能影響負(fù)載在水凝膠中的酶的活性，降低了反應(yīng)效率。因此，需要對(duì)PNIPAM 基水凝膠聚合過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)或選用對(duì)紫外光不敏感的酶進(jìn)行研究。

1.2.2 聚乙二醇(PEG)衍生物

PEG 具有良好的生物相容性和親水性，通過(guò)對(duì)PEG 進(jìn)行改性修飾可使獲得的PEG 衍生物具有更多優(yōu)異性能[43]。基于PEG 衍生物制備的水凝膠能夠通過(guò)簡(jiǎn)單改變PEG 的分子量實(shí)現(xiàn)對(duì)水凝膠機(jī)械性能的調(diào)控。目前，已有多種基于PEG 衍生物構(gòu)建的水凝膠的研究報(bào)道。以乙二醇二甲基丙烯酸酯為例，2009 年，An 等[44]利用脂質(zhì)體擠出法制備了包封聚乙二醇二甲基丙烯酸酯水凝膠的人造細(xì)胞。其中，水凝膠中負(fù)載了β-半乳糖苷酶，在溶液中加入底物β-D-吡喃半乳糖苷后，底物能夠在酶的催化下產(chǎn)生紅色熒光產(chǎn)物。PEG 衍生物基水凝膠價(jià)格低廉且易于制備，常被用于人造細(xì)胞或生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但是，改性導(dǎo)致的生物相容性變化通常被忽略，容易產(chǎn)生生物毒性或造成環(huán)境污染。因此，需要對(duì)衍生物的生物相容性和環(huán)境友好性進(jìn)行探究。

1.2.3 聚丙烯酸(PAA)

PAA 單體因其分子結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，易與多種合成高分子、天然高分子和無(wú)機(jī)納米材料交聯(lián)制備水凝膠。由單體聚合形成的PAA 水凝膠具有良好的吸附/溶脹性能。因此，PAA 水凝膠通常被包封在人造細(xì)胞內(nèi)部，依賴(lài)其良好的吸附性能實(shí)現(xiàn)對(duì)疏水藥物的負(fù)載。2009 年，Tiwari 等[45]利用反相蒸發(fā)法制備了封裝PAA 水凝膠的人造細(xì)胞，該水凝膠能夠在不同pH 值下表現(xiàn)出對(duì)瘧疾抗原Pfs25 的不同釋放行為，為藥物遞送載體的構(gòu)建提供了新的方法。

封裝于人造細(xì)胞中的PAA 水凝膠具有結(jié)構(gòu)可控、性能穩(wěn)定和壽命長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。但是，單純的PAA 水凝膠功能單一，無(wú)法滿(mǎn)足水凝膠智能化的要求。因此，需要在水凝膠中引入具備其它功能的結(jié)構(gòu)模塊，以賦予PAA 水凝膠更多的響應(yīng)性和智能性。

1.2.4 聚縮水甘油(PGL)

PGL 具有良好的水溶性和生物相容性。聚合物鏈上的重復(fù)單元中含有反應(yīng)性羥基，有利于對(duì)其進(jìn)行修飾和改性。目前，已經(jīng)獲得了包括線(xiàn)性[46]、樹(shù)枝狀[47]和超支化[48]等多種PGL 衍生結(jié)構(gòu)。相較于傳統(tǒng)的線(xiàn)性聚合物結(jié)構(gòu)，樹(shù)枝狀和超支化的PGL 聚合物水凝膠在人造細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出對(duì)負(fù)載物更精確的控釋能力，這可能由于其具有相較傳統(tǒng)水凝膠更致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[49]。最近，Lockhart 等[49]制備了包封PGL 水凝膠的人造細(xì)胞，并在生理?xiàng)l件下研究了模型藥物的釋放行為，研究表明，PGL 水凝膠的存在對(duì)藥物的控釋起到了決定性作用。

雖然目前已制備出許多具有優(yōu)異響應(yīng)性和智能性的PGL 水凝膠，然而其應(yīng)用于人造細(xì)胞領(lǐng)域的研究尚處于起步階段，賦予PGL 水凝膠更多性能或利用PGL 水凝膠增強(qiáng)人造細(xì)胞的智能性顯得尤為重要。用于人造細(xì)胞體系的多種水凝膠成膠組分及其優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 用于人造細(xì)胞體系的各水凝膠成膠組分Table 1 Comparison of gelling components of various hydrogels used in artificial cell system

2 水凝膠材料加工方法

運(yùn)用不同的加工方法可制備出性能各異的水凝膠材料。常見(jiàn)的水凝膠材料加工方法包括靜電紡絲、3D 打印、冷凍鑄造和微流控技術(shù)等。

2.1 靜電紡絲

自1902 年Cooley[55]提出靜電紡絲技術(shù)以來(lái)，由于其制備的水凝膠材料具有高孔隙率、優(yōu)越的孔隙互連性及穩(wěn)定性，已成為研究熱點(diǎn)。靜電紡絲裝置通常由注射泵、注射器、注射針頭和金屬收集器組成。在電場(chǎng)作用下，注射針頭處的溶液由球形變?yōu)閳A錐形，并逐漸延展得到纖維細(xì)絲，進(jìn)而獲得水凝膠材料。該方法具有操作簡(jiǎn)便、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于骨骼肌、皮膚和血管等組織工程支架的制備。然而，由于注射針頭孔徑微小，極易導(dǎo)致靜電紡絲過(guò)程中針頭堵塞；同時(shí)，靜電紡絲形成的纖維細(xì)絲很難控制取向，不利于大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。因此，需通過(guò)改良針頭或相關(guān)設(shè)備進(jìn)行方法優(yōu)化。

2.2 3D打印

1986 年，Charles[56]開(kāi)發(fā)了3D 打印技術(shù)，主要通過(guò)計(jì)算機(jī)控制打印機(jī)對(duì)材料進(jìn)行逐層加工，通過(guò)更換打印的原料能夠制備出性能各異的水凝膠材料?；谟?jì)算機(jī)構(gòu)建的模型，采用3D 打印可構(gòu)建許多精密的結(jié)構(gòu)，特別在組織工程方面，目前已構(gòu)建出肝臟、心臟和手掌等多種組織或器官，對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究起到了極大的推動(dòng)作用。這些材料通常對(duì)原料的生物相容性提出了極高的要求，通過(guò)在前體溶液中加入活細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞在水凝膠材料中的直接封裝，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程。但是，3D 打印技術(shù)通常需要昂貴的設(shè)備，成本很高，這在很大程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用及推廣。

2.3 冷凍鑄造

冷凍鑄造也稱(chēng)冰模板，自2006 年被提出后，目前已成為水凝膠材料加工的一種有效方法[57]。冷凍鑄造加工過(guò)程通常先將凝膠固化，再減壓使溶劑升華而形成多孔的凝膠結(jié)構(gòu)。該方法十分簡(jiǎn)便，并且形成的水凝膠具有較大的孔隙率，這種大孔隙的互通結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的遷移和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，因而在組織工程領(lǐng)域得到了極大的關(guān)注。然而，由于在加工過(guò)程中需要冷凍加壓等操作，因此不利于生物活性成分的包封，并且對(duì)凝膠原料的穩(wěn)定性也提出了很高的要求。

2.4 微流控技術(shù)

微流控技術(shù)是一種利用微結(jié)構(gòu)對(duì)微量液體進(jìn)行操作的手段。利用結(jié)構(gòu)精密的微流控芯片可實(shí)現(xiàn)對(duì)水凝膠尺寸結(jié)構(gòu)的精確控制。水凝膠形成的一般過(guò)程為先將前體溶液在微流控芯片中形成微液滴，然后通過(guò)物理或化學(xué)交聯(lián)使其固化形成水凝膠微球。通過(guò)該方法形成的水凝膠尺寸很小，能夠很好地充當(dāng)微反應(yīng)器或模擬微小的組織結(jié)構(gòu)的功能，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域具有重要的意義[58]。但是，微流控芯片制備過(guò)程復(fù)雜，設(shè)備昂貴，不利于該技術(shù)的普及。

3 水凝膠在人造細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 細(xì)胞結(jié)構(gòu)模擬

水凝膠親水的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠使人造細(xì)胞更接近真實(shí)的生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的模擬，主要是將水凝膠封裝在人造細(xì)胞內(nèi)以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的模擬。

3.1.1 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)模擬

細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)中均質(zhì)而半透明的膠體部分，區(qū)別于單純的水溶液，基質(zhì)具有一定粘度并包含細(xì)胞生命活動(dòng)所需的反應(yīng)底物以執(zhí)行必要的生化反應(yīng)[59-61]。將水凝膠封裝到人造細(xì)胞中極好地模擬了基質(zhì)的物理狀態(tài)，特別是處于溶膠狀態(tài)的水凝膠，既能使人造細(xì)胞中維持一定粘度，也能負(fù)載多種酶及反應(yīng)物[62-63]。

對(duì)于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的模擬，通常選用具有環(huán)境響應(yīng)能力的水凝膠以實(shí)現(xiàn)水凝膠在人造細(xì)胞內(nèi)部溶膠-凝膠態(tài)的可控轉(zhuǎn)變。瓊脂糖和PNIPAM 作為典型的溫度響應(yīng)水凝膠組分被廣泛用于細(xì)胞基質(zhì)模擬。這些研究通常通過(guò)顯微注射法將前體溶液包封在人造細(xì)胞中。顯微注射法是一種十分精密的技術(shù)，常用于轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，能將外源基因片段通過(guò)微量注射針直接注射到細(xì)胞中使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。由于顯微注射法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)注射溶液組分的精確控制，因而在人造細(xì)胞領(lǐng)域也引起了廣泛關(guān)注。包封在人造細(xì)胞中的前體溶液能夠通過(guò)改變溫度實(shí)現(xiàn)對(duì)人造細(xì)胞內(nèi)粘度的控制[64]。2005 年，Jesorka 等[65]利用顯微注射法將PNIPAM 溶液注射到人造細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)改變環(huán)境的溫度，人造細(xì)胞內(nèi)部表現(xiàn)出不同的粘度變化。當(dāng)環(huán)境溫度為20 ℃時(shí)呈流動(dòng)態(tài)（圖1A 左圖），當(dāng)溫度上升至27 ℃時(shí)為凝膠態(tài)（圖1A 右圖）。人造細(xì)胞內(nèi)的粘度的變化能夠直觀地通過(guò)人造細(xì)胞內(nèi)包封微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡顯示，在人造細(xì)胞內(nèi)部處于流動(dòng)態(tài)時(shí)，包封微粒的運(yùn)動(dòng)范圍很大（圖1B 藍(lán)線(xiàn)）；凝膠態(tài)時(shí)，包封微粒的的運(yùn)動(dòng)范圍極?。▓D1B 紅線(xiàn)）[66]。

圖1 凝膠對(duì)細(xì)胞溶膠的模擬：（A）環(huán)境溫度為20 ℃和27 ℃時(shí)囊泡內(nèi)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變圖像[65]；（B）溶膠狀態(tài)下500 s 內(nèi)人造細(xì)胞內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)軌跡（藍(lán)線(xiàn)）以及凝膠狀態(tài)下500 s 內(nèi)人造細(xì)胞內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)軌跡（紅線(xiàn)）[66]Fig.1 Simulation of gel on cytosol:(A)Image of sol-gel transition in the vesicle at 20 ℃and 27 ℃[65];(B)The trajectory of particles in the artificial cell within 500 s in the sol state(blue line),and the trajectory of particles in the artificial cell within 500 s in the gel state (red line)[66]

3.1.2 細(xì)胞骨架

細(xì)胞骨架是細(xì)胞維持形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，在承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)有序性方面起到了不可或缺的作用[67-68]。區(qū)別于肌動(dòng)蛋白構(gòu)建的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，水凝膠構(gòu)建的人造細(xì)胞骨架無(wú)需復(fù)雜的蛋白提取流程，被廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)領(lǐng)域[69]。

水凝膠模擬細(xì)胞骨架主要特點(diǎn)在于其能夠使人造細(xì)胞抵抗外部機(jī)械應(yīng)力。2009 年，Gaspard 等[70]將NIPAM 單體和交聯(lián)劑封裝到人造細(xì)胞中，外加紫外光照射形成水凝膠。形成的水凝膠能夠模擬細(xì)胞骨架，使人造細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力下表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性[71]。通過(guò)改變水凝膠的交聯(lián)密度還能夠調(diào)控人造細(xì)胞的機(jī)械敏感性。

3.1.3 細(xì)胞器

細(xì)胞器是細(xì)胞質(zhì)中具有特定形態(tài)和功能的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建空間分隔的微區(qū)室是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器模擬的基礎(chǔ)。負(fù)載酶或反應(yīng)物的水凝膠微粒常被用于人造細(xì)胞中細(xì)胞器的模擬[72-74]。

微凝膠構(gòu)建人造細(xì)胞器的基本過(guò)程為：首先制備功能化微凝膠，再將微凝膠封裝到人造細(xì)胞內(nèi)部作為人造細(xì)胞器，模擬細(xì)胞器之間或細(xì)胞器與細(xì)胞質(zhì)之間的通訊過(guò)程。這些通訊過(guò)程通常基于無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[75]。Thiele 等[76]利用PEG 衍生物水凝膠實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞器與細(xì)胞質(zhì)之間的通訊過(guò)程模擬。將負(fù)載DNA的微凝膠封裝到油包水液滴中，構(gòu)建含有水凝膠細(xì)胞器的人造細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖2A）。微凝膠能夠與液滴中包封的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯，實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)。類(lèi)似地，Aufinger 等[77]將含有不同DNA 的瓊脂糖微凝膠封裝在人造細(xì)胞中，利用同時(shí)包封的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程在不同微凝膠細(xì)胞器中的空間分離。如圖2B 所示，青色和黃色的微凝膠類(lèi)細(xì)胞器中含有不同的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA 分別被含有不同互補(bǔ)鏈的紅色和綠色微凝膠的類(lèi)細(xì)胞器捕獲，表現(xiàn)為微凝膠內(nèi)部熒光隨時(shí)間的推移而增強(qiáng)，為之后的翻譯過(guò)程做準(zhǔn)備。

圖2 凝膠對(duì)細(xì)胞器的模擬：（A）乳液法制備含有水凝膠細(xì)胞器的人造細(xì)胞結(jié)構(gòu)[76]；（B）人造細(xì)胞中凝膠細(xì)胞器間的信號(hào)傳遞導(dǎo)致的熒光隨時(shí)間的變化[77]Fig.2 Preparation of gel artificial organelles in artificial cells:(A) Artificial cell structure containing hydrogel organelles prepared by emulsion method[76];(B) Time dependent fluorescence caused by signal transduction between gel organelles in artificial cells[77]

3.2 藥物控釋

水凝膠的環(huán)境響應(yīng)能力是其用于藥物緩釋的基礎(chǔ)。依據(jù)成膠因子的性質(zhì)可使水凝膠對(duì)pH、生物分子、溫度、光和磁場(chǎng)等變化響應(yīng)，促進(jìn)或阻礙水凝膠中負(fù)載藥物的釋放，因而在生物醫(yī)學(xué)以及癌癥治療等領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注。

3.2.1 pH響應(yīng)的藥物控釋

在藥物控釋方面最常見(jiàn)的是基于pH 響應(yīng)水凝膠構(gòu)建的人造細(xì)胞。環(huán)境酸堿度的改變引起凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化，表現(xiàn)為凝膠網(wǎng)絡(luò)的膨脹或收縮從而引起藥物的控釋。pH 響應(yīng)的水凝膠通常為聚電解質(zhì)水凝膠[78]。2006 年，Tan 等[79]制備了由PEG 衍生物包被的聚電解質(zhì)水凝膠，此水凝膠由聚甲基丙烯酸（PMAA）和聚（2-（二乙氨基）乙基甲基丙烯酸酯）（PDEA）組成。DEA 片段可以在低pH 值下質(zhì)子化，賦予該片段正電荷，而MAA 單元在高pH 值下帶負(fù)電荷。因此，凝膠在高pH 值和低pH 值下都表現(xiàn)出明顯的溶脹，使水凝膠能夠通過(guò)響應(yīng)pH 值實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的控釋。

3.2.2 溫度響應(yīng)

溫度響應(yīng)水凝膠常用于磷脂構(gòu)建的人造細(xì)胞，使其具備有效的藥物緩釋能力。因?yàn)榱字瑯?gòu)建的人造細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂組分也能響應(yīng)溫度變化。一方面，可將負(fù)載藥物的人造細(xì)胞置于溫敏水凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)人造細(xì)胞與水凝膠對(duì)藥物的協(xié)同緩釋[80]；另外，還可將人造細(xì)胞附著于微凝膠表面。2010 年，Mackinnon 等[81]制備了PNIPAM 和丙烯酸（AA）交聯(lián)的微凝膠，其中，PNIPAM 多分布在凝膠的核心位置，而AA 分布在水凝膠外部，外部的AA 促進(jìn)了磷脂囊泡在微凝膠表面的結(jié)合。當(dāng)環(huán)境溫度高于32 ℃時(shí)，溫敏性微凝膠收縮，使結(jié)合在表面的磷脂囊泡發(fā)生形變破裂，從而釋放囊泡的內(nèi)容物（圖3A）。

圖3 （A）溫度改變導(dǎo)致的溫度響應(yīng)水凝膠系統(tǒng)中藥物釋放[81]；（B）包封溫敏水凝膠的人造細(xì)胞響應(yīng)近紅外光的藥物釋放機(jī)理[82]；（C）分子響應(yīng)水凝膠響應(yīng)葡聚糖/H2O2 分子并釋放負(fù)載的分子[83]Fig.3 (A)Drug release in temperature responsive hydrogel system caused by temperature change [81];(B)Drug release mechanism of artificial cells encapsulated with thermosensitive hydrogels in response to near-infrared light[82];(C) Molecular response hydrogel responds to dextran/H2O2 molecule and releases encapsulated molecules[83]

3.2.3 光響應(yīng)

紅外光刺激在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域十分普遍。對(duì)于水凝膠構(gòu)建的人造細(xì)胞系統(tǒng)而言，通常利用水凝膠中包封的光熱劑將光響應(yīng)和溫度響應(yīng)結(jié)合使用。光熱劑能夠吸收近紅外光，并以熱能的形式傳遞給水凝膠材料，引發(fā)溫敏水凝膠中藥物的釋放。Yu 等[82]制備了由PEG 修飾的磷脂囊泡封裝的P（NIPAM-co-AAM）溫敏微凝膠，水凝膠中負(fù)載了光熱劑吲哚菁綠（ICG）和藥物鹽酸阿霉素（DOX）。ICG 能夠響應(yīng)近紅外光刺激，使微凝膠溶脹，導(dǎo)致磷脂囊泡破裂，促進(jìn)了負(fù)載的DOX 的釋放（圖3B）。

3.2.4 分子響應(yīng)

分子響應(yīng)水凝膠已逐漸引起關(guān)注，特別是生物分子響應(yīng)水凝膠，能夠識(shí)別生物體內(nèi)特定的分子，使載體對(duì)于生理環(huán)境的感知能力顯著提高。葡萄糖是常見(jiàn)的生物模型分子，針對(duì)葡萄糖已設(shè)計(jì)并制備了包括針對(duì)糖尿病治療的多種水凝膠材料。2019 年，Li 等[83]制備了由PEG 為外殼的雙響應(yīng)的水凝膠藥物載體。水凝膠以四硫醇官能季戊四醇四（3-巰基丙酸酯）為交聯(lián)劑，雙官能單體丙烯?；?-（5-（羥甲基）-5-甲基-1，3，2-二氧雜硼-2-基）苯基）甲醇（AHMDM）為雙響應(yīng)基團(tuán)。一方面，HMDM 的環(huán)狀苯硼酸酯可與葡萄糖反應(yīng)，導(dǎo)致交聯(lián)斷裂;另一方面，HMDM 的環(huán)狀苯硼酸酯也可與H2O2反應(yīng)。因此，當(dāng)環(huán)境中葡萄糖和H2O2量增多時(shí)，將引起水凝膠負(fù)載的胰島素釋放（圖3C）。

3.3 組織工程

水凝膠在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性方面類(lèi)似細(xì)胞外基質(zhì)，不僅能夠維持細(xì)胞的生命活動(dòng)，還具有很好的負(fù)載能力，因而成為組織工程支架的理想模型。目前，水凝膠支架多用于負(fù)載活細(xì)胞，然而負(fù)載活細(xì)胞的水凝膠支架為防止細(xì)胞死亡和活性下降，對(duì)實(shí)驗(yàn)及存放提出了十分嚴(yán)苛的條件，利用水凝膠作為支架負(fù)載人造細(xì)胞無(wú)需嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)條件，并且人造細(xì)胞的引入能夠顯著提高水凝膠的功能性，因而成為研究熱點(diǎn)。人造細(xì)胞的引入使水凝膠支架具有可注射性、增強(qiáng)的機(jī)械性能、表面潤(rùn)滑性和信號(hào)傳遞性等優(yōu)勢(shì)。

3.3.1 可注射性

可注射性水凝膠是一種可在體外注射、體內(nèi)成膠的水凝膠材料。由于具有原位成膠的特性，注射水凝膠能夠填充各種不規(guī)則的創(chuàng)口，支架中負(fù)載的藥物或生物活性分子能促進(jìn)傷口的快速愈合。注射水凝膠的凝膠化可以通過(guò)各種刺激誘導(dǎo)，包括光、溫度以及pH 值變化。

由于生理環(huán)境pH 值的穩(wěn)定性和光在體內(nèi)的穿透深度極為有限，為解決此問(wèn)題，研究者制備了溫度響應(yīng)的可注射水凝膠支架。2015 年，Ren 等[84]開(kāi)發(fā)了一種用于組織工程的熱響應(yīng)性可注射水凝膠支架，將包封辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的熱響應(yīng)脂質(zhì)體懸浮在透明質(zhì)酸-酪胺（HA-Tyr）綴合物和H2O2溶液中。在室溫下，HRP 通過(guò)脂質(zhì)膜與HA-Tyr 綴合物分離，因此前體溶液保持為液體并可注射。注射后，脂質(zhì)經(jīng)歷相變，顯著增加了膜滲透性，并導(dǎo)致HRP 的釋放和Tyr 部分與H2O2的氧化偶聯(lián)，進(jìn)而形成水凝膠支架。

3.3.2 機(jī)械性能增強(qiáng)

機(jī)械性能是水凝膠支架的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。優(yōu)良的機(jī)械性能對(duì)于延長(zhǎng)支架的使用壽命，減輕患者反復(fù)手術(shù)的痛苦十分重要。水凝膠的機(jī)械性能能夠通過(guò)調(diào)節(jié)水凝膠內(nèi)部的成膠組分、相互作用力和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行調(diào)節(jié)。在水凝膠成膠溶液中混合人造細(xì)胞也可起到很好的增強(qiáng)機(jī)械性能的效果。

Cheng 等[85]在明膠衍生物溶液中混入磷脂囊泡，利用囊泡和水凝膠網(wǎng)絡(luò)之間的氫鍵交聯(lián)制備了機(jī)械增強(qiáng)型水凝膠，對(duì)復(fù)合水凝膠進(jìn)行了壓縮、拉伸、扭轉(zhuǎn)和彈性等測(cè)試，結(jié)果表明，相較于單純的水凝膠，含有磷脂囊泡的水凝膠壓縮和拉伸百分比更高，顯示出十分優(yōu)越的機(jī)械性能（圖4A）。

圖4 （A）水凝膠與人造細(xì)胞間的氫鍵相互作用使材料壓縮（A1）和拉伸（A2）能力增強(qiáng)[85]；（B）人工血管結(jié)構(gòu)示意圖[87]Fig.4 (A) Hydrogen bond interaction between the hydrogel and the artificial cell enhances the compression(A1) and stretching (A2) abilities of the material[85];(B) Bionic structure diagram of artificial blood vessel[87]

3.3.3 表面潤(rùn)滑性

表面潤(rùn)滑性在組織工程領(lǐng)域極為重要。在生物體中，健康的關(guān)節(jié)軟骨覆蓋主要關(guān)節(jié)的骨骼末端，是自然界中已知的最有效潤(rùn)滑的表面。這種低摩擦對(duì)生物體健康至關(guān)重要，能夠最大限度地減少磨損，并通過(guò)減少機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)軟骨的剪切應(yīng)力維持體內(nèi)平衡。

受軟骨結(jié)構(gòu)啟發(fā)，2020 年，Lin 等[86]設(shè)計(jì)了含有磷脂囊泡的水凝膠，在施壓條件下脂質(zhì)不斷向表面滲出，形成光滑層。水凝膠的摩擦和磨損減少了100 倍，即使在水凝膠干燥和再水化后也獲得了良好的效果。該研究提供了一種維持水凝膠界面潤(rùn)滑的通用方法。

3.3.4 信號(hào)傳遞性

組織內(nèi)細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞對(duì)于組織功能的執(zhí)行十分重要。以胰島組織為例，按染色和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，人類(lèi)的胰島細(xì)胞主要分為胰島A 細(xì)胞、B 細(xì)胞、D 細(xì)胞及PP 細(xì)胞。這4 種細(xì)胞按特定的空間順序排列為胰島組織，利用不同細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞所分泌的胰島素和胰高血糖素，能夠使人體內(nèi)的葡萄糖濃度保持在一定范圍內(nèi)，對(duì)于維持人體健康起到了重要作用。人造細(xì)胞常用于模擬細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，將酶或底物分別封裝到不同的人造細(xì)胞中，可通過(guò)擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)人造細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞，發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，模擬組織內(nèi)細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞。

最近，Liu 等[87]將人造細(xì)胞負(fù)載到瓊脂糖凝膠基質(zhì)中，采用凝膠灌注的方法制備了人工血管（圖4B）。在葡萄糖和羥基脲雙輸入情況下，底物進(jìn)入人工血管激活人造細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖氧化酶/辣根過(guò)氧化物酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)氧化氫和一氧化氮，從而實(shí)現(xiàn)了人工血管內(nèi)的信號(hào)傳遞。

4 總結(jié)與展望

水凝膠優(yōu)越的性能使其廣泛應(yīng)用在人造細(xì)胞領(lǐng)域，由水凝膠組建的人造細(xì)胞系統(tǒng)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)模擬、藥物控釋和組織工程等方面展現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。天然水凝膠生物相容性高，但性能欠佳，合成水凝膠性能多樣，但其生物毒性及可降解性有待改善。進(jìn)行細(xì)胞模擬的水凝膠功能單一，欠缺多重響應(yīng)性。用于藥物控釋的水凝膠雖具有良好的刺激響應(yīng)能力，但生物相容性和可降解性較差。用于組織工程的水凝膠系統(tǒng)多為水凝膠與人造細(xì)胞的單純混合，有關(guān)人造細(xì)胞與水凝膠的結(jié)合方式對(duì)材料的性能探究較少。因此，未來(lái)用于人造細(xì)胞體系的水凝膠研究的發(fā)展方向應(yīng)主要集中于以下方面：（1）結(jié)合天然成分與合成成分制備既具有高生物相容性又具備多種活性官能團(tuán)的水凝膠；（2）利用修飾的活性官能團(tuán)設(shè)計(jì)具有多重響應(yīng)性的智能水凝膠；（3）在人造細(xì)胞體系中運(yùn)用多種具備不同功能的水凝膠以及它們之間的相互協(xié)助，實(shí)現(xiàn)人造細(xì)胞體系更加復(fù)雜的功能。智能水凝膠在人造細(xì)胞體系中的應(yīng)用有助于模擬復(fù)雜的細(xì)胞功能，提供新型藥物控釋載體和組織工程材料。