納米通道材料體系及納米孔傳感器的研究進展

張曉君 奇國棟 楊淼森 翁婷 梁麗媛 王德強

1（東北電力大學化學工程學院，吉林132012）

2（中國科學院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714）

3（中國科學院大學重慶學院，重慶 400714）

納米通道電學檢測技術(shù)是一類利用孔道直徑在納米尺度的材料進行電化學檢測的單分子傳感技術(shù)。自從第一個生物納米孔傳感器α-溶血素問世以來，在過去的幾十年內(nèi)，納米孔傳感器引起了越來越多的關(guān)注，不論是制備納米孔的載體材料還是器件的傳感原理都有了很多突破?；诩{米通道的單分子分析平臺因具有獨特的納米結(jié)構(gòu)和靈敏的電學響應性而被廣泛應用于材料、能源、生物醫(yī)學、生態(tài)和安防等領(lǐng)域[1-4]。

目前，隨著對納米孔傳感器檢測原理探究的深入以及新型薄膜材料的拓展，納米孔道傳感器除了傳統(tǒng)的生物納米孔與固態(tài)納米孔器件，還衍生出了結(jié)合多種材料體系優(yōu)勢的雜化納米孔體系，已有相關(guān)文獻分別對這幾類納米孔傳感器及應用進行了綜述介紹[5-8]。本文基于不同的納米孔制備材料體系，分別對這三類納米孔的最新研究進展及應用進行介紹，并對其未來的發(fā)展前景進行了展望。

1 生物納米孔

生物納米孔是由天然蛋白質(zhì)單體自組裝形成的寡聚體通道，是最早用于生物分子選擇性易位的納米孔，具有高度可重現(xiàn)的孔結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的孔內(nèi)環(huán)境等顯著優(yōu)勢[9-10]。目前應用較多的生物跨膜通道蛋白有金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-HL）、恥垢分枝桿菌毒素蛋白A（MspA）、氣單胞菌溶素（Ael）、細胞溶血素A（ClyA）和噬菌體Phi29（Phi29）等[11]。

1.1 α-HL

α-HL 是由金黃色葡萄球菌分泌的一種多肽毒素[12]，可組裝成蘑菇狀七聚體插入到磷脂雙分子層中形成跨膜通道（圖1A）。α-HL 納米孔由帽狀結(jié)構(gòu)域和β-桶狀結(jié)構(gòu)域（5 nm）兩部分組成，由直徑為1.4 nm的內(nèi)縮頸分開，是第一個被用于生物單分子檢測的納米孔[13]。最近，Liu 等[14]將α-HL 納米孔與質(zhì)譜（MS）和分子動力學（MD）模擬等技術(shù)結(jié)合，研究了陽離子肽LL-37 的兩個片段（D180 與G550）的寡聚狀態(tài)。根據(jù)D180 與G550 在α-HL 納米孔中的孔堵塞頻率，作者發(fā)現(xiàn)D180 表現(xiàn)出形成二聚體的趨勢，而G550 表現(xiàn)出形成高階低聚物的趨勢，并結(jié)合MS 和MD 兩項技術(shù)對該現(xiàn)象進行了驗證。該研究將多種技術(shù)相結(jié)合，有望在單分子水平上揭示寡聚體動力學和其它肽的微弱分子間相互作用。

圖1 生物納米孔結(jié)構(gòu)示意圖[12]：（A）α-溶血素（α-HL）；（B）恥垢分枝桿菌毒素蛋白A（MspA）；（C）氣單胞菌溶素（Ael）；（D）細胞溶血素A（ClyA）；（E）噬菌體Phi29（Phi 29）Fig.1 Schematic diagram of biological nanopore structure[12]: (A) α-Hemolysin(α-HL);(B) Mycobacterium smegmatisporin A (MspA);(C) Aerolysin (Ael);(D) Cytolysin A (ClyA);(E) Bacteriophage Phi29 (Phi29)

1.2 MspA

MspA 是來源于恥垢分枝桿菌的毒素蛋白[15]，具有短而窄（～1.2 nm 寬、～0.6 nm 長）的納米通道，形狀像煙囪（圖1B）。MspA 納米孔具有很強的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，與α-HL 納米孔相比，MspA 納米孔可對具有一定離子電流阻滯信號差異的4 個單堿基的均聚物進行分辨[16]，也易于對多位點進行突變修飾，是一種具有良好發(fā)展前景的生物納米孔材料。南京大學Huang 研究組[17]通過MspA 納米孔區(qū)分了鈣調(diào)素蛋白的3 種構(gòu)象（有無鈣離子和與目標肽結(jié)合）變化，這是首次利用MspA 納米孔對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化進行無標記檢測。最近，該研究組采用機器學習輔助的MspA 電滲透勢阱實現(xiàn)了對不同電荷蛋白質(zhì)的高分辨識別[18]。

1.3 Ael

Ael 是從嗜水氣單胞菌中提取的β成孔蛋白，具有直徑1.0～1.7 nm 的納米通道，形狀類似α-HL，但在cis 端沒有前庭結(jié)構(gòu)（圖1C）。Long 研究組[19-23]通過突變Ael 納米孔內(nèi)特定的氨基酸成功實現(xiàn)了對不同長度的寡核苷酸（2～20 堿基長）的檢測。Li 等[24]通過化學衍生化反應將芳香族標簽引入聚糖中，在Ael納米孔中首次實現(xiàn)了對不同的聚糖異構(gòu)體、不同長度（單糖基數(shù)量為2～5）的聚糖以及支鏈聚糖的鑒定，促進了納米孔聚糖分析技術(shù)的發(fā)展。

1.4 ClyA

ClyA 是一種由多種細菌合成的毒素[25]，通過自發(fā)組裝形成長度為13 nm 的圓柱形ClyA 納米孔（圖1D）。ClyA 納米孔是一種新型生物納米孔，相對于其它生物納米孔，具有較高的信噪比（SNR），可用于檢測中小分子量蛋白質(zhì)[26]。Zhang 等[27]設(shè)計了一種模塊化納米孔傳感器，將4 種納米抗體（Ty1、2Rs15d、2Rb17c 和nb22）設(shè)計成可替換模塊，通過5～6 nm 的DNA 雙鏈固定在ClyA 上，分別特異性識別高分子量蛋白SARS-CoV-2 刺突蛋白、中等分子量蛋白HER2 受體和低分子量蛋白鼠尿激酶型纖溶酶原激活酶（muPA）。

1.5 Phi29

Phi29 連接器是一種連接病毒頭部和尾部的蛋白質(zhì)，主要由12 個亞基組成[28]。這些亞基組裝形成具有錐形結(jié)構(gòu)（最窄的收縮孔直徑為3.6 nm，寬端直徑為6.0 nm）的納米孔（圖1E），適用于檢測分析物[29]。最近，Zhang 等[30]利用Phi29 納米孔在臨床抽取液的樣本中成功檢測出乳腺癌生物標志物（GAL3 結(jié)合蛋白）（p＜0.05）。

2 固態(tài)納米孔

與蛋白或多肽自組裝跨膜離子通道相比，固態(tài)納米通道是通過電子束、離子束、激光輔助、電介質(zhì)擊穿或化學刻蝕等[1,31]方法在無機/有機薄膜上加工而成。固態(tài)納米孔因具有尺寸可調(diào)性、物化及機械穩(wěn)定性、易修飾及易與其它技術(shù)集成等特點而受到研究者的關(guān)注，尤其是在生物單分子檢測領(lǐng)域[32-34]。研究不同載體材料的固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)設(shè)計與檢測原理具有重要意義。固態(tài)納米孔按載體材料的不同可分為硅基納米孔、碳材料納米孔、聚合物孔、單原子層二維材料孔、金屬-有機框架（MOFs）和共價有機框架（COFs）納米孔以及等離基元納米孔等。

2.1 硅基納米孔

硅基納米孔中最常見的載體材料是氮化硅（SiNx）和石英玻璃。2003 年，研究者首次使用電子束和離子束在SiNx薄膜上制備了SiNx納米孔[35-36]。SiNx納米孔具有熱穩(wěn)定性好、機械強度高和孔徑可控等特點，但孔的加工過程重現(xiàn)性低，材料內(nèi)源性噪聲及與生物分子的非特異性吸附等問題也是其實現(xiàn)測序應用的重要限制因素。因此，如何降低材料及檢測體系的噪聲，并開發(fā)新的加工策略以制備穩(wěn)定且堅固的SiNx納米孔仍是一個挑戰(zhàn)?；诙趸璧牟ＡЪ{米孔也是目前常見的硅基納米孔。Tang 等[37]設(shè)計了一種環(huán)介導等溫放大（LAMP）耦合玻璃納米孔計數(shù)策略，特異性檢測了惡性瘧原蟲（Pf）與間日瘧原蟲（Pv），實現(xiàn)了定性分析以及Pf 基因組DNA 的定量分析。這種高靈敏度高特異性的傳感策略為實現(xiàn)簡單、快速和低成本的固態(tài)納米孔單分子檢測的固態(tài)納米孔傳感器的開發(fā)提供了一條新的途徑。

2.2 單原子層二維材料

單原子層二維材料顯著提高了納米孔的空間分辨率，目前報道的制備固態(tài)納米孔的二維材料包括石墨烯、氮化硼（BN）、二硫化鉬（MoS2）、二硫化鎢（WS2）和黑磷等。石墨烯具有超薄的結(jié)構(gòu)與較好的機械穩(wěn)定性，基于石墨烯的納米孔在單分子測序領(lǐng)域中具有很大的應用潛力。但是，石墨烯納米孔的1/f 噪聲非常高，檢測DNA 分子易位的信噪比較低，雖然與堿基間距相當?shù)膯螌邮┰诶碚撋嫌型麑崿F(xiàn)核酸測序，但實際應用中的材料內(nèi)源噪聲及亞納米孔加工的精度及重現(xiàn)性仍然是石墨烯納米孔測序應用的瓶頸問題[38]。將氮化硼（BN）作為納米通道材料的研究較少，主要因為氮化硼納米結(jié)構(gòu)生長條件非?？量蹋貌牧虾穸鹊陀?0 nm，對生物單分子的鑒別及選擇性較差。但是，與單元素石墨烯相比，雙元素氮化硼作為微納結(jié)構(gòu)載體材料時具有更豐富的物化性質(zhì)[39]，有望在下一代生物傳感器中得到應用。目前，二硫化鉬（MoS2）是一種研究較多的半導體過渡金屬二鹵化物（TMD），單原子層MoS2的厚度約為0.7 nm，具有優(yōu)異的化學和機械穩(wěn)定性[40]。Wang 等[41]利用MoS2納米孔成功地對16 種天然氨基酸進行直接識別，分辨率低至1 Da，同時該納米孔也適用于單個氨基酸的磷酸化修飾鑒別，為未來利用納米孔傳感器對單個蛋白質(zhì)分子進行直接測序提供了可能（圖2A）。二硫化鎢（WS2）屬于TMD 的一類，也具備優(yōu)異的化學穩(wěn)定性與機械加工強度。Danda 等[42]在懸空硅基芯片上的單層WS2膜上制備了納米孔，探究了WS2納米孔的離子傳導特性和15 kbp 雙鏈DNA 的易位情況，開發(fā)了一種用于生物分子分析的光學響應WS2納米孔傳感器（圖2B），為利用其它TMD 材料制造納米孔并進行單分子分析提供了參考。

圖2 （A）二硫化鉬（MoS2）納米孔檢測氨基酸裝置示意圖[41]；（B）用于DNA 分析的光學響應二硫化鎢（WS2）納米孔[42]Fig.2 (A)Schematic diagram of the molybdenum disulfide(MoS2)nanopore detection device for amino acids[41];(B) Optically responsive tungsten disulfide (WS2) nanopores for DNA analysis[42]

2.3 聚合物納米孔

聚合物納米通道具有良好的生物兼容性，并且聚合物納米通道內(nèi)分布的多官能團是潛在的修飾位點，有利于實現(xiàn)孔內(nèi)特異性功能化。比較有代表性的聚合物納米孔材料包括聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯（PC）和聚酰亞胺（PI）等。聚合物納米孔的制備及修飾步驟主要包括徑跡刻蝕、化學刻蝕和功能化修飾。首先，徑跡刻蝕通過高能重離子輻照穿透聚合物膜產(chǎn)生潛在徑跡；然后，利用化學刻蝕該區(qū)域從而得到不同形狀、不同孔徑大小的納米孔，目前制備的聚合物納米孔最小可達2.4～9.7 ?[43]；最后，通過共價修飾在納米孔內(nèi)引入特異性功能基團或小分子。Peinetti 等[44]將DNA 適配體修飾到PET膜上，利用該傳感器對腺病毒和新冠病毒進行了選擇性檢測和傳染性區(qū)分，使得這類傳感器可以快速、直接和選擇性地對當前或新出現(xiàn)的病毒進行檢測和區(qū)分（圖3）。

圖3 形成適配體功能化的聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）納米孔和對腺病毒選擇性測定方案[44]Fig.3 Schematic diagram for formation of aptamer-functionalized polyethylene terephthalate (PET) nanopores and selective determination of adenovirus[44]

2.4 碳材料納米孔

碳材料類別十分豐富，主要分為零維（富勒烯）、一維（碳納米管）、二維（石墨烯、碳膜、金剛石）以及三維（石墨烯泡沫）碳材料等[45]。近二十年來，有關(guān)碳材料的研究發(fā)展迅速，利用碳基薄膜材料制備納米通道進行單分子傳感分析也是研究熱點之一。

在各種碳材料中，碳納米管（CNTs）的發(fā)展和應用比較成熟。按照生長的管壁數(shù)量，CNTs 可分為單壁（SWCNTs）、雙壁和多壁（MWCNTs）碳納米管；按導電性，CNTs 可分為金屬型和半導體型管碳納米管[46]。每根碳管都有獨立的手性，如將碳管作為離子通道，內(nèi)徑約1 nm 的單壁半導體單手性管是首選。Liu 等[47]通過將超短SWCNTs 插入脂質(zhì)雙層構(gòu)建納米通道，并將其用于研究離子傳輸和DNA 易位（圖4A），實現(xiàn)了選擇性檢測單鏈DNA 中修飾的5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。碳納米管具有超長時間分辨率，有利于區(qū)分不同堿基序列。相比SWCNTs，MWCNTs 性質(zhì)更復雜，到目前為止尚未用于DNA 分析。Henriquez 等[48]開發(fā)了一種在MWCNTs 上制備直徑范圍為50～160 nm 單通道的方法，為MWCNTs 用于單分子檢測提供了新策略。

圖4 （A）顯微注射探針裝置示意圖（上）和單鏈DNA 通過單壁碳納米管（SWCNTs）納米孔時的典型電流信號圖（下）[47]；（B）掃描透射電子顯微鏡電子束（STEM EB）和介質(zhì)擊穿（DB）兩種方法在商用的碳薄膜上制備納米孔示意圖[50]Fig.4 (A) Schematic diagram of the microinjection probe device (top) and typical current signals of singlestranded DNA as it passes through the single walled carbon nanotubes (SWCNTs) nanopore (bottom)[47];(B) Preparation of nanopores on commercially available carbon films by two methods,scanning transmission electron microscope electron beam (STEM EB) and dielectric breakdown (DB)[50]

碳膜納米孔是在碳材料所成的膜上制備具有納米尺寸的孔道結(jié)構(gòu)，其制備過程主要分為碳膜生長、膜轉(zhuǎn)移及膜上納米結(jié)構(gòu)制備等。本研究組與北京大學合作，在納米晶石墨膜上制備小尺寸納米通道，成功用于λ-DNA 的穿孔行為研究[49]。Takai 等[50]采用掃描透射電子顯微鏡電子束（STEM EB）和介質(zhì)擊穿（DB）兩種方法在6 nm 或10 nm 厚的非晶碳薄膜涂層組成的微網(wǎng)格上制備納米孔（圖4B）。在STEM EB方法中，孔徑可以被精確控制，每個孔的制備時間在90 min 內(nèi)。但是，在DB 方法中，由于碳膜具有導電性，雖然制備納米孔的程序和設(shè)備更簡單，但制備時間比STEM EB 方法長，并且成孔時電流迅速增加，導致無法對孔徑精確控制。

2.5 MOFs和COFs納米孔

MOFs 由金屬團簇和有機配體構(gòu)成，具有幾乎等同于沸石的晶體結(jié)構(gòu)，并且其結(jié)構(gòu)多樣，具有優(yōu)越的可設(shè)計性以及物理和化學性質(zhì)。因此，基于多孔MOFs 材料的傳感檢測研究不斷增加，基于多孔MOFs和COFs 材料的傳感檢測都是基于分子骨架設(shè)計和共價鏈接分子的長度調(diào)節(jié)MOFs 和COFs 材料孔道尺寸。Yamamoto 等[51]研究了MOFs 納米孔中的主客體電荷轉(zhuǎn)移事件。通過將合成后的供體分子插入帶有電子接受基團的柔性MOFs 中，成功獲得了兩個MOFs 客體電荷轉(zhuǎn)移絡合物。雖然供體物種和受體物種之間的氧化還原電位差很大，但在該MOFs 納米孔中可以協(xié)同實現(xiàn)均勻分布和限制，這種協(xié)同效應稱為“MOFs 誘導的電荷轉(zhuǎn)移”。Zhang 等[52]利用電泳方法成功制備了由SiNx襯底支撐的MOFs 納米孔。MOFs 納米孔的直徑范圍在0.88～1.24 nm 之間，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。該研究探究了不同表面電荷、疏水性和孔徑的MOFs 納米孔的離子傳輸特性，進一步證實了協(xié)同機制。MOFs 納米孔為發(fā)現(xiàn)新的離子傳輸機制提供了一個新的平臺，也拓展了新型固態(tài)納米孔的應用范圍。

COFs 是一種由有機建筑單元構(gòu)成的新型多孔晶體材料，其顯著特點是具有可調(diào)、可設(shè)計和可功能化的納米空間。因此，利用COFs 內(nèi)的納米空間為制備納米孔傳感器提供了可能性。Yuan 等[53]首次報道了COFs 納米孔用于氨基酸選擇性識別的研究（圖5A）。首先通過C3對稱三乙醛和含有或不含有二乙烯基的二胺混合物的亞胺縮合，得到兩種乙烯基官能化COFs。這兩種多變量COFs 都提供了由層狀六角形網(wǎng)絡的AA 或AB 堆疊形成的一維直納米孔。將COFs 進行β-環(huán)糊精（β-CD）修飾，制備成能夠選擇性運輸氨基酸的獨立混合基質(zhì)膜（MMM）。作者通過監(jiān)測跨膜離子電流的特征和滲透基質(zhì)的濃度變化，揭示了不同COFs 結(jié)構(gòu)的手性識別能力。COFs 的有機骨架與生物分子之間具有很高的親和力，大大減緩了DNA 通過COFs 納米孔的速度。Xing 等[54]將2 個孔徑分別為1.1 nm（COFs-1.1）和1.3 nm（COFs-1.3）的超薄COFs 納米片剝離，利用電泳使其緊密覆蓋在孔徑為（20±5）nm 的石英納米移液管上，形成COFs納米孔（圖5B）。在此納米孔中發(fā)現(xiàn)了與二維材料相比最慢的DNA 傳輸速度（270 μs/base）。在此納米孔基礎(chǔ)上進行短至6 個堿基的DNA 均聚物的易位檢測，通過易位時間對不同長度的DNA 均聚物進行了識別[55]。該研究為基于COFs 納米孔的DNA 測序提供了新的方向。

圖5 （A）共價有機框架（COFs）納米孔用于氨基酸對映選擇性運輸示意圖[53]；（B）基于COFs 的原子可控納米孔的DNA 分析示意圖[54]Fig.5 (A) Diagram of covalent organic frameworks (COFs) nanopore for enantioselective transport of amino acids[53];(B) Schematic diagram of COFs-based atomically controllable nanopore analysis of DNA[54]

2.6 等離基元納米孔

等離基元納米孔是一種在固態(tài)納米通道中引入能產(chǎn)生等離子體共振效應的金屬結(jié)構(gòu)而獲得的功能性納米通道。通常，等離基元納米孔的制備主要分為納米孔通道的制備、金屬結(jié)構(gòu)的設(shè)計與蒸鍍或沉積等步驟。目前的等離基元納米結(jié)構(gòu)主要包括蝴蝶結(jié)天線、等離子體靶心納米結(jié)構(gòu)、等離子體納米阱和等離子體納米腔。

Jonsson 等[56]將金蝴蝶結(jié)納米天線與固態(tài)納米孔相結(jié)合，在等離子體系統(tǒng)內(nèi)制造了納米孔（圖6A）。該研究組還將等離子體系統(tǒng)與表面增強拉曼光譜（SERS）測量相結(jié)合，對DNA 測序的可行性進行了理論研究[57]。最近，該研究組將等離子納米天線與固態(tài)納米孔相結(jié)合，實現(xiàn)了對10 kbp 雙鏈DNA 分子的無標記光學傳感[58]。此外，該研究組還制造了倒蝴蝶結(jié)等離子體納米孔，在透射光強度下利用此結(jié)構(gòu)對λ-DNA 的易位進行了光學檢測[59]。所制造的等離子體納米孔傳感器與傳統(tǒng)的單分子傳感器相比，在時間分辨率、易位時間、靈敏度和檢測帶寬等方面均顯著改進，并且可在并行陣列中進行大規(guī)模制造，為高通量光學單分子傳感提供了方向和策略。

圖6 （A）金蝴蝶結(jié)納米天線等離子體納米孔制造示意圖[56]；（B）在Au 涂層的SiNx 膜上制備等離子體靶心結(jié)構(gòu)裝置圖[60]；（C）等離子體納米阱納米孔（PNW-NP）器件裝置圖[62]；（D）等離子體納米腔集成的SiNx 納米孔裝置及測試圖[63]Fig.6 (A) Schematic diagram of the fabrication of a plasma nanopore for a gold bowtie nanoantenna[56];(B) Diagram of a plasma bullseye structure prepared on an Au-coated SiNx film[60];(C) Plasmaonic nanowellnanopore (PNW-NP) device diagram[62];(D) Plasma nano-cavity integrated SiNx nanopore device and test diagram[63]

納米孔中的溫度控制對于進一步了解生物分子非常重要，可以擴大其檢測范圍。Crick 等[60]開發(fā)了一種具有等離子體靶心結(jié)構(gòu)的固態(tài)納米孔器件。該器件是采用FIB 將等離子體靶心結(jié)構(gòu)研磨在Au 涂層的SiNx膜上制得（圖6B），使用632.8 nm 單色光源對納米孔進行精確加熱，并考察了納米孔加熱的效率、準確性和實用性。該研究組[61]使用新的制造步驟在基于耐熱玻璃襯底的氮化硅（Py-SiNx）納米孔上形成等離子體靶心結(jié)構(gòu)。該平臺能夠以非常低的電噪聲提供精確加熱，可作為檢測和研究單個DNA 分子易位的傳感器。

Assad 等[62]將納米孔嵌入采用金制成的等離子體納米阱中，構(gòu)建了用于熒光增強單分子檢測的等離子體納米阱納米孔（PNW-NP）器件（圖6C），這是電學與光學組合測量結(jié)合的首個研究報道。該研究將等離子體結(jié)構(gòu)與單分子納米孔傳感器耦合，探究了PNW-NP 器件的抑制熒光背景、增強熒光信號以及同步光信號和電信號的能力，為基于納米孔的傳感開辟了新的領(lǐng)域。

通過納米孔徑操縱流體傳輸對于許多納流體應用如傳感和分離系統(tǒng)非常重要。Li 等[63]將等離子體納米腔與SiNx集成，制造了一種通過調(diào)整整體照明功率來調(diào)節(jié)電阻的等離子體納米孔器件（圖6D）。在激光照明下，該器件可以可逆地導致孔電阻大幅增加（≥500%），同時產(chǎn)生整流離子電流-電壓特性。此外，該器件在高電阻狀態(tài)下可作為可逆離子整流器運行，無需對納米孔表面進行化學修飾或改變緩沖液特性。該研究組還考察了激光激發(fā)和改變偏壓對等離子體納米空腔孔的非對稱噪聲的影響[64]。

3 雜化納米孔

與傳統(tǒng)的單一材料所制備的納米孔不同，雜化納米孔是由兩種或多種不同材料組合構(gòu)建的納米通道。通過使用不同材料的組合，雜化納米孔可以融合每種材料的優(yōu)勢，并擴展其應用領(lǐng)域。

在結(jié)構(gòu)固定的固態(tài)納米孔中嵌入內(nèi)表環(huán)境均一的生物納米孔進而形成雜化納米通道，可以提高納米孔的生物相容性、選擇性和信噪比，實現(xiàn)更精確的單分子結(jié)構(gòu)分析。Hall 等[65]通過電泳易位將α-HL 蛋白插入到SiNx納米孔中，成功形成了第一個功能性雜化納米孔，并利用此納米孔進行了單鏈DNA 檢測。Cressiot 等[66]通過電泳易位將耐熱病毒G20c 的親水性門戶蛋白插入到SiNx納米孔中，構(gòu)建了一種新型無脂雜化納米孔（圖7A），并通過此雜化納米孔成功地對雙鏈DNA、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA、TPX3 肽和折疊球狀胰島素蛋白進行了檢測。Senl 等[67]將工程外膜蛋白G（eOmpG）插入雙層二硫化鉬（BL-MoS2）中形成雜化納米孔（圖7B），并對dA30 進行了檢測，與BL-MoS2固態(tài)納米孔相比，該納米孔噪聲降低了31.7%，電流偏差降低了8%，SNR 提高了1.9 倍。這種新型雜化納米孔為實現(xiàn)低噪聲和高靈敏的單分子檢測提供了新策略。最近，Wang 等[68]利用細菌視紫紅質(zhì)（bR）蛋白與SiNx納米孔構(gòu)建了一種生物納米流體裝置，通過生物自供電穩(wěn)態(tài)離子電流納米孔傳感策略（在0 V 外加電壓下），實現(xiàn)了bR 質(zhì)子泵送活性及其光響應的納米流體單分子探測（圖7C），促進了生物傳感和能量轉(zhuǎn)換應用中雜化納米孔流體裝置的發(fā)展。

圖7 （A）G20c 蛋白插入SiNx 納米孔形成雜化納米孔示意圖[66]；（B）工程外膜蛋白G（eOmpG）插入BL-MoS2 中形成雜化納米孔示意圖[67]；（C）細菌視紫紅質(zhì)（bR）蛋白插入SiNx 納米孔形成雜化納米孔示意圖[68]Fig.7 (A) Schematic representation of G20c protein inserted into SiNx nanopore to form hybrid nanopore[66];(B) Schematic representation of engineered outer membrane protein G (eOmpG) inserted into BL-MoS2 to form hybrid nanopore[67];(C) Schematic representation of bacterial retinoblast (bR) protein inserted into SiNx nanopore to form hybrid nanopore[68]

近年來，隨著DNA 折紙納米技術(shù)的快速發(fā)展，可以精確地人工合成穩(wěn)定的納米通道結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以通過牽引的方式嵌入到固態(tài)納米孔中形成DNA 折紙納米孔。目前，報道較多的用于雜化納米孔構(gòu)筑的DNA 折紙結(jié)構(gòu)有漏斗形和納米板形。Bell 等[69]合成了頂部面積為27.5 nm×27.5 nm、底部面積為7.5 nm×7.5 nm 的漏斗形折紙結(jié)構(gòu)，通過施加正向電壓將其插入到SiNx納米孔中形成DNA 折紙納米孔（圖8A），并對λ-DNA 進行了檢測，為DNA 折紙雜化納米孔用作電阻脈沖傳感器開辟了道路。Zhu 等[70]設(shè)計合成了尺寸約為60 nm×54 nm、中心具有15 nm×14 nm 矩形孔的DNA 納米板，并將其鋪在SiNx納米孔上方形成DNA 折紙納米孔（圖8B），推測了納米板在納米孔中的遷移有平面、正交和隨機3 種取向，為使用固態(tài)納米孔研究DNA 折紙的機械剛性和納米結(jié)構(gòu)的易位動力學提供了可能。Xing 等[71]開發(fā)了一種不同于傳統(tǒng)設(shè)計DNA 折紙納米孔的方法，將DNA 雙鏈體組裝成模塊化單元，并將這些單元連接成可調(diào)整的形狀，然后利用孔腔的大尺寸和孔壁受體的精確修飾，可以直接對蛋白質(zhì)進行檢測。

圖8 （A）漏斗形DNA 折紙納米孔形成示意圖[69]；（B）DNA 納米板與SiNx 納米孔相互作用示意圖[70]Fig.8 (A) Diagram of funnel-shaped DNA origami nanopore formation[69];(B) Schematic representation of the interaction of DNA nanoplate with SiNx nanopore[70]

最近，Yan 等[72]通過分子設(shè)計和有機合成工藝共價合成了一種新型納米孔結(jié)構(gòu)。該研究構(gòu)建了一種基于喹啉衍生螺旋的新型仿生人工質(zhì)子通道，其管腔直徑為1 ?，只允許質(zhì)子跨膜滲透，有效地過濾了陽離子、陰離子和水分子。將這種有機螺旋納米通道與其它納米結(jié)構(gòu)器件融合，有望在一些手性分子的鑒別過程中發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)和展望

本文針對納米通道制備的材料體系，介紹了典型的生物納米孔、固態(tài)納米孔及雜化納米通道的應用研究進展。生物納米孔具有結(jié)構(gòu)高度可重現(xiàn)性、通道內(nèi)表環(huán)境均一、噪聲低以及生物相容性好等顯著優(yōu)勢，但孔的單一化尺寸及支撐生物孔的磷脂雙層的穩(wěn)定性仍制約著生物納米孔的規(guī)模化應用。相較而言，固態(tài)孔的機械及物化穩(wěn)定性、尺寸可調(diào)及易修飾和兼容集成等優(yōu)點大大拓展了納米孔器件的應用范圍。其中，探索制造不同形狀結(jié)構(gòu)的等離基元納米結(jié)構(gòu)，將大大擴展基于納米孔傳感在光電聯(lián)合檢測中的應用。相對于以上兩種常見類型的納米孔，將兩種或多種材料的優(yōu)勢相結(jié)合構(gòu)建的雜化納米通道能提供性能更優(yōu)越的單分子分析器件平臺，但不同體系的兼容及漏電流等問題也是復合體系無法規(guī)避的問題。因此，未來的研究將在納米通道新材料開發(fā)、復合體系的集成策略及傳感原理創(chuàng)新方面尋求更多的突破，以推動納米通道單分子分析走向?qū)嶋H應用。

總之，隨著類型各異的納米孔傳感器檢測原理的不斷創(chuàng)新及材料體系的推陳出新，納米孔傳感器已經(jīng)成為一個重要的分析工具。未來的發(fā)展應更加多樣化和綜合化，為科學研究和技術(shù)創(chuàng)新提供更多的可能性。