基于納米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法研究進展

于素素 武園園* 汪夏燕 郭廣生*,2

1（北京工業(yè)大學(xué)化學(xué)系，環(huán)境安全與生物效應(yīng)卓越中心，北京 100124）

2（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

細胞是生物體結(jié)構(gòu)與功能的基本組成單位，基于單細胞的研究是生命研究的基礎(chǔ)[1-2]。單細胞分析是跨學(xué)科的前沿研究領(lǐng)域[3]，已成為現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要方法[4-5]，可獲得細胞在復(fù)雜生物環(huán)境中的準確信息，反映細胞在生命體中的作用，并進行細胞的深度信息解讀，從而揭示細胞的本質(zhì)，對研究細胞信號傳導(dǎo)、理解生命過程以及闡明疾病發(fā)生機理具有重要意義[6-7]?；顔渭毎治瞿軌?qū)崟r跟蹤細胞內(nèi)物質(zhì)的發(fā)展變化過程，反映生物體生理及病理的連續(xù)變化趨勢，在單細胞分析中具有重要地位[8-9]。

將藥物、核酸和蛋白質(zhì)等外源物質(zhì)傳遞入細胞，即胞內(nèi)傳遞，能夠進行細胞分析、了解細胞功能和監(jiān)測細胞命運[10]。胞內(nèi)傳遞現(xiàn)已成為基因編輯[11]、藥物遞送[12]及細胞療法[13]等的關(guān)鍵步驟，近年來已經(jīng)發(fā)展了多種胞內(nèi)傳遞方法，主要包括生物、化學(xué)和物理三類方法[14]。生物方法利用病毒載體等運送生化復(fù)合物進入細胞；化學(xué)方法主要是利用脂質(zhì)載體，誘導(dǎo)細胞利用內(nèi)吞作用進行物質(zhì)傳遞；物理方法是利用由電場、磁場或光產(chǎn)生的高強度能量或力，在細胞膜上產(chǎn)生孔隙而進行物質(zhì)傳遞。這些方法已經(jīng)廣泛用于疾病治療、藥理學(xué)分析及發(fā)育生物學(xué)等研究領(lǐng)域[15]。但是，這些方法多以群體細胞作為研究基礎(chǔ)[14,16]，丟失了一些稀有信息，掩蓋了個體細胞的差異性；并且只能實現(xiàn)單向傳遞，即將外界物質(zhì)傳遞入細胞；傳遞效率有限，對細胞活性有一定影響，無法實現(xiàn)精準胞內(nèi)傳遞[17]。

為了在不同時間跟蹤并監(jiān)測傳遞入單細胞內(nèi)的物質(zhì)的變化過程，從而準確了解單細胞的實時動態(tài)信息，為疾病的治療提供精準信息，進行活單細胞胞內(nèi)傳遞的研究具有重要意義[18]?；诩{米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法是一種高傳遞效率、低破壞性的物理類機械胞內(nèi)傳遞方法，在活單細胞胞內(nèi)傳遞的研究中脫穎而出[17-19]。該方法中使用的納米尖端結(jié)構(gòu)的長度通常在微米級別，尖端尺寸從幾納米至幾百納米不等，主要包括納米線、納米管和納米尖端移液針等[17-18]；該結(jié)構(gòu)可跨越細胞膜在細胞內(nèi)外建立通道，用于少量物質(zhì)的傳遞；其對細胞損傷小，基本不會影響細胞的活性。在物質(zhì)傳遞過程中，這些納米結(jié)構(gòu)的尖端可進入目標細胞，不存在細胞遺漏，細胞利用率高；利用該結(jié)構(gòu)可將外源物質(zhì)注射入活單細胞內(nèi)，也可將活單細胞內(nèi)物質(zhì)取出，實現(xiàn)雙向傳遞[20-21]，用于跟蹤檢測；納米尖端移動靈活，可結(jié)合高分辨顯微鏡對活單細胞內(nèi)細胞器進行定位，能夠用于單細胞定位胞內(nèi)傳遞[22]。同時，納米尖端的中空結(jié)構(gòu)能夠直接用于各種細胞胞內(nèi)傳遞不同物質(zhì)，受細胞類型影響小，傳遞物質(zhì)范圍廣（包括各種小分子及大分子）。另外，基于納米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法利用擴散、泵壓及電壓等驅(qū)動力將物質(zhì)傳遞到細胞內(nèi)或?qū)⒓毎麅?nèi)物質(zhì)取出，可實現(xiàn)單細胞定量胞內(nèi)傳遞[23]。

本文重點歸納并總結(jié)了實心納米尖端和空心納米尖端兩類結(jié)構(gòu)，詳細介紹了兩類納米尖端結(jié)構(gòu)的材質(zhì)、尺寸和制備方法，探討了基于納米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法的驅(qū)動力、原理、優(yōu)缺點及應(yīng)用，最后，對該方法未來的發(fā)展前景進行了展望。

1 基于實心納米尖端的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法

基于納米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法通常是將具有微米級別長度的納米級尖端刺入目標細胞，納米尖端結(jié)構(gòu)能夠穿越細胞膜，在膜內(nèi)外建立通道，最后利用擴散/吸附、泵壓或電壓等將物質(zhì)傳遞到細胞內(nèi)或?qū)⒓毎麅?nèi)物質(zhì)取出，實現(xiàn)活單細胞的胞內(nèi)傳遞[24-25]。納米尖端有陣列結(jié)構(gòu)和獨立結(jié)構(gòu)兩種：陣列納尖端用于胞內(nèi)傳遞的裝置，通常是在基底上制備一定數(shù)量的垂直納米尖端，尖端向上，尖端不可隨意移動，從下向上刺入培養(yǎng)的細胞中，進行胞內(nèi)傳遞；獨立納尖端用于胞內(nèi)傳遞的裝置，是將一根納米尖端固定于懸臂上，尖端向下，尖端可隨意移動，從上向下刺入培養(yǎng)的細胞中，進行胞內(nèi)傳遞。

本文依據(jù)納米尖端結(jié)構(gòu)將其分為實心納米尖端和空心納米尖端兩類。根據(jù)納米尖端結(jié)構(gòu)形狀的不同，實心納米尖端主要包括納米線和納米針?；趯嵭募{米尖端的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法是對納米尖端表面進行修飾，將外源物質(zhì)結(jié)合在尖端上，通過擴散解析或電刺激的方式傳遞入細胞內(nèi)，或?qū)⒓毎麅?nèi)物質(zhì)通過萃取的方式取出[24-27]。

1.1 基于納米線的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法

納米線主要分為獨立納米線和垂直陣列納米線兩種結(jié)構(gòu)，其中，垂直陣列納米線的胞內(nèi)傳遞通量高，最為常用。納米線具有較高的縱橫比（大于10），尖端尺寸通常小于200 nm，為最易制造的實心納米尖端結(jié)構(gòu)之一，多利用離子刻蝕或化學(xué)氣相沉積等方法，對硅、鎳、金和氧化鋅等材料進行微納加工，得到不同尺寸的納米線[26,28]。根據(jù)目標細胞和傳遞分子類型，通過調(diào)控垂直陣列納米線的平均間距、長度、直徑和銳度等物理參數(shù)，控制納米線的機械性能，提高胞內(nèi)傳遞的效率[26]。

Yan 等[29]報道了一種生物相容性的納米線光學(xué)探針用于高時空分辨的胞內(nèi)傳遞和胞內(nèi)檢測的方法（圖1A）。將氧化錫（SnO2）納米線（直徑尺寸為100～250 nm）與光纖的錐形尖端（錐角為3o～5o、尖端直徑為300～500 nm）連接，該納米線光學(xué)探針具有高度的靈活性和穩(wěn)定性，可在細胞成像過程中承受反復(fù)的彎曲和變形。該方法可將可見光引導(dǎo)到活哺乳動物細胞的細胞器中，檢測來自亞細胞區(qū)域的光信號；通過光激活機制，該納米線光學(xué)探針可將負載的外源物質(zhì)傳遞入具有時空特異性的細胞中，并且在此過程中沒有顯著的毒性。除了氧化錫材質(zhì)納米線，Kim 研究組[30]提出了一種基于金（Au）納米線的納米注射器，用于將外源基因傳遞到活單細胞的細胞核中（圖1B）。金納米線的直徑為100～150 nm，通過氣相傳輸法合成，具有極佳的機械性能，可最大限度地減少細胞損傷。該納米注射器的高導(dǎo)電性可精確定時及有效釋放附著在金納米線表面的DNA 分子。采用電刺激觸發(fā)的方法，實現(xiàn)快速、定量和定時的DNA 傳遞，不會造成明顯的細胞損傷，可將DNA 直接送入細胞核，并能成功表達。隨后，Kim 研究組[31]利用該電響應(yīng)金納米線（E-R Au NWI）注射器對豬精原干細胞（pSSCs）進行高效基因修飾，提高pSSCs 的轉(zhuǎn)染效率，用于轉(zhuǎn)基因豬的有效生產(chǎn)。與傳統(tǒng)的基于非病毒載體的基因傳遞方法相比，基于電響應(yīng)金納米線的方法將豬精原干細胞的轉(zhuǎn)染效率提高了至少6.7 倍，最高可達46.7 倍。

圖1 基于納米線的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法：（A）氧化錫納米線用于高時空分辨的胞內(nèi)傳遞[29]；（B）金納米線用于活單細胞的核內(nèi)傳遞[30]；（C）聚吡咯-硅納米線陣列用于胞內(nèi)傳遞[34]Fig.1 Intracellular delivery methods of living single cells based on nanowires: (A) SnO2 nanowire used for intracellular delivery and intracellular detection with high spatiotemporal resolution[29];(B)Gold nanowire used for intranuclear delivery of living single cells[30];(C) Polypyrrole (PPy)-Si nanowire array used for intracellular delivery[34]

獨立納米線的單細胞胞內(nèi)傳遞通量較低，為了高通量地將各種生物活性分子傳遞入不同類型的細胞，研究人員利用陣列納米線進行活單細胞胞內(nèi)傳遞。制備陣列納米線的材質(zhì)很多，其中硅（Si）最為常用，Shalek 等[32]使用表面修飾的垂直硅納米線陣列將生物分子定位、高效地傳遞到哺乳動物細胞中。垂直硅納米線陣列通過化學(xué)氣相沉積及離子刻蝕制備，納米線的尖端尺寸為100～200 nm，高度約為1 μm。該胞內(nèi)傳遞方法依靠硅納米線穿透細胞膜，隨后將表面結(jié)合的分子直接釋放到細胞質(zhì)中，從而能夠高效傳遞生物分子。這種傳遞方法能夠改造傳統(tǒng)方法難以轉(zhuǎn)染的原始細胞，還可誘導(dǎo)小分子神經(jīng)元祖細胞生長，并將蛋白引入特定的細胞器。然后，Lu 等[33]提出了一種基于活性氧（ROS）響應(yīng)性硅納米線陣列的基因轉(zhuǎn)染平臺，以提高多個細胞系的基因轉(zhuǎn)染效率。硅納米線陣列通過化學(xué)刻蝕法制備，納米線的尖端尺寸約為100 nm，高度約為10 μm。金納米顆粒修飾的硅納米線陣列（SN-Au）表面接枝聚[（2-丙烯酰）乙基（對硼酸芐基）二乙基溴化銨]（B-PDEAEA），通過靜電相互作用結(jié)合表面的質(zhì)粒DNA（pDNA），在納米線穿透細胞時直接傳遞到細胞中。SN-Au 在光處理下產(chǎn)生ROS，B-PDEAEA 接枝在金納米顆粒上的表面電荷變化，實現(xiàn)pDNA 在細胞質(zhì)中有效釋放，用于轉(zhuǎn)染。短時間光照后，該平臺對多種細胞類型的轉(zhuǎn)染效率顯著提高（HeLa 細胞3.2 倍，L929 細胞7.6 倍，BMSC 細胞2.3 倍，mESC 細胞6.2 倍）。Loh 等[34]開發(fā)了一種導(dǎo)電聚吡咯-硅（PPy-Si）納米線陣列裝置，利用納米尺寸尖端和電學(xué)性質(zhì)結(jié)合的方法，進行有效胞內(nèi)傳遞（圖1C）。利用離子刻蝕及化學(xué)氣相沉積技術(shù)制備納米線陣列，納米線的尖端尺寸小于200 nm，高度為10 μm，間隔5 μm。熒光物質(zhì)摻雜在納米線尖端矩陣的電沉積聚吡咯中，在施加還原電位時被釋放出來，實現(xiàn)定量胞內(nèi)傳遞。除了使用硅材質(zhì)制備納米線陣列外，還可以采用鎳、氧化鋅和砷化銦等材質(zhì)[35-37]，采用這些材質(zhì)制備的納米線陣列均可用于活單細胞胞內(nèi)傳遞。

1.2 基于納米針的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法

納米線可有效地減小尖端尺寸，提高胞內(nèi)傳遞效率，但是機械穩(wěn)定性下降；納米柱具有更有利的縱橫比（小于10），機械穩(wěn)定性更優(yōu)，可在機械穩(wěn)定性和胞內(nèi)傳遞有效性之間取得平衡[26]。納米柱主要為陣列結(jié)構(gòu)，尖端尺寸為200～500 nm，多利用離子刻蝕、化學(xué)刻蝕和火焰刻蝕等方法，對硅、二氧化硅、高聚物和碳等材質(zhì)進行加工制備[26,38-40]。但是，由于納米柱尖端尺寸較大，用于胞內(nèi)傳遞的報道較少，陣列納米柱主要用于細胞核形變、細胞增殖和活細胞成像等生物學(xué)研究[38-40]。納米針則結(jié)合了納米線和納米柱兩者的優(yōu)勢，具有鋒利的尖端和寬的基底以及良好的機械穩(wěn)定性[26]。納米針主要分為獨立納米針和陣列納米針兩種結(jié)構(gòu)，陣列納米針應(yīng)用較多，其尖端尺寸通常小于100 nm，多利用離子刻蝕、化學(xué)刻蝕和光刻蝕等方法，對硅材質(zhì)進行加工，制備不同尺寸的納米針[26,41]。

獨立納米針進行胞內(nèi)傳遞多依賴于原子力顯微鏡（Atomic force microscope，AFM），將AFM 的探針進行改進，制備出尖銳的錐形納米針，將表面修飾的納米針刺入活單細胞，進行胞內(nèi)傳遞。Ryu 等[42]通過聚焦離子束蝕刻的方法制備了一個超鋒利的錐形硅納米針，連接在AFM 懸臂上，插入活細胞中，并使用AFM 的力-距離曲線反映插入過程的機械響應(yīng)。納米針的尖端尺寸為200 nm，長度為10～15 μm。修飾后的納米針可用于原位檢測單細胞內(nèi)的分子，研究結(jié)果表明，gp5 修飾的納米針提高了插入效率，有助于對低插入效率的細胞種類進行分子檢測和分析。Penedo 等[43]以AFM 的硅針尖為材料，采用聚焦離子束銑削工藝制備了不同直徑和形狀的硅納米針，納米針形狀有扁平和尖銳兩種，尖端尺寸為100、200 和400 nm。作者測試了不同直徑和形狀的納米針對細胞膜的穿透能力，證明了薄而尖銳的納米探針可減少穿透細胞膜所需的穿透力（FP）和壓痕長度（IL），從而最大限度地減少細胞損傷，增加胞內(nèi)傳遞后細胞的存活率。除了將外源物質(zhì)傳遞入細胞內(nèi)，納米針還可通過固相微萃取的方法將活單細胞內(nèi)的物質(zhì)取出。Wang 研究組[44-45]采用固相微萃?。⊿PME）技術(shù)集成納米生物傳感器跟蹤和量化單個活細胞細胞質(zhì)中多巴胺濃度的波動（圖2A）。設(shè)計了一種聚吡咯改性的碳纖維雙功能納米探針，提取細胞質(zhì)中的多巴胺，然后進行電化學(xué)檢測。通過火焰刻蝕法制備碳納米針，再用聚吡咯對其進行修飾，得到納米尖端≤100 nm的雙功能納米探針，對樣品中的10 pmol/L 多巴胺具有良好的檢測性能。在保持靶細胞存活的情況下，采用該方法實現(xiàn)了連續(xù)檢測細胞質(zhì)中的多巴胺，為研究多巴胺神經(jīng)毒性及神經(jīng)退行性疾病相關(guān)藥物作用機制提供了參考。

圖2 基于納米針的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法：（A）碳納米針提取單細胞中的多巴胺[45]；（B）硅納米針陣列用于單細胞基因編輯[46]；（C）硅納米針陣列調(diào)節(jié)單細胞的基因表達[48]Fig.2 Intracellular delivery methods of living single cells based on nanoneedles: (A) Carbon nanoneedle used for extracting dopamine from single cell[45];(B) Silicon nanoneedle arrays used for single-cell gene editing[46];(C) Silicon nanoneedle arrays used for modulating gene expression in single cell[48]

獨立納米針也存在胞內(nèi)傳遞通量低和效率低的問題，因此陣列納米針在活單細胞胞內(nèi)傳遞中更為常用。Li 等[46]提出了一種振動輔助納米針/微流體復(fù)合系統(tǒng)，利用大面積納米針在振動下快速刺穿微通道中移動的懸浮細胞，實現(xiàn)連續(xù)的高通量胞內(nèi)傳遞（圖2B）。采用自組裝模板方法制備陣列硅納米針，該方法將離子刻蝕、化學(xué)刻蝕和氣相沉積相結(jié)合，納米針的尖端尺寸小于50 nm、底部尺寸約為300 nm、高度約為700 nm?；诖竺娣e自組裝技術(shù)和微通道的納米針陣列可最大限度地提高胞內(nèi)傳遞效率，對于難以轉(zhuǎn)染的免疫細胞，遞送效率可達98%，而細胞活力仍保持約80%；并且胞內(nèi)傳遞通量可保持在mL/min 水平。此外，通過該平臺制備了CD96 敲除的NK-92 細胞，基因編輯的NK-92 細胞具有更高的免疫力。Stevens 研究組[47]利用離子刻蝕及化學(xué)刻蝕的方法制備了多孔硅納米針陣列，納米針尖端尺寸約為100 nm。將電子和掃描離子電導(dǎo)顯微鏡與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，探究了納米針的生物分子傳遞機制，表明納米針的使用有助于將核酸傳遞進入人類干細胞。隨后，Stevens 研究組[48]利用離子蝕刻法可控制備縱橫比高且不可降解的硅納米針陣列，實現(xiàn)了納米針尖端直徑在20～700 nm 范圍內(nèi)的精確調(diào)節(jié)。使用該陣列對人間充質(zhì)干細胞（hMSCs）進行長期培養(yǎng)（圖2C），并利用納米針尖直徑的變化控制hMSCs的形態(tài)、核大小和F-肌動蛋白排列，調(diào)節(jié)核層基因、Yes 相關(guān)蛋白（YAP）靶基因和粘附基因的表達。Stevens 研究組[49]還采用表面修飾的硅納米針陣列進行細胞轉(zhuǎn)染，表明納米針可提高轉(zhuǎn)染效率，使用該系統(tǒng)進行表面介導(dǎo)轉(zhuǎn)染是高效和安全的，并且所需的核酸量比標準培養(yǎng)轉(zhuǎn)染低1 個數(shù)量級。

納米線具有極小的尖端尺寸，可最大限度地減小對單細胞造成的機械破壞，保持細胞的活性。但是，納米線的縱橫比高，使其剛性降低，容易在納米線-襯底和納米線-細胞界面處斷裂。納米針因具有尖端小、剛性高等優(yōu)點，適宜作為實心納米尖端，在活單細胞胞內(nèi)傳遞中發(fā)揮重要作用。但是，采用納米針進行胞內(nèi)傳遞時，與納米線和納米柱等實心納米尖端相似，需要將外源物質(zhì)修飾到納米針上，因此傳遞的物質(zhì)種類有限，這限制了實心納米尖端的使用范圍。

2 基于空心納米尖端的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法

根據(jù)納米尖端結(jié)構(gòu)形狀的不同，空心納米尖端主要包括納米管、納米尖端移液針及中空AFM 懸臂納米錐結(jié)構(gòu)?？招募{米尖端與實心納米尖端相比，胞內(nèi)傳遞的物質(zhì)范圍廣，主要利用液壓和電等驅(qū)動力將外源物質(zhì)（大分子和小分子）通過尖端內(nèi)部的中空腔室傳遞入活單細胞內(nèi)，或?qū)⒒顔渭毎麅?nèi)的物質(zhì)通過尖端的中空腔室取出[17-18]。

2.1 基于納米管的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法

納米管為空心圓柱體，尖端尺寸通常小于200 nm，多以陣列納米管結(jié)構(gòu)進行胞內(nèi)傳遞。通常采用原子層沉積與離子刻蝕相結(jié)合的方法，對氧化鋁、二氧化硅和二氧化鈦等材質(zhì)進行加工制備陣列納米管。通過在納米管膜上施加低功率、低電壓的電場，陣列納米管可將多種生物分子注入活單細胞中或?qū)⒒顔渭毎麅?nèi)的物質(zhì)取出，但不干擾細胞功能或存活能力，實現(xiàn)細胞內(nèi)外物質(zhì)的高效傳輸[50-51]。

Schmiderer 等[55]利用中空氧化鋁納米管將RNA 傳遞入人類造血干細胞和祖細胞（HSPCs）。采用原子層沉積與電感耦合等離子體-反應(yīng)離子刻蝕相結(jié)合的方法制備氧化鋁納米管，納米管尖端直徑約為150 nm，在電場作用下實現(xiàn)了6～2000 kDa 的mRNA、短干擾RNA（siRNAs）、DNA 寡核苷酸和右旋糖酐的高效傳遞。胞內(nèi)傳遞后的細胞功能齊全，并且細胞的基因表達不受干擾。納米管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染是一種溫和的基因傳遞方法，適合敏感的原代干細胞的非擾動治療。Zhang 等[53]使用自旋鍍膜及等離子體刻蝕的方法制備出尺寸可控、間距可控的二氧化硅（SiO2）和二氧化鈦（TiO2）納米管。將二氧化硅和二氧化鈦納米管與微流控系統(tǒng)結(jié)合，構(gòu)建納米電穿孔系統(tǒng)，實現(xiàn)了細胞膜不滲透分子在HeLa 細胞和MCF-7 細胞內(nèi)的高效傳遞（圖3A）。納米管不僅可用于將外源物質(zhì)傳遞入活單細胞內(nèi)，還可用于將活單細胞內(nèi)的物質(zhì)取出，實現(xiàn)連續(xù)跟蹤檢測。Cao 等[54]報道了一種時間分辨、縱向提取和定量測量多種細胞類型的蛋白質(zhì)和mRNA 的方法。采用原子層沉積與離子刻蝕相結(jié)合的方法制備尖端直徑為150 nm 的氧化鋁納米管，在指定的取樣區(qū)域內(nèi)從同一細胞中反復(fù)取樣細胞質(zhì)內(nèi)容物超過5 d，取樣后的細胞存活率＞95%，該取樣過程是無損的，可對細胞進行長期分析。從人誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSC-CMs）的心肌細胞中分析了48 個mRNA 序列，其中41 個被準確量化。該平臺適用于細胞系和原代細胞，通過長期跟蹤同一細胞或細胞群，提供了了解動態(tài)細胞行為的途徑。He 等[55]開發(fā)了一個多功能分支納米管（BNS）電穿孔平臺，可有效捕獲循環(huán)腫瘤細胞（CTCs），并能夠?qū)崟r、原位地對細胞內(nèi)的活動進行調(diào)控和監(jiān)測（圖3B）。在中空納米管的外側(cè)壁上具有許多納米分支，可與特異性抗體結(jié)合，從而促進CTCs 的有效捕獲。納米電穿孔可通過BNS 在低電壓下無損地穿孔細胞膜，使外源生物分子進入細胞質(zhì)，也可通過納米管吸取細胞質(zhì)，而不影響細胞活力，能夠在空間和時間控制下有效地將生物分子（如小分子染料和DNA 質(zhì)粒）傳遞到癌細胞中，或?qū)⒓毎麅?nèi)酶（如Caspase-3）進行重復(fù)提取用于實時監(jiān)測。

圖3 基于納米管的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法：（A）二氧化硅和二氧化鈦納米管與微流控系統(tǒng)結(jié)合用于胞內(nèi)傳遞[53]；（B）多功能分支納米管對單細胞進行調(diào)控和監(jiān)測[55]Fig.3 Intracellular delivery methods of living single cells based on nanostraws: (A) SiO2 and TiO2 nanotubes combining with microfluidic system used for intracellular delivery[53];(B) Multifunctional branched nanotubes for regulating and monitoring single cells[55]

2.2 基于納米尖端移液針的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法

納米尖端移液針為中空錐狀結(jié)構(gòu)，由石英或硼硅酸鹽玻璃毛細管制成，尖端尺寸從幾納米至幾百納米不等，多以獨立納米尖端移液針進行胞內(nèi)傳遞[20]。制備納米尖端移液針的方法主要有3 種：直接拉制法[56]、拉制與離子蝕刻相結(jié)合的方法[57]、拉制與化學(xué)刻蝕相結(jié)合的方法[22]。直接拉制法適合內(nèi)外徑比較大的毛細管制備納米尖端移液針，拉制與刻蝕相結(jié)合的方法則適用于內(nèi)外徑比較小的毛細管制備納米尖端移液針。納米尖端移液針主要依靠氣壓泵、液壓泵和電化學(xué)泵等驅(qū)動力進行胞內(nèi)傳遞，可將外源物質(zhì)傳遞入單細胞內(nèi)，也可將單細胞內(nèi)物質(zhì)取出，不影響單細胞的活性[22，58-59]。

Wu 等[22]建立了基于流體輔助濕法刻蝕的實時“可視化”精準可控制備石英納米尖端移液針的方法。根據(jù)繪制出的尖端內(nèi)徑開口尺寸與電流值的標準曲線，通過控制終止刻蝕時的電流值，能夠制備內(nèi)徑開口小至10 nm 尖端的可控制備。以電滲泵為驅(qū)動力，實現(xiàn)了高空間分辨的活單細胞（直徑＜30 μm）核內(nèi)蛋白注射，并在自建的活單細胞工作站上完成質(zhì)粒核內(nèi)傳遞，用于單細胞轉(zhuǎn)染（圖4A）。Li 等[59]提出了一種光響應(yīng)水凝膠-納米尖端移液針混合系統(tǒng)，采用直接拉制法制備尖端直徑為100 nm 的石英納米尖端移液針，可用于高空間/時間分辨率的單細胞操作。納米尖端移液針在單細胞研究中克服了高電壓（～1000 mV）或有機溶劑在操作過程中對靶細胞造成的干擾和損傷。光觸發(fā)系統(tǒng)用于無電壓、非侵入性的單細胞注射，保證了良好的細胞活力（存活率90%）。納米尖端移液針具有靈活性，可將外源物質(zhì)精準傳遞入活單細胞的不同區(qū)域。Lv 等[60]報道了一種基于玻璃納米尖端移液針的單細胞注射和熒光標記方法（圖4B）。采用直接拉制法制備尖端直徑為100 nm 的納米尖端移液針，對感興趣單細胞的不同亞細胞區(qū)域進行注射和高分辨率熒光標記。通過控制納米尖端移液針內(nèi)的電滲流，對胞內(nèi)傳遞實現(xiàn)精確控制，比較了非靶向染料和核靶向染料的不同遞送模式，展示了基于納米尖端移液針的方法在分析特定亞細胞區(qū)域方面的能力。納米尖端移液針除了可實現(xiàn)活單細胞精準胞內(nèi)注射，還可用于取出活單細胞中的物質(zhì)?；铙w神經(jīng)元中單個軸突和樹突的分子圖譜能夠為更好地理解神經(jīng)元功能提供重要信息。Xu 等[61]建立了一種電注射器輔助電噴霧質(zhì)譜方法，實現(xiàn)了活神經(jīng)元中單個細胞的軸突或樹突內(nèi)取樣，用于質(zhì)譜分析（圖4C）。利用直接拉制法制備尖端直徑為130 nm 的石英納米尖端移液針，插入到軸突或樹突中，通過電滲流吸取細胞質(zhì)。該方法揭示了整個活神經(jīng)元的分子分布，為深入研究神經(jīng)元內(nèi)部軸突/樹突與機體之間的分子通訊提供了可行性。

圖4 基于納米尖端移液針的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法：（A）石英納米尖端移液針用于單細胞轉(zhuǎn)染[22]；（B）玻璃納米尖端移液針對單細胞的不同亞細胞區(qū)域進行注射[60]；（D）石英納米尖端移液針從單個細胞的軸突或樹突內(nèi)取樣[61]Fig.4 Intracellular delivery methods of living single cells based on nanopipettes:(A)Quartz nanopipette used for single-cell transfection[22];(B)The glass nanopipette injecting to different subcellular regions of a single cell[60];(D) Quartz nanopipette extracting from the axons or dendrites of a single cell[61]

2.3 基于中空AFM懸臂納米錐的活單細胞胞內(nèi)傳遞法

基于中空AFM 懸臂納米錐的活單細胞胞內(nèi)傳遞法，即流體力顯微鏡（FluidFM）胞內(nèi)傳遞法是近年新發(fā)展的一種重要的單細胞胞內(nèi)遞送方法，將納米級分辨率的AFM 與控制流體回路的微通道懸臂相結(jié)合，能夠局部操縱液體，主要用于貼壁單細胞的胞內(nèi)遞送，同時保持細胞的活力[67]。

Zambelli 研究組[63]于2009 年首次提出了基于AFM 及中空懸臂納米錐的FluidFM 技術(shù)，用于局部液體分配和對單個活細胞的刺激（圖5A）。采用聚焦離子束刻蝕的方法可控制備氮化硅中空懸臂納米錐，納米錐尖端孔徑從100 nm 至1 μm 不等，壁厚為100 nm。溶液通過懸臂中的納米流體通道及尖端進行溶液分配，靈敏的AFM 力反饋能夠可靠地區(qū)分是否與細胞膜接觸或刺入細胞內(nèi)；通過FluidFM，將染料注入到單個活細胞內(nèi)。隨后，該研究組利用FluidFM 技術(shù)將染料定量傳遞入活單細胞內(nèi)，并將質(zhì)粒定位注射進細胞核中，單細胞成功轉(zhuǎn)染出綠色熒光蛋白[64]。FluidFM 技術(shù)不僅可將外源物質(zhì)定量地傳遞入活細胞內(nèi)，也可將活單細胞內(nèi)的物質(zhì)定量取出。Zambelli 研究組[23]于2016 年提出利用FluidFM 技術(shù)對單細胞進行時空分辨的定量樣品移?。▓D5B）。從細胞質(zhì)或細胞核移取可溶性分子并進行綜合分析，包括酶活性和轉(zhuǎn)錄豐度的檢測。該方法揭示了單細胞能夠承受皮升級樣品的移取，并為研究細胞動力學(xué)和細胞間相互作用提供了平臺。近年，F(xiàn)luidFM 技術(shù)多用于生物領(lǐng)域及疾病的發(fā)現(xiàn)與治療。Gabelein 等[65]利用FluidFM 技術(shù)以亞細胞空間分辨率從活單細胞中提取、注射和移植細胞器。當提取單個或一定數(shù)量的線粒體時，由于局部施加的流體力，線粒體的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇系恼渲楸硇?。在細胞間移植時，轉(zhuǎn)移的線粒體融合到宿主細胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)中。經(jīng)過線粒體的轉(zhuǎn)移和細胞的繁殖，供體線粒體DNA（mtDNA）在受體細胞內(nèi)復(fù)制。該研究為細胞器生理學(xué)和體內(nèi)平衡的研究提供了新方法。

圖5 基于中空原子力顯微鏡懸臂納米錐的活單細胞胞胞內(nèi)傳遞法：（A）FluidFM 將染料注入到活單細胞[63]；（B）FluidFM 用于單細胞定量樣品提取[23]Fig.5 Intracellular delivery methods of living single cells based on hollow atomic force microscopy cantilever nanoco:(A)FluidFM injecting dye into living single cell[63];(B)FluidFM used for quantitative sample extracting of single cell[23]

納米管以陣列的形式用于活單細胞胞內(nèi)傳遞，通量高，但納米管陣列垂直固定，無法移動，靈活性較差，較難實現(xiàn)活單細胞定位胞內(nèi)遞送。與陣列納米管相比，納米尖端移液針和中空AFM 懸臂納米錐的靈活性高，可實現(xiàn)活單細胞定位胞內(nèi)遞送，但是通量低。另外，中空AFM 懸臂納米錐制備復(fù)雜，用于胞內(nèi)遞送所使用的儀器價格昂貴，一般實驗室難以獲取。

綜上，基于納米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法各有特點，其性能比較見表1。

3 結(jié)論與展望

胞內(nèi)傳遞在疾病診斷方面發(fā)揮了重要作用，其中，活單細胞胞內(nèi)傳遞為疾病治療提供了更多精準的信息。基于納米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法具有破壞性小、傳遞效率高以及細胞利用率高等優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)雙向傳遞，已經(jīng)成為活單細胞胞內(nèi)傳遞的重要方法。納米尖端結(jié)構(gòu)主要包括實心納米尖端和空心納米尖端兩類。實心納米尖端主要有納米線和納米針兩種，尖端尺寸通常小于200 nm，多以垂直陣列結(jié)構(gòu)通過擴散解析或電刺激的方式進行活單細胞胞內(nèi)傳遞?？招募{米尖端主要包括納米管、納米尖端移液針及中空AFM 懸臂納米錐3 種，尖端尺寸通常小于200 nm，納米管為垂直陣列結(jié)構(gòu)，納米尖端移液針及中空AFM 懸臂納米錐為獨立結(jié)構(gòu)，利用液壓和電等驅(qū)動力，進行活單細胞胞內(nèi)傳遞?？招募{米尖端與實心納米尖端相比，具有無需修飾、胞內(nèi)傳遞物質(zhì)范圍廣等優(yōu)點，可傳遞蛋白質(zhì)、核酸和藥物等，因此近年來在活單細胞胞內(nèi)傳遞研究中應(yīng)用更多。目前，基于納米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法仍然存在一些問題。以陣列納米尖端進行胞內(nèi)傳遞的方法雖然通量高，但是空間分辨率低、靈活性差。以獨立納米尖端進行胞內(nèi)傳遞的方法的空間分辨率高、靈活性好，但是通量較低。利用微型化、集成化、可設(shè)計性強的微流控芯片進行活單細胞捕獲及培養(yǎng)，使用多光路、高分辨顯微鏡對胞內(nèi)傳遞過程進行成像，結(jié)合機械自動化及人工智能技術(shù)對胞內(nèi)傳遞部位進行精準定位及快速傳遞，有望在保證空間分辨率的基礎(chǔ)上，提高胞內(nèi)傳遞通量，解決上述問題?；诩{米尖端結(jié)構(gòu)的活單細胞胞內(nèi)傳遞方法在應(yīng)用于疾病治療的干細胞和免疫細胞等稀有細胞的研究領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。