提高分光光度法測定乳粉亞硝酸鹽回收率的研究

屠生輝，姜顧倩妮，劉 鎮(zhèn)，曾金紅，傅春輝，錢圣楠

（紹興市食品藥品檢驗研究院，浙江紹興 312000）

亞硝酸鹽是一類含氮無機化合物的統(tǒng)稱，一般默認指亞硝酸鈉。亞硝酸鈉是一種顏色為白色或淡黃色，狀態(tài)為粉末或顆粒，易溶于水的物質(zhì)，其外觀及滋味都與食鹽相似，主要在食品工業(yè)中作為發(fā)色劑和防腐劑使用。近年來，發(fā)生過幾起食用乳粉導(dǎo)致的亞硝酸鹽中毒的食品安全事件，成人攝入亞硝酸鹽0.3 ～0.5 g 即可引起中毒，3 g 能導(dǎo)致死亡。6 個月以內(nèi)的嬰兒對亞硝酸鹽特別敏感，存在患上高鐵血紅蛋白癥的風(fēng)險[1-2]。因此，乳粉中亞硝酸鹽含量的檢測已成為市場監(jiān)督管理局每年監(jiān)督抽檢的固定項目。

國家標(biāo)準(zhǔn)中乳粉亞硝酸鹽的檢測方法主要有離子色譜法和分光光度法，其中離色譜法檢測成本高，而分光光度法作為一種經(jīng)典的檢測方法具有應(yīng)用范圍廣的優(yōu)勢，但是由于乳粉基質(zhì)復(fù)雜，容易導(dǎo)致結(jié)果回收率偏低，影響檢測準(zhǔn)確性。有研究表明，在乳粉中進行亞硝酸鹽加標(biāo)實驗時，對回收率結(jié)果產(chǎn)生影響的因素主要是維生素C 含量以及乳粉基質(zhì)本身的顏色干擾，維生素C含量越高，回收率越低；基質(zhì)顏色越明顯，回收率也越低。因此，在測定過程中，作為本底的乳粉樣品要盡量選擇不含有維生素C，基質(zhì)顏色干擾也要盡量的小，從而排除影響回收率測定的干擾因素[3]。另外，乳粉中的油脂和蛋白含量也會影響檢測液的澄清透明度，最終影響比色結(jié)果[4]?；诖?，本文將進一步優(yōu)化實驗操作過程，確定較優(yōu)參數(shù)以提高分光光度法測定乳粉亞硝酸鹽的回收率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

7230G 可見分光光度計（上海舜宇恒平）；ME204E/02 電子分析天平（梅特勒）；HH-4 水浴鍋（聚輝）。

1.2 材料與試劑

飽和硼砂溶液、乙酸，分析純；鹽酸，優(yōu)級純；亞鐵氰化鉀溶液，106 g·L-1；對氨基苯磺酸溶液，4 g·L-1；鹽酸萘乙二胺溶液，2 g·L-1；乙酸鋅溶液，106 g·L-1。

標(biāo)準(zhǔn)品：1 000 μg·mL-1亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（偉業(yè)計量技術(shù)研究院）。

1.3 實驗方法

1.3.1 測定原理

沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后的乳粉試樣液中的亞硝酸鹽在弱酸性環(huán)境下，能與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，而后與鹽酸萘乙二胺耦合成紫紅色的染料，根據(jù)吸光度在分光光度計下用外標(biāo)法可測定亞硝酸鹽的含量。

1.3.2 測定方法

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中的第二法分光光度法進行測定[5]，通過設(shè)置提取階段的變量因素（蛋白沉淀劑添加量、稱樣量），確定提高加標(biāo)回收率的最優(yōu)條件。

（1）取樣和稱量。將乳粉反復(fù)攪拌至充分混勻后，置于150 mL 具塞錐形瓶，稱取適量試樣，作空白管；稱取同空白管等量的試樣，再加0.4 mL 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1），作為加標(biāo)實驗管，每組做平行樣。

（2）提取。先在上述裝有乳粉樣品的具塞錐形瓶中加入12.5 mL 的飽和硼砂溶液作為溶液中亞硝酸鹽的穩(wěn)定劑，再加入150 mL 熱水（70 ℃左右），混合均勻，在沸水浴中加熱15 min，加熱后取出置于冷水浴中冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至200 mL 的容量瓶中，加入適量的亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入等量乙酸鋅溶液，搖勻，作為蛋白質(zhì)沉淀劑組合溶液，加水至刻度線定容，搖勻。

（3）過濾。靜置30 min，用一次性滴管吸出上層脂肪，上清液用濾紙過濾，濾液備用（前30 mL 濾液棄去）。

（4）測定。移取40.00 mL 上述備用濾液于50 mL帶塞比色管中，再分別按0.2 mL 的等差梯度逐步吸取0 ～1.0 mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 μg·mL-1），按0.5 mL 的等差梯度逐步吸取1.0 ～2.5 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于比色管中的待測液中含有0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg 的亞硝酸鈉），作為標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管。再分別加入2 mL 對氨基苯磺酸溶，混勻，靜置5 min 后，各加入1 mL 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至50 mL 刻度線，充分混勻，靜置15 min。取1 cm 比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，在波長538 nm 下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較測算。同時做試劑空白[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白沉淀劑添加量對乳粉中亞硝酸鹽測定的加標(biāo)回收率的影響

提取過程中分別加入4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL和10 mL的亞鐵氰化鉀溶液，充分搖勻后，再加入對應(yīng)等量乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)，每組做平行實驗。如圖1 所示，吸光度和亞硝酸鹽含量的線性方程為y=0.022 9x+0.001 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，線性范圍為0 ～12.5 μg，根據(jù)吸光度換算出測定液中亞硝酸鹽的含量。

圖1 蛋白沉淀劑實驗組亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表1 可知，在稱樣量量級相同的情況下，添加不同的蛋白沉淀劑量會影響加標(biāo)回收率的測定結(jié)果。當(dāng)?shù)鞍壮恋韯┑奶砑恿啃∮? mL 時，加標(biāo)回收率隨著蛋白沉淀劑添加量的增加而增大；當(dāng)?shù)鞍壮恋韯┑奶砑恿看笥? mL 時，加標(biāo)回收率隨著蛋白沉淀劑添加量的增加改變不明顯。因此，結(jié)合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中分光光度法的蛋白沉淀劑添加量為5 mL，選擇蛋白沉淀劑最接近原標(biāo)準(zhǔn)的添加量（8 mL）為實驗添加量。

表1 蛋白沉淀劑添加量對檢測結(jié)果的影響

2.2 稱樣量對乳粉中亞硝酸鹽測定的加標(biāo)回收率的影響

考慮到樣品顏色會干擾乳粉中亞硝酸鹽的測定，不同的稱樣量會產(chǎn)生不同濃度的顏色干擾情況，分別稱取3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g 和10 g 試樣作空白管；再分別對應(yīng)稱取同空白管等量的試樣，再加0.4 mL 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1）作為加標(biāo)實驗管，每組做平行樣。按2.1 中得出的每10 g樣品加入8 mL 蛋白沉淀劑溶液的比例，分別加入2.4 mL、3.2 mL、4.0 mL、4.8 mL、5.6 mL、6.4 mL、7.2 mL 和8.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)中使用的蛋白沉淀劑溶液組合，搖勻，以沉淀蛋白質(zhì)。如圖2 所示，吸光度和亞硝酸鹽含量的線性方程為y=0.015 7x+0.001，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性范圍在0 ～12.5 μg，根據(jù)吸光度換算出測定液中亞硝酸鹽的含量。

圖2 稱樣量實驗組亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表2 可知，當(dāng)?shù)鞍壮恋韯┨砑恿繛槊?0 g 樣品加入8 mL 時，不同的乳粉稱樣量會影響加標(biāo)回收率，乳粉亞硝酸鹽測定的加標(biāo)回收率隨著稱樣量的增加而減少，當(dāng)稱樣量為10 g 時，回收率降至61.32%。當(dāng)稱樣量為5 g 時，加標(biāo)實驗的回收率已滿足85%～105%的要求，當(dāng)樣品量為3 g 時，加標(biāo)實驗的回收率最為理想。

表2 稱樣量對檢測結(jié)果的影響

3 結(jié)論

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中的第二法 分光光度法檢測乳粉中的亞硝酸鹽時，受乳粉基質(zhì)中的維生素C、蛋白和油脂以及顏色等干擾，影響比色結(jié)果，從而影響實驗加標(biāo)回收率。本文通過探索實驗稱量過程中的稱樣量和提取環(huán)節(jié)的蛋白沉淀劑添加量兩種變量因素，研究其對實驗測定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。結(jié)果表明，每10 g 乳粉樣品稱樣量中各添加8 mL 蛋白沉淀劑組合溶液時，提取效率顯著提升，且當(dāng)稱樣量≥3 g 時，稱樣量的減少可以有效降低乳粉中基質(zhì)顏色對吸光度測定的影響，從而提高分光光度法測定乳粉中亞硝酸鹽的回收率。因此改變提取環(huán)節(jié)的蛋白沉淀劑的添加量以及樣品稱樣量可以有效提高乳粉中亞硝酸鹽測定的回收率。