色胺酮對(duì)小鼠血小板聚集和釋放功能的影響及機(jī)制*

田曉云， 袁兆偉， 郭芳， 熊秀琴， 任天和， 劉剛， 羅俊*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025)

目前，血栓栓塞性疾病已成為影響人類健康的重大疾病之一，抗血小板藥物可以減少血栓形成，降低急性心肌梗死和缺血性中風(fēng)的患病和死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此，抗血小板治療方式已成為臨床上防治動(dòng)脈血栓的主要手段之一[1]。骨髓中具有成熟的巨核細(xì)胞，其經(jīng)過分化、脫落一系列過程形成血小板，血小板是一種具有活性(胞質(zhì)中散布有顆粒成分)的無核細(xì)胞，一般情況下處于靜息狀態(tài)，某些生理病理因子的刺激下則會(huì)發(fā)生聚集、釋放、擴(kuò)展及黏附等一系列活化反應(yīng)[2]。目前臨床常用的抗血小板藥物主要有環(huán)氧酶抑制劑(阿司匹林)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)受體抑制劑(氯吡格雷)、磷酸二酯酶抑制劑(西洛他唑)、血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑(替羅非班)等4類，這些藥物抗血小板作用療效確切，但能造成嚴(yán)重的、甚至致命的出血副作用[3]。因此，研發(fā)抗血栓作用強(qiáng)、出血副作用較少的藥物具有重要意義。有研究表明，多種具有活血化瘀作用的中草藥的有效活性成分如麥冬總皂苷、丹參素、葛根素、馬錢子堿、白楊素、胡蘆烷、異銀杏雙黃酮及黃山藥總皂苷均具有抗血小板和抗血栓的活性[4-11]。色胺酮(tryptanthrin)化學(xué)名為吲哚并(2，1-b)喹唑啉-6、12-二酮[indolo(2，1-b)quinazoline-6，12-dione]，屬于吲哚喹啉類生物堿，常見于板藍(lán)根、何首烏等中藥材中[12]。已知的色胺酮藥理活性主要有抗腫瘤、抗炎、抗氧化損傷、抑制白細(xì)胞增殖、抗菌、抗過敏、抗瘧及抗錐形蟲活性等多個(gè)方面，表明色胺酮的藥理活性廣泛、作用途徑多樣，但對(duì)該藥的研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段[13-20]，其在抗血小板方面研究尚未見報(bào)道。本研究擬通過探討色胺酮對(duì)血小板聚集和活化的作用及機(jī)制，為尋找更多潛在的抗血小板靶點(diǎn)、活血化瘀藥物的開發(fā)利用和抗血小板中藥新藥的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明(kunming，KM)種小鼠60只，體質(zhì)量18～24 g，雌雄各半，由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(黔)2018-0001]，實(shí)驗(yàn)獲學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2000082)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，提供充足的食物和飲用水。

1.1.2主要藥物、試劑及儀器 色胺酮(上海畢得醫(yī)藥，純度97%)；膠原、螢光素及螢光素酶(美國(guó)Chrono-Log)，凝血酶、ADP、前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1；美國(guó)Sigma)，phospho-蛋白激酶B[protein kinase B，PKB或Akt(Ser473)]、phospho-磷酸酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K；p85/p55)及phospho-糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β；美國(guó)Cell Signaling Technology)，磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；美國(guó)Proteintech)，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑(美國(guó)Millipore)，放射免疫沉淀試驗(yàn)(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液(上海Beyotime)；Model 700型號(hào)血小板聚集儀(美國(guó)Chrono-Log)，BC-5130全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳Mindray)，5810R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)；Epoch Microplate酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek)，WIX-EP600 通用電泳儀，Universal Hood Ⅱ化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio Rad)。

1.2 研究方法

1.2.1富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)的制備及分組 0.4%戊巴比妥鈉(100 μL/10 g)麻醉10只KM小鼠，固定，含1 ∶9(V/V)酸性檸檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose，ACD)的注射器從小鼠下腔靜脈中抽出血液；1 372 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液即為PRP，下層部分4 339 r/min離心10 min、所得上清液即為PPP。

1.2.2洗滌血小板制備 0.4%戊巴比妥鈉(100 μL/10 g)麻醉50只KM小鼠，固定，同“1.2.1”項(xiàng)下的取血步驟，將血液按1 ∶1加Tyrode緩沖液，再加PGE1(終質(zhì)量濃度50 μg/L)和Apyrase(終質(zhì)量濃度10 U/L)，1 372 r/min離心10 min，棄下層；上清液于2 567 r/min離心10 min，棄上清液底部沉淀團(tuán)塊即為濃縮血小板；臺(tái)式緩沖液重懸濃縮血小板，加50 μg/L PGE1、10 U/L Apyrase和1 mmol/L EDTA，2 567 r/min離心10 min；重復(fù)上述操作1次，重懸于1×Tyrode緩沖液，即為制備的洗滌血小板。采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)，將得到的血小板濃度調(diào)整為300×109個(gè)/L，實(shí)驗(yàn)過程均在室溫下進(jìn)行。

1.2.3血小板的聚集功能 血小板(300×109個(gè)/L)懸液于室溫下靜置至少0.5 h，取懸液250 μL加入聚集杯，分為對(duì)照組[1‰二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)]、5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組，37 ℃下將5 μmol/L、10 μmol/L色胺酮及0.5 mg/L替羅非班分別與洗滌血小板(或PRP)懸液孵育10 min，補(bǔ)加終質(zhì)量濃度為1 mmol/L Ca2+，分別加3種不同的激動(dòng)劑(2 mg/L膠原、80 U/L凝血酶或5 μmol/L ADP)，于血小板聚集儀上檢測(cè)，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為1 000 r/min，以臺(tái)式緩沖液(或PPP)作空白對(duì)照，利用光比濁法來檢測(cè)血小板的聚集情況，其血小板聚集率以5 min內(nèi)的最大透光率的百分比(%)來表示。

1.2.4血小板的釋放功能 按“1.2.2”項(xiàng)下制備小鼠的洗滌血小板，于聚集杯內(nèi)加懸液250 μL，分為對(duì)照組(1‰DMSO)、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組，10 μmol/L色胺酮及0.5 mg/L替羅非班分別與洗滌血小板懸液37 ℃孵育10 min，加終質(zhì)量濃度為1 mmol/L Ca2+，避光加螢光素，最后加終質(zhì)量濃度為2 mg/L膠原刺激血小板聚集，將增益設(shè)置為0.05×，在膠原誘導(dǎo)的血小板活化下，檢測(cè)色胺酮對(duì)致密顆粒ATP釋放功能的影響。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 按“1.2.2”項(xiàng)下制備小鼠的洗滌血小板，分為空白組、對(duì)照組(1‰DMSO)、5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組，除空白組不做任何處理外，其余各組于“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行血小板聚集反應(yīng)3 min時(shí)均按1 ∶1加提前配制的RIPA強(qiáng)裂解液(按1 ∶100加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，冰上裂解30 min；加5×loading buffer至上述樣品，使用吸管轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，作好標(biāo)記；置于煮蛋器100 ℃加熱10 min，使蛋白質(zhì)變性，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱；制備SDS-PAGE凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)模、免疫反應(yīng)(封閉、一抗二抗孵育)；提前0.5 h打開曝光儀開關(guān)預(yù)冷，并配制ECL曝光液，避光混勻；將膜置于培養(yǎng)皿中，曝光液淋洗，酶促反應(yīng)檢測(cè)PI3K、Akt、GSK3β及PKC蛋白的磷酸化表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血小板聚集功能

當(dāng)膠原刺激血小板聚集時(shí)，與對(duì)照組相比，5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組小鼠血小板的聚集率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；當(dāng)凝血酶和ADP刺激血小板聚集時(shí)，5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組小鼠血小板的聚集率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但0.5 mg/L替羅非班組小鼠血小板的聚集率較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：A、B及C分別為膠原、凝血酶及ADP刺激血小板聚集的定量結(jié)果；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖1 各組小鼠血小板的聚集功能Fig.1 Aggregation function of the mouse platelets in each group

2.2 血小板釋放功能

當(dāng)膠原刺激血小板釋放時(shí)，與對(duì)照組相比，10 μmol/L色胺酮組和0.5 mg/L替羅非班組小鼠血小板的ATP釋放量均有降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01。圖2 各組小鼠血小板的釋放功能Fig.2 Release function of the mouse platelets in each group

2.3 血小板聚集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)

當(dāng)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集后，與對(duì)照組相比，5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組小鼠血小板中PI3K(p85)、Akt及GSK3β蛋白的磷酸化水平減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組相比，5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組小鼠血小板中PKC蛋白底物(尤其是80 kDa蛋白)的磷酸化水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

注：A、B 為p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β及p-PKC蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果，C為p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β及p-PKC蛋白的定量結(jié)果；(1)與對(duì)照組比較，P<0.01。圖3 各組小鼠血小板中聚集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of related proteins in aggregation signal transduction for the mouse platelets in each group

3 討論

血小板之間發(fā)生相互粘附，聚集成團(tuán)，形成凝塊的過程被稱為血小板聚集[21]。本研究探討了色胺酮對(duì)血小板聚集的作用，結(jié)果顯示，膠原刺激血小板聚集時(shí)，5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組小鼠血小板的聚集率均有減少，表明色胺酮可以明顯抑制由膠原引起的小鼠血小板的聚集。

血小板釋放功能是指血小板通過釋放顆粒物質(zhì)，促進(jìn)止血和凝血過程[22]。血小板經(jīng)外部激活后，釋放出大量α顆粒和致密顆粒，此過程在血小板聚集和形成穩(wěn)定聚集體的過程中起著重要作用[23-24]。同時(shí)，顆粒釋放也會(huì)造成血小板持續(xù)活化[25]。當(dāng)膠原刺激血小板釋放時(shí)，10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組小鼠的血小板ATP釋放量均有降低。表明色胺酮對(duì)膠原引起的血小板ATP的釋放有顯著的抑制作用，說明色胺酮抑制血小板聚集的部分原因是由于其抑制血小板顆粒釋放發(fā)揮作用的。

為探究色胺酮抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的潛在分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了針對(duì)血小板膜上GPVI/α2β1受體上的信號(hào)通路PI3K-Akt-GSK3β和PKC。其中，GPVI受體是膠原作用的主要受體之一，屬免疫球蛋白家族，可選擇性與Src家族激酶(src family kinases，SFKs；主要是Fyn和Lyn)SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其信號(hào)路徑主要有2條分支：GPVI→SFK→脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)→PI3K→Akt→GSK3β→絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)→磷脂酶(phospholipase，PL)A2和GPVI→SFK→Syk→SH2結(jié)構(gòu)域的白細(xì)胞蛋白(SH2 domain-containing leukocyte protein，SLP)76→磷脂酶(phospholipase，PL)Cγ2→MAPKs/PKC[26]。PI3K在血小板活化過程中發(fā)揮重要作用，在膠原GPVI信號(hào)傳導(dǎo)中主要是被Syk激活[26]。Akt(一種絲氨酸/蘇氨酸激酶)是PI3K的主要下游效應(yīng)體，可通過與3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)結(jié)合域被血小板質(zhì)膜吸引，然后被3-磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase1，PDK1)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin，mTOR)C2磷酸化，在血小板顆粒釋放和整合素活化過程發(fā)揮重要作用[27]。PKC是GPVI受體信號(hào)通路下游的一個(gè)重要分子，并對(duì)各種刺激劑誘導(dǎo)的血小板釋放起到關(guān)鍵作用[28]。膠原誘導(dǎo)的血小板聚集伴隨著PKC的活化，并且PKC的一個(gè)亞型PKCα蛋白大小為80 kDa[29]。本研究結(jié)果表明，5 μmol/L色胺酮組、10 μmol/L色胺酮組及0.5 mg/L替羅非班組小鼠血小板中PI3K(p85)、Akt及GSK3β蛋白的磷酸化水平均減少；2個(gè)劑量色胺酮組和陽性藥組小鼠血小板中PKC蛋白底物(尤其是80 kDa位置蛋白)的磷酸化水平均降低。提示色胺酮可抑制血小板膠原GPVI受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中PI3K-Akt-GSK3β的磷酸化和下游蛋白PKC基質(zhì)磷酸化，這表明色胺酮可通過抑制PI3K-Akt-GSK3β信號(hào)和PKC，從而抑制膠原蛋白刺激的血小板聚集。

綜上，色胺酮通過抑制血小板中膠原GPVI下游信號(hào)PI3K-Akt-GSK3β信號(hào)和PKC而抑制血小板聚集和釋放功能，最終發(fā)揮其抗血小板活化作用，因此色胺酮可能是一種具有潛力藥用前景的抗血小板藥物，但其作用機(jī)制和毒理性有待進(jìn)一步研究。