回旋灸對壓力性損傷大鼠創(chuàng)面組織超微結構的影響

于杰，李洪玲，趙鋼，李金貴

在新型冠狀病毒感染疫情中，醫(yī)護人員由于長時間佩戴口罩易導致顏面部出現(xiàn)壓瘡，美國國家壓瘡咨詢委員會（National Pressure Ulcer Advisory Panel，NPUAP）將其定義為器械相關壓力性損傷（device related pressure injuries，DRPI），本病多由于固定裝置及呼吸設備等器械的壓力、潮濕狀態(tài)及器械的材質致使皮膚及皮下組織出現(xiàn)損傷，多見于醫(yī)護人員的職業(yè)損傷及ICU病房患者[1-6]。壓瘡（又稱褥瘡、席瘡）對應現(xiàn)代醫(yī)學壓力性損傷[2-5]，是由于局部組織長期受壓，繼而發(fā)生持續(xù)缺血、缺氧以及營養(yǎng)不良，導致組織發(fā)生潰爛、壞死的外科疾病?！吨袊毙匀毖阅X卒中診治指南2018》[7]并發(fā)癥防治部分新增加了壓瘡內容，壓瘡作為腦卒中并發(fā)癥具有高發(fā)病率的特點已達成共識，應當引起廣泛關注和重視，其有效防治及機制亟待深入研究。壓瘡創(chuàng)面修復早期存在炎性細胞過度持續(xù)浸潤，致使創(chuàng)面由炎癥期向增殖期發(fā)展受阻是影響壓瘡修復的重要因素，新生血管的生成在壓瘡修復過程中具有關鍵作用。艾灸治療壓瘡其臨床效果顯著[8-16]，但機制不清，項目組近年來對艾灸促進壓力性損傷組織血管新生的機制進行了研究[17-21]。本研究采用透射電鏡觀察回旋灸對壓力性損傷皮膚組織超微結構的影響，明確回旋灸促進壓力性損傷組織創(chuàng)面修復的作用，旨在為回旋灸治療壓力性損傷提供理論依據(jù)和參考方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究時間 2020年12月至2021年11月。

1.1.2 實驗動物 120只雌性健康Sprague-Dawly（SD）成年大鼠，購自揚州大學，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（蘇）2017-0007，體質量225～235 g 。大鼠在溫度（19.0±2.1） ℃、相對濕度（RH）40%～50% 、明暗周期12 h的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)2周后建立壓力性損傷大鼠模型，期間使其自由進食、飲水、活動。實驗全程單籠飼養(yǎng)大鼠，本研究通過揚州大學實驗動物倫理審查，編號：2020-FSYY-12。

1.1.3 實驗儀器設備 紅外熱像儀（美國FLIR SC640，F(xiàn)LIR SYSTEM），電子天平（上海精密儀器廠，MP200A型），透射電鏡（日本日立，H-7650 ），切片機（Reichert），小動物麻醉機（Matrx VMR，北京益仁恒業(yè)科技有限公司），自制造模裝置〔有機玻璃板（厚度15 mm）、塑料制尼龍扎帶、不銹鋼絲網(wǎng)、水瓶底座、十字形托盤、502膠水、鋼珠、膨脹螺絲及帆布條〕。

1.1.4 實驗試劑 鋨酸、戊二醛溶液、磷酸鹽緩沖液、丙酮及環(huán)氧樹脂812（上海富宇），異氟烷麻醉劑（山東科源制藥有限公司），0.9%氯化鈉溶液（青島華仁藥業(yè)股份有限公司），五年陳艾（規(guī)格：18 mm×200 mm的有煙艾條，南陽藥益寶艾草制品有限公司），75%乙醇、醫(yī)用碘伏，敏感肌膚型脫毛膏（薇婷牌，利潔時家化中國有限公司）及醫(yī)用棉簽。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建壓力性損傷大鼠模型 采用自制裝置通過塑料制尼龍扎帶依次對大鼠7個部位（雙側腋下、腹部、雙側腹股溝內側及雙踝部）進行固定，確保待造模部位充分暴露，備皮處理（面積20 mm×20 mm），后使用碘伏對待造模部位和裝置螺釘錐度側進行消毒。將自制裝置固定于實驗大鼠腿部近膝關節(jié)骨隆突處（造模部位），通過缺血-再灌注損傷循環(huán)周期模式制備壓力性損傷大鼠模型。缺血期（120 min）+再灌注期（30 min）=1個循環(huán)，5個循環(huán)/d，共持續(xù)3 d。再灌注期（30 min）內需將全部大鼠解壓松綁，放至鼠籠自由飲水、進食及活動。造模3 d結束后，再持續(xù)1 d（觀察期），目的是用以評價壓力性損傷大鼠模型制備是否成功，對于造模失敗的動物模型，給予剔除處理[17-20]。

1.2.2 動物模型的評價 大鼠模型評價參照2016年NPUAP指南[2]和2019年最新指南NPIAP/EPUAP壓力性損傷分類系統(tǒng)2～3期[3-5]，造模全程密切觀察SD大鼠行為學變化（整體狀態(tài)、步態(tài)、性情及二便等）及創(chuàng)面肉眼觀察（創(chuàng)面顏色、形態(tài)、滲出物性質及結痂情況）的改變[22]。

1.2.3 實驗分組 嚴格遵循先造模后隨機的原則，將85只SD大鼠施以壓力性損傷缺血-再灌注模型制備，期間共有7只大鼠造模失敗、8只大鼠于造模過程中死亡。將最終模型制備成功的70只SD大鼠通過隨機數(shù)字表法分為回旋灸組（n=35）與模型對照組（n=35），另外選取35只健康SD大鼠作為空白對照組。每組再根據(jù)干預時間分為5個亞組，即1、3、5、7、10 d 5個亞組，每亞組各7只。造模后至干預治療過程中，模型對照組和回旋灸組各有5只SD大鼠脫落，空白對照組有5只SD大鼠在備皮處理時不慎出現(xiàn)副損傷，予剔除。

1.2.4 干預措施 三組SD大鼠采用統(tǒng)一的捆綁方式。（1）回旋灸組：先對創(chuàng)面施以碘伏處理，再予回旋灸操作，以其壓力性損傷創(chuàng)面為中心，10 mm長度為移動半徑，1次/d，每次持續(xù)15 min。通過紅外熱像儀及實驗大鼠的狀態(tài)、反應和操作者手部的溫感及時調整艾條燃燒端與創(chuàng)面的距離，使紅外熱像儀檢測創(chuàng)面皮膚表面溫度值控制在40～42 ℃，每5 s測量1次創(chuàng)面皮膚表面的溫度，全程施灸操作務必注意對灰燼（艾條燃燒過程中產(chǎn)生）及時處理。（2）模型對照組：造模后只對創(chuàng)面施以常規(guī)碘伏處理。（3）空白對照組：不予造模，僅對模擬造模部位處施以碘伏處理。分別于干預的1、3、5、7、10 d對各亞組大鼠取樣進行透射電鏡觀察。

1.2.5 透射電鏡觀察

1.2.5.1 取材前準備 將磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）、2.5%戊二醛固定液、所需器械（蠟板、手術刀片、一次性注射器、眼科手術剪、EP管及鑷子等）均放置于4 ℃冰箱內預冷處理。

1.2.5.2 取材步驟 （1）通過塑料制尼龍扎帶依次對SD大鼠7個部位（雙側腋下、腹部、雙側腹股溝內側及雙踝部）固定于不銹鋼絲網(wǎng)上，開啟小動物麻醉機和氧氣瓶，吸入異氟烷和氧氣麻醉實驗大鼠，約30 s后待實驗大鼠進入麻醉狀態(tài)，此時將異氟烷的持續(xù)吸入量降低至最小劑量。麻醉期間應確保異氟烷劑量有效、適中、平穩(wěn)。待其進入麻醉狀態(tài)后，將壓力性損傷局部創(chuàng)面充分暴露，可在創(chuàng)面周圍通過記號筆做出標記，將預冷的2.5%戊二醛固定液通過1 ml注射器注入EP管中，同時將少許2.5%戊二醛固定液滴入預冷的蠟板中，等待取材。（2）選取壓力性損傷大鼠創(chuàng)面皮膚的正中部位，通過眼科手術剪進行取材，注意下刀快速、準確，以確保取材組織新鮮。（3）將取材后的皮膚組織在離體后迅速經(jīng)過PBS溶液和0.9%氯化鈉溶液徹底沖洗。（4）將經(jīng)過沖洗的大鼠皮膚組織放置于具有2.5%戊二醛固定液的蠟板中，采用雙刀片拉鋸的方法將組織切成體積不超過1 mm3的小塊組織，切塊須快速，切塊時確保組織浸沒在固定液中。用小號鑷子輕輕將切好的組織移送至裝有2.5%戊二醛固定液的EP管中，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2.5.3 透射電鏡制片 （1）前固定：2.5%戊二醛溶液中固定標本180 min，4 ℃保存。（2）PBS溶液漂洗：0.1 mol/L PBS溶液漂洗，15 min/次，共進行3次。（3）后固定：1%鋨酸固定液固定120 min。（4）PBS溶液漂洗：0.1 mol/L PBS溶液漂洗，15 min/次，共進行3次。（5）梯度脫水：室溫下50%丙酮15 min→70%丙酮15 min→80%丙酮15 min→90%丙酮15 min→100%丙酮15 min，進行3次。（6）浸透、包埋、固化：純丙酮+包埋液（2∶1）于室溫180 min→純丙酮+包埋液（1∶2）于室溫過夜→純包埋液于37 ℃ 120～180 min→在37 ℃烤箱內過夜→在45 ℃烤箱內0.5 d→在60 ℃烤箱內1 d。用牙簽輕輕將已滲透完畢的樣品移送至包埋板中，在45 ℃給予樹脂包埋0.5 d。（7）超薄切片：用超薄切片機切片，厚度保持50 nm左右，載網(wǎng)。（8）染色：分別進行醋酸鈾、枸櫞酸鉛的雙重染色。（9）透射電鏡下觀察各亞組大鼠皮膚創(chuàng)面的超微結構。

2 結果

2.1 空白對照組電鏡結果 空白對照組1、3、5、7、10 d各亞組大鼠皮膚組織電鏡下超微結構所示，基底細胞、棘細胞的線粒體結構清晰、數(shù)量很多，狀態(tài)較好且豐富，表皮呈現(xiàn)完整的全層結構，棘細胞的橋粒連接狀態(tài)很好，線粒體豐富發(fā)達，基底細胞的功能活躍，線粒體結構正常，基膜存在，結構尚可，見圖1。

圖1 空白對照組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織的超微結構Figure 1 The ultrastructure of wound tissue in rats with pressure injury in blank control group

2.2 模型對照組電鏡結果 模型對照組1 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織電鏡下可見，絕大部分表皮脫落，少部分表皮呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)，可見大量的炎性細胞浸潤，其中以中性粒細胞為主，創(chuàng)面外緣伴有細菌感染，見圖2 A～B。模型對照組3 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下所示，表皮局灶性損傷，可見大量的炎性細胞，伴有結晶體存在，見圖2C～D。模型對照組5 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下所示，表皮部分脫落，部分殘存，存在大量的炎性細胞高度浸潤，其中以中性粒細胞為主，此時期的中性粒細胞為新鮮狀態(tài)，見圖2E～F。模型對照組7 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下所示，未見表皮全層結構，基底細胞及棘細胞的線粒體腫脹，數(shù)量較少，細胞間隙較寬，可見大量的炎性細胞，以吞噬細胞為主，伴有少量的陳舊性中性粒細胞，見圖2G～H。模型對照組10 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下可見少部分表皮結構完整，大部分未見全層表皮結構，僅存在基底層及棘層，缺失顆粒層、透明層及角質層?；准毎c棘細胞的線粒體仍呈現(xiàn)腫脹狀態(tài)，炎性細胞浸潤以凋亡的淋巴細胞與吞噬細胞為主，見圖2I～J。

圖2 模型對照組大鼠不同時間點壓力性損傷創(chuàng)面組織的超微結構Figure 2 The ultrastructure of wound tissue in rats with pressure injury in model control group at different time points

2.3 回旋灸組電鏡結果 回旋灸組1 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下超微結構顯示，表皮呈局灶性損傷，部分脫落，部分萎縮，真皮層受損，真皮出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤（以中性粒細胞為主），見圖3 A～B。回旋灸組3 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織透射電鏡下可見，基底細胞部分變性，部分功能尚可，基膜附近存在變性細胞，基底細胞的線粒體腫脹，橋粒連接不清楚，兩個基底細胞之間間隙增大，炎性細胞浸潤基底細胞層。棘細胞的部分線粒體呈腫脹狀態(tài)，細胞間隙較寬。表皮的角質層脫落，真皮層有中等量的炎性細胞浸潤，與回旋灸組1 d亞組的炎性細胞數(shù)量相比，此時期數(shù)目相對減少，部分炎性細胞處于凋亡狀態(tài)，核固縮明顯，見圖3C～D。回旋灸組5 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下所示，表皮部分完整，部分缺失，部分僅可見基底層及棘層，顆粒層，透明層與角質層消失，部分可見基底層、棘層、顆粒層、透明層及角質層。絕大部分基底細胞的線粒體狀態(tài)很好，豐富發(fā)達，結構清晰，少部分略有腫脹，橋粒連接狀態(tài)較好，結構較清晰，基膜清晰可見，棘細胞的部分線粒體腫脹或變性，但橋粒連接尚可，真皮層可見不新鮮的粒細胞浸潤，大量的成纖維細胞增生活躍，伴有少量的淋巴細胞，見圖3E～F?；匦慕M7 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下可見完整的表皮全層結構，基底層、棘層、顆粒層、透明層、角質層均清晰可見。絕大部分基底細胞的線粒體結構清楚，數(shù)量較多且豐富，棘細胞的線粒體部分腫脹，部分尚可，真皮炎性細胞以吞噬細胞為主，淋巴細胞進入表皮，可見新生的毛囊及皮脂腺，見圖3G～H?；匦慕M10 d亞組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面組織鏡下所示，表皮結構完整，可見清晰、完整的表皮全層結構，即基底層、棘層、顆粒層、透明層、角質層?；准毎木€粒體數(shù)量多，豐富，未見腫脹，橋粒形態(tài)較好，棘細胞的線粒體更為豐富，結構清晰，橋粒形態(tài)較好，炎性細胞以大量的淋巴細胞浸潤為主，所見毛囊較為完整，見圖3 I～J。

圖3 回旋灸組大鼠不同時間點壓力性損傷創(chuàng)面組織的超微結構Figure 3 The ultrastructure of wound tissue in rats with pressure injury in circling moxibustion group at different time points

3 討論

近年來壓瘡發(fā)病率呈持續(xù)升高狀態(tài)[23]，面對壓瘡易發(fā)、難治的特點以及治療成本昂貴的問題，壓瘡的有效防治尤為重要，因此尋求安全有效、成本低廉的防治手段曾一度成為醫(yī)學研究的關注熱點[24-25]。從祖國醫(yī)學特色理論分析，艾灸治療壓力性損傷有的放矢?！夺t(yī)學入門·針灸》載：“藥之不及，針之不到，必須灸之?！薄鹅`樞·官能》：“針所不為，灸之所宜?！卑男袣庀觯瑴亟?jīng)通絡[26]，回旋灸溫熱刺激持久，活血溫通之力更甚，用于治療壓力性損傷體現(xiàn)了中醫(yī)學的優(yōu)勢與特色，因此本研究具有鮮明的中醫(yī)理論支撐。從現(xiàn)代醫(yī)學研究角度分析，壓力性損傷歸屬于慢性難愈合創(chuàng)面，其修復愈合的過程相對較復雜，原因之一在于與一般的皮膚損傷相比，壓力性損傷組織修復過程中的每個階段均相對較滯后。壓瘡創(chuàng)面修復的早期存在炎性細胞過度持續(xù)浸潤，致使創(chuàng)面由炎癥期向增殖期發(fā)展受阻是影響壓瘡修復重要因素，新生血管的生成在壓瘡修復過程中具有關鍵作用。項目組前期HE染色結果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，回旋灸組大鼠其壓力性損傷組織中的炎性細胞浸潤高峰提前，肉芽組織出現(xiàn)時間點亦提前，其成纖維細胞增生程度與數(shù)量更明顯，且出現(xiàn)時間點較早，回旋灸組大鼠創(chuàng)面組織更早出現(xiàn)新生血管和表皮結構的恢復[18]。

通過透射電鏡觀察回旋灸對壓力性損傷大鼠創(chuàng)面組織超微結構的影響，結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，造模后表皮脫落或萎縮，呈缺失或萎縮狀態(tài)，原有正常皮膚結構發(fā)生改變，透射電鏡觀察的重點在于表皮中的細胞器及炎性細胞狀態(tài)。與模型對照組比較，回旋灸組對于表皮結構的修復具有明顯優(yōu)勢，在治療5 d后可見表皮結構，部分完整，部分僅可見基底層及棘層，在7 d后可見表皮的完整全層結構，即基底層、棘層、顆粒層、透明層、角質層。而模型對照組在碘伏處理10 d后少部分表皮結構完整，大部分未見全層表皮結構，僅見基底層及棘層，未見顆粒層、透明層、角質層，由此說明回旋灸對壓力性損傷大鼠創(chuàng)面組織的表皮修復發(fā)揮明顯促進作用。同時，回旋灸組組內不同時間點，隨著艾灸干預刺激的累積，5、7、10 d三亞組中基底細胞及棘細胞的線粒體的結構、數(shù)量、形態(tài)由損傷后的腫脹、數(shù)量較少、不豐富、結構不清逐漸向修復后的不腫脹、數(shù)量較多、豐富、結構清晰的方向發(fā)展轉變，其中修復因素占主導作用，從而促進壓力性損傷創(chuàng)面組織的修復及愈合過程。此時期超微結構的改變可能歸因于殘存表皮功能狀態(tài)的改善以及新生表皮存在完整兩方面。模型對照組組內不同時間點呈現(xiàn)了壓力性損傷創(chuàng)面損傷及經(jīng)碘伏處理后自身修復中的基本病理狀態(tài)變化，直至碘伏處理10 d后，基底細胞及棘細胞的線粒體仍呈腫脹、數(shù)量較少、不豐富、大而空的形態(tài)特點，從損傷出現(xiàn)后經(jīng)碘伏處理至單純自身修復的進程比較緩慢，損傷因素占主導作用。此時期線粒體呈腫脹狀態(tài)考慮為兩個原因，一是新生血管形成較為緩慢，不足以供應受損區(qū)的營養(yǎng)狀態(tài)，尤其針對新生組織的營養(yǎng)成分與氧氣的提供較為缺乏，導致新生組織的再生相對較緩慢，殘存表皮線粒體腫脹，從而阻礙表皮的修復；二是炎性細胞浸潤期的延長對表皮的修復具有抑制作用，阻礙表皮的修復，導致其線粒體腫脹。本研究發(fā)現(xiàn)在炎性細胞的鏡下改變方面，回旋灸組從1 d的大量中性粒細胞浸潤，3 d中等量的中性粒細胞，5 d的不新鮮、陳舊性中性粒細胞，7 d吞噬細胞及淋巴細胞，10 d的淋巴細胞，反映出回旋灸治療后壓力性損傷創(chuàng)面組織從急性炎癥高度浸潤發(fā)展至慢性炎癥階段的變化，中性粒細胞從新鮮至陳舊的狀態(tài)變化。模型對照組在碘伏處理5 d后為急性炎癥的高度浸潤階段，模型對照組的炎性細胞浸潤期延長。與模型對照組比較，回旋灸組從整體上提前急性炎癥浸潤的高峰，因而在整體進程上縮短壓力性損傷創(chuàng)面修復時間。

綜上所述，透射電鏡下觀察回旋灸對壓力性損傷大鼠創(chuàng)面組織超微結構的影響與前期光鏡下觀察其創(chuàng)面病理形態(tài)學改變[18]，二者對于炎性細胞浸潤及表皮的觀察結果基本一致，由此說明，一方面回旋灸對壓力性損傷大鼠創(chuàng)面組織的表皮修復具有明顯促進作用。另一方面回旋灸從整體上提前急性炎癥浸潤的高峰，在整體進程上縮短創(chuàng)面愈合時間，因此回旋灸能夠有效促進壓力性損傷組織的創(chuàng)面修復。

作者貢獻：于杰負責選題，進行研究設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；李洪玲進行研究實施、評估、資料收集；于杰、趙鋼進行論文的修訂、英文的修訂；李金貴進行質量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。所有作者確認了論文的最終稿。

本文無利益沖突。