整合流式評分在骨髓增生異常綜合征中的診斷和預后價值研究

陳穎，李紀鵬*，葉佩佩

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一組異質(zhì)性、髓系克隆性造血干細胞惡性腫瘤，其特征為血細胞減少，一個或多個細胞系病態(tài)造血，遺傳學不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化為白血病的風險較高等[1]。盡管新的診斷方法不斷出現(xiàn)，但診斷MDS的“金標準”仍是基于骨髓形態(tài)、祖細胞計數(shù)和細胞遺傳學[2]。細胞發(fā)育不良并非MDS特有，骨髓涂片質(zhì)量不佳、病態(tài)造血不明顯或原始細胞增加不顯著，尤其是在核型正?；驔]有MDS相關遺傳變異的情況下，MDS診斷通常很有挑戰(zhàn)性。多參數(shù)流式細胞術（multiparametric flow cytometry，MFC）用于評估骨髓細胞異常表型，已成為診斷MDS的重要共同標準[2-3]。普遍使用的四參數(shù)流式評分系統(tǒng)——Ogata評分[4]診斷MDS的特異度較高（90%以上），但靈敏度較低（30%～70%）[4-7]。2017年由CREMERS等[6]應用44個流式參數(shù)設計了整合流式評分（integrated flow cytometric score，iFS），包括Ogata評分，未成熟、成熟的粒細胞和單核細胞系以及紅細胞的發(fā)育不良特征分析，該評分全面分析了各個細胞系，對MDS有較好的診斷價值，OELSCHLAEGEL等[7]認為iFS是診斷MDS的最佳評分系統(tǒng)。但目前關于此評分系統(tǒng)在中國人群中的研究鮮見報道，尤其是在原始細胞不增加的低級別MDS中，并未廣泛應用。因此，本研究探索iFS在MDS診斷和預后評估中的應用前景，旨在為臨床診斷MDS和評價預后尋找合適的流式細胞術評分系統(tǒng)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2019年1月至2022年4月在寧波大學附屬人民醫(yī)院血液科因外周血一系或多系減少而就診的患者，均行血常規(guī)、骨髓形態(tài)學、流式細胞術、染色體核型分析檢查，依據(jù)MDS最低診斷標準[2]進行診斷：（1）必要條件：持續(xù)4個月一系或多系血細胞減少（如檢出原始細胞增多或MDS相關細胞遺傳學異常，無需等待可診斷MDS）并排除其他可導致血細胞減少和發(fā)育異常的疾?。唬?）MDS主要標準（至少滿足1條）：①骨髓涂片中紅細胞系、粒細胞系、巨核細胞系發(fā)育異常細胞的比例≥10%；②環(huán)狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例≥15%；③原始細胞達5%～19%；④檢出有MDS診斷意義的染色體異常。滿足必要條件和任意一條MDS主要診斷即可確定為最低診斷。納入標準：（1）發(fā)病年齡>14歲；（2）初診時具有完整的骨髓形態(tài)學、流式細胞術和染色體核型結(jié)果。排除標準：腫瘤史。共計納入160例患者作為研究對象，經(jīng)0～12個月隨訪最終確診為MDS的患者83例（MDS組），MDS組中骨髓原始細胞比例<5%為低級別MDS，包括MDS伴單系病態(tài)造血（MDS-SLD）、MDS伴多系病態(tài)造血（MDS-MLD），MDS伴環(huán)形鐵粒幼細胞（MDS-RS）、MDS無法分類（MDS-U）、MDS伴孤立5q-（MDS-5q-）；77例為反應性的血細胞減少或發(fā)育異常，納入非MDS組，患者臨床特征見表1。患者均已簽署知情同意書，本研究通過寧波大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準〔2022-（科研）-031〕。

表1 患者臨床特征〔n（%）〕Table 1 Clinical characteristics of the participants

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集所有患者的性別與年齡，MDS組患者的血常規(guī)檢查結(jié)果〔血紅蛋白（Hb）、血小板計數(shù)（PLT）和中性粒細胞計數(shù)〕、染色體核型結(jié)果和骨髓形態(tài)學結(jié)果。

1.2.2 MFC標本處理和獲取數(shù)據(jù) 抽取患者新鮮骨髓3～6 ml，取1～2 ml用于流式細胞術檢查，使用EDTA對其進行抗凝處理，樣本處理參照歐洲白血病網(wǎng)（European Leukmia Net，ELN）的MDS標準化操作流程[8]。采用的抗體組合為：（1）CD34-FITC/CD33-PE/CD45-PERCP/CD13-PECY7/CD117-APC/HLA-DRAPC-H7；（2）CD16-FITC/CD56-PE/CD45-PERCP/CD13-PECY7/CD11b-APC；（3）CD15-FITC/CD64-PE/CD45-PERCP/CD34-PECY7/CD11c-APC/CD14-APC-H7；（4）CD38-FITC/CD34-PE/CD45-PERCP/CD19-PECY7/CD10-APC/CD20-APC-CY7；（5）CD3-FITC/CD7-PE/CD45-PERCP/CD4-PECY7/CD5-APC/CD8-APC-H7；（6）CD2-FITC/CD36-PE/CD45-PERCP/CD123-PECY7/CD71-APC。

單克隆抗體購自美國BD公司（Becton，Dickinson and Company），（5～10）×105個骨髓細胞與抗體孵育15 min后，BD FACS Lysing Solution溶解紅細胞，洗滌后上機。多參數(shù)流式細胞儀 BD FACSCanto Ⅱ采集數(shù)據(jù)，每管至少獲取10萬個有核細胞和250個祖細胞?；颊叩腗FC數(shù)據(jù)采用FACSDiva Version 6.1.3軟件進行盲法、回顧性分析骨髓細胞異常表型。

1.2.3 MFC分層設門策略和診斷評分 分層設門識別各細胞系，設門策略參考ELN指南[8-9]。設置熒光參數(shù)/Time二維點圖選擇液流穩(wěn)定區(qū)域；設置前向散射光（forward scatter，F(xiàn)Sc）/側(cè)向散射光（side scatter，SSc）二維點圖，去除雜質(zhì)；設置二維點圖FSc-A/FSc-H，去粘連體細胞；骨髓有核細胞顯示在CD45/SSc二維點圖上，設置髓系祖細胞門（CD34+和 /或 CD117+CD45dimSScint）、B祖細胞門（CD19+CD34+CD45dimSSclow）、淋巴細胞門（CD45hiSSclow）、粒細胞門（CD45dimSScint/hi）、單核細胞門（CD45hiSScint）和有核紅細胞門（CD45neg/dim），Ogata評分的4個參數(shù)見表2，SSc峰值和CD45平均熒光強度值由軟件計算得出，粒細胞與祖細胞和/或單核細胞重疊時，必須通過適當?shù)臉酥疚铮ɡ纾篊D34、CD117、CD15、CD64等）進行識別[8]，分別對門內(nèi)細胞不同抗原表達進行分析，Ogata評分≥2分為診斷標準的依據(jù)；根據(jù)Ogata評分和各系表型異常（表2），iFS判讀患者為“A”表示“MFC無MDS跡象”，“B”表示“MFC提示有限的MDS跡象”，iFS判讀為“C”表示“MFC符合MDS（即診斷為MDS）”。iFS[6]的判讀標準見表3。

表2 整合流式評分參數(shù)Table 2 The parameters of integrated flow cytometric score

表3 整合流式評分判讀標準Table 3 Interpretation criteria of theintegrated flow cytometric score

1.2.4 細胞遺傳學風險分類及修訂版國際預后積分系統(tǒng)（Revised International Prognositic Scoring System，IPSS-R）評估 在患者抽取的新鮮骨髓3～6 ml中取2～4 ml用于染色體檢查，使用肝素對其進行抗凝處理，經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基24 h短期培養(yǎng)法制備染色體，R顯帶技術光學顯微鏡下分析核型，分析20個分裂象。核型異常依據(jù)《人類細胞基因組學國際命名體系2016》（ISCN2016）[10]進行描述。83例MDS患者進行了染色體核型分析，其中2例無中期分裂象，無法獲得染色體核型。按照文獻[11]對81例MDS患者的染色體核型進行細胞遺傳學風險分類：（1）極好：-Y、del（11q）；（2）好：核型正常、del（5q）、del（12p）、del（20q）、del（5q）附加另一種異常；（3）中等：del（7q）、+8、+19、i（17q）及其他1～2種獨立克隆的核型異常；（4）差：-7、inv（3）/t（3q）/del（3q）、-7/del（7q） 附 加 另 一 種異常和復雜核型（3種）；（5）極差：>3種復雜核型。

采用IPSS-R[11]對MDS患者進行預后分層：（1）染色體核型“極好”計0分，“好”計1分，“中等”計2分，“差”計3分，“極差”計4分；（2）骨髓原始細胞≤2%計0分，>2%～5%計1分，>5%～10%計2分，>10%計3分；（3）血紅蛋白≥100 g/L計0分，80～<100 g/L計1分，<80 g/L計1.5分；（4） 血小板≥100×109/L計0分，50×109/L～<100×109/L計0.5分，<50×109/L計1.0分；（5）中性粒細胞計數(shù)≥0.8×109/L計0分，<0.8×109/L計0.5分。危險度分層標準為：各預后指標計分相加，總積分≤1.5分為極低危，>1.5～3.0分為低危，>3.0～4.5分為中危，>4.5～6.0分為高危，>6.0分為極高危。

1.2.5 MDS治療方案和患者隨訪 MDS治療方案參照《骨髓增生異常綜合征中國診斷與治療指南（2019年版）》[12]。隨訪開始時間為患者確診之日，結(jié)束時間為2022-04-30，隨訪資料通過查閱住院、門診病歷和電話隨訪獲得，隨訪終止事件為患者轉(zhuǎn)白血病或死亡。無事件生存期是指確診之日起至轉(zhuǎn)白血病或死亡日期為止，無上述事件發(fā)生的患者從確診之日起計算至末次隨訪日期或經(jīng)異基因造血干細胞移植日期為止。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)和范圍表示，組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法。對所有患者按照iFS進行診斷評分，繪制iFS和Ogata評分診斷MDS的受試者工作特征（the receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算靈敏度、特異度和ROC曲線下面積（AUC）等；采用Spearman秩相關分析MDS患者iFS評價等級與細胞遺傳學風險分類、IPSS-R的相關性；應用Kaplan-Meier法繪制MDS（iFS評價為C）的患者和其他MDS（iFS評價為A或B）患者的無事件生存曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MDS組和非MDS組中各系的表型異常情況MDS組患者男53例（64%），女30例（36%）；年齡25～84歲，中位年齡63歲；低級別MDS 45例，核型正常的低級別MDS 20例；非MDS組患者男40例（52%），女37例（48%）；年齡25～89歲，中位年齡68歲。MDS組和非MDS組患者性別和年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.327，P=0.127；Z=-0.442，P=0.658）。根據(jù)iFS判讀（表2）各系表型異常，MDS組髓系祖細胞出現(xiàn)異常的比例為71.1%（59/83），高于非MDS組的1.3%（1/77），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=82.998，P<0.001）；MDS組粒系和/或單核系表型異常的比例為73.5%（61/83），高于非MDS組的18.2%（14/77），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=49.074，P<0.001）；MDS組MDS表型出現(xiàn)≥2種紅系表型異常比例為60.2%（50/83），高于非MDS組的14.2%（11/77），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=35.760，P<0.001）。

2.2 iFS、Ogata評分診斷MDS的 ROC曲線 81.9%（68/83）的MDS患者iFS評價為C；100%（38/38）的MDS伴原始細胞增多1型（MDS-EB1）和MDS伴原始細胞增多2型（MDS-EB2）評價為C；45例低級別MDS中，42.2%（19/45）的患者Ogata評分≥2分，iFS均評價為C，其余26例（57.6%）患者Ogata評分<2分，按照iFS其中11例評價為C，另有15例（7例MDS-SLD，8例MDS-MLD）未診斷為MDS：3例評價為A，12例為B。不同iFS評價結(jié)果與MDS分類比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=27.930，P<0.001）。各組中iFS評價為A、B、C的患者例數(shù)和百分比見圖1。iFS診斷MDS的AUC為0.921〔95%CI（0.876，0.967）〕，特異度為93.5%，靈敏度為81.9%，約登指數(shù)為0.754；iFS診斷低級別MDS和核型正常的低級別MDS靈敏度分別為66.7%和65.0%，Ogata評分診斷MDS效能見圖2、表4，iFS診斷效能見表5。

圖1 各組中iFS評價為A、B、C的患者數(shù)量和百分比Figure 1 The number and percentage of patients evaluated as A，B，orC by the integrated flow cytometric score in each group

表4 Ogata評分對MDS的診斷效能評估Table 4 The diagnostic efficacy of the Ogata score in myelodysplastic syndrome

表5 iFS對MDS的診斷效能評估Table 5 Diagnostic efficacy of the integrated flow cytometric score in myelodysplastic syndrome

圖2 Ogata評分和iFS診斷MDS、低級別MDS以及核型正常的低級別MDS的ROC曲線Figure 2 ROC curves of the Ogata score and integrated flow cytometric scorein diagnosing myelodysplastic syndrome，low-grademyelodysplastic syndrome，and low-grade myelodysplastic syndrome with normal karyotype

2.3 iFS與MDS預后的相關性 為評價iFS與MDS預后的關系，本研究還試圖發(fā)現(xiàn)iFS與細胞遺傳學、IPSS-R之間的聯(lián)系。81例MDS患者進行了細胞遺傳學風險分類，無核型極好患者，核型好組53例（65.4%），核型中等組12例（14.8%），核型差組6例（7.4%），核型極差組10例（12.3%）。iFS的評價等級與細胞遺傳學風險分類無相關關系（rs=0.047，P=0.676）。由于IPSS-R極低危樣本數(shù)量有限（僅1例極低危），將極低危和低危并為一組，以減少誤差。iFS的評價等級與IPSS-R呈正相關（rs=0.411，P<0.05），見表6。對83例MDS患者進行隨訪，中位隨訪時間12.0（0.2～41.0）個月，評價為C的患者中位無事件生存時間短于評價為A或B的患者（χ2=5.71，P<0.05），見圖3。

表6 iFS評價等級與IPSS-RTable 6 The evaluation grade of the integrated flow cytometric score and Revised International Prognostic Scoring System

圖3 83例iFS評價為A/B和C的MDS患者無事件生存期比較Figure 3 Comparison of the event-free survival in 83 cases of myelodysplastic syndromeevaluated as A/B orC by the integrated flow cytometric score

3 討論

WHO造血和淋巴組織腫瘤分類（2016）[13]列出了MFC檢測MDS的免疫表型異常，包括粒系CD11b/CD13或CD13/CD16成熟發(fā)育模式異常；祖細胞、粒細胞或單核細胞上跨系表達CD56和/或CD7；粒細胞SSc減少；以及幼紅細胞CD71或CD36變異系數(shù)的增加或表達強度的降低等。近幾年多個MDS流式評分系統(tǒng)被開發(fā)出來，應用不同抗原表達和不同評分策略對MDS的診斷評估。以ELN為平臺，多中心大樣本研究提出的Ogata評分[4]分析祖細胞和成熟粒細胞異常，特異度高，靈敏度較低；MATHIS等[14]評估紅系CD36和CD71變異系數(shù)的增加，并結(jié)合Hb水平輔助診斷MDS，靈敏度為88%，特異度為89%，但后續(xù)的研究沒有得到很好的證實[7]；iFS將ELN的MDS流式工作組評價系統(tǒng)[15]和紅系評分[16]相結(jié)合，綜合Ogata評分和各系表型異常加以評價，是迄今為止評價細胞系最全面的MDS診斷評分系統(tǒng)[17]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)iFS判讀各系表型異常，MDS組和非MDS組髓系祖細胞、粒系和/或單核系、紅細胞表型的異常檢出率比較，差異均有統(tǒng)計學意義，均與MDS的診斷顯著相關。CREMERS等[6]研究結(jié)果表明，iFS特異度（95%）優(yōu)于Ogata評分（86.9%），而OELSCHLAEGEL等[7]指出iFS特異度（86%）不如Ogata評分（94%），本研究發(fā)現(xiàn)，iFS特異度（93.5%）基本與Ogata評分（94.8%）相當，可能與不同的抗體組合或人種差異有關。多個研究小組表明，骨髓祖細胞的數(shù)量和免疫表型異常對區(qū)分MDS和非克隆性血細胞減少癥非常有效，原因可能是MDS的本質(zhì)是干細胞的克隆性異常，干祖細胞很大概率會有表型異常，并且與成熟細胞相比，祖細胞受感染或炎癥的影響更小[17-21]。本研究非MDS組中僅有1例（1.3%）患者髓系祖細胞表型異常，而粒系和/或單核系、紅細胞表型異常分別為14例（18.8%）和11例（14.2%），推測祖細胞表型異常對MDS的診斷更具特異性，但仍需要大量研究驗證該推測。Ogata評分≥2分特異性高，iFS在Ogata的基礎上分析髓系祖細胞表型異常，這可能是iFS評價為C同樣特異性較高的原因，即使粒系和/或單核系合并紅細胞表型異?？赡軙绊慽FS的評價結(jié)果。

本研究iFS靈敏度為81.9%，優(yōu)于Ogata評分（68.7%），AUC也優(yōu)于Ogata評分，尤其是在低級別MDS和核型正常的低級別MDS中，iFS將Ogata評分靈敏度從42.2%和40.0%分別提高至66.7%和65.1%，提示iFS是MDS的有效鑒別方法，這與以往研究結(jié)果[6-7]基本一致。45例低級別MDS中Ogata評分<2分為26例，按照iFS判讀其中11例評價為MDS。越來越多的研究顯示，MDS沒有單一特異的免疫表型標志物，干祖細胞[19-21]、成熟粒單系[21-22]和紅系[14，16，23]多種表型異常提示存在潛在的MDS克隆性異常。MDS患者髓系祖細胞CD34表達減少或缺失、CD34<2%但伴有祖細胞表型異常以及僅成熟粒單系和/或紅系發(fā)育不良的情況下，Ogata評分很難達到2分，iFS能識別部分Ogata評分<2分的MDS患者，靈敏度優(yōu)于Ogata評分。

DELLA PORTA等[24]提出Ogata評分可能為低級別MDS提供額外的生存信息；MDS患者的祖細胞、粒細胞和單核細胞發(fā)育不良，與IPSS-R和總生存期均存在相關性[17，22，25]，iFS與預后分層的相關性研究鮮見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)iFS評估等級與IPSS-R呈正相關，iFS為C的患者比例隨著MDS預后評分的升高而增加，15例評價為A或B的患者均屬于IPSS-R低風險或中風險。但是，iFS與細胞遺傳學風險分類無相關性，可能是由于細胞遺傳學亞組中的患者數(shù)量較少，需要增加病例加以分析。另外，對83例MDS患者的治療和生存情況進行隨訪，評價為C的患者無白血病時間或生存時間明顯短于評價為A或B，因此iFS可為MDS提供預后信息，尤其是在骨髓纖維化、骨髓涂片質(zhì)量不佳或染色體無分裂象等原因無法獲得預后評分的情況下。

診斷MDS最大的挑戰(zhàn)是將MDS與血細胞減少和發(fā)育不良的反應性原因分開。MFC提供了一種更客觀可靠的診斷工具，iFS全面地分析各細胞系表型異常，有助于診斷MDS，特別是原始細胞無增加的正常核型MDS。此外，該評分提示疾病預后，為臨床合理治療提供重要的預后依據(jù)，具有重要的臨床意義，可進一步推廣。

本研究首次探索了中國人群中iFS在MDS中的診斷價值，以及iFS與IPSS-R的相關性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iFS診斷MDS的特異度為93.5%，靈敏度為81.9%，診斷低級別MDS、核型正常的低級別MDS的靈敏度分別為66.7%和65.0%，iFS評價等級與IPSS-R呈正相關（rs=0.411，P<0.05）。在骨髓涂片質(zhì)量不佳、病態(tài)造血不明顯或原始細胞不顯著增加的情況下，尤其是在核型正常或無分裂象時，iFS可為MDS提供客觀而可靠的診斷和預后價值。但本研究為單中心研究，樣本數(shù)較少，隨訪時間較短以及少數(shù)患者失訪，發(fā)生死亡的病例數(shù)尚少，需要繼續(xù)隨訪病例并收集更多樣本進行多因素生存分析，以深入評價iFS對MDS的預后意義。

作者貢獻：陳穎進行文章的構(gòu)思與設計，文章的可行性分析，負責收集病例、數(shù)據(jù)整理分析及論文撰寫；李紀鵬負責研究指導、論文修改及經(jīng)費支持，并對文章整體負責、監(jiān)督管理；葉佩佩負責收集病例、臨床指導。

本文無利益沖突。