mNGS技術(shù)和血清G試驗(yàn)在判斷耶氏肺孢子菌感染與定植中的價(jià)值及二者相關(guān)性研究

張彩霞，劉新年，杜川，王新衛(wèi)

耶氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia，PJP）是由耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ）引起的人類呼吸系統(tǒng)機(jī)會(huì)性感染，多發(fā)生于免疫功能低下者。由于PJ不能在體外培養(yǎng)基生長(zhǎng)，故目前確診PJP仍是通過(guò)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)呼吸道標(biāo)本特征性的包囊或滋養(yǎng)體為主，但傳統(tǒng)的染色方法靈敏度不高，使得大部分PJP患者不能得以準(zhǔn)確、快速確診[1]。因此，還需結(jié)合臨床表現(xiàn)以及其他檢測(cè)方法。目前，多項(xiàng)研究顯示血清1，3-β-D葡聚糖定量檢測(cè)（G試驗(yàn)）[2-6]可輔助診斷PJP，且數(shù)值的高低可鑒別PJ定植和感染，數(shù)值越高，感染可能性越大，但鑒別二者的截?cái)嘀瞪袩o(wú)定論。另外，隨著宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）技術(shù)興起，由于該技術(shù)具有廣覆蓋、迅速高敏、無(wú)偏倚性的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于疑難、危重、特殊病原體檢測(cè)[7-9]及感染性疾病診斷中[10-12]，因此提高了PJP的診斷率。盡管mNGS應(yīng)用前景廣闊，但仍存在無(wú)法明確背景菌、污染菌、定植菌、致病菌等情況，尤其PJ可以共生或以正常菌群的形式定植于人體呼吸道，故當(dāng)mNGS檢出PJ序列時(shí)，那么其是定植還是感染呢？其有無(wú)合適的截?cái)嘀涤枰耘袛嗄?？本研究擬通過(guò)比較PJ感染者與定植者的臨床特點(diǎn)以及血清G試驗(yàn)、肺泡灌洗液mNGS序列數(shù)的差異，從而探討肺泡灌洗液mNGS技術(shù)、血清G試驗(yàn)在判斷PJ感染與定植中的價(jià)值以及二者相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對(duì)2018年9月至2022年5月在江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院收治住院治療且行肺泡灌洗液mNGS技術(shù)檢出PJ序列數(shù)的40例肺部感染患者的病例資料進(jìn)行回顧性分析。根據(jù)mNGS檢出PJ是否抗PJ治療分為兩組：PJ感染組（mNGS檢出PJ，抗PJ治療有效者）21例，PJ定植組（mNGS檢出PJ，未抗PJ治療好轉(zhuǎn)出院者）19例。PJP診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、呼吸困難、進(jìn)行性缺氧等；（2）影像學(xué)表現(xiàn)為多發(fā)性結(jié)節(jié)、多發(fā)斑片影或?qū)嵶冇?、磨玻璃樣改變或肺間質(zhì)彌漫浸潤(rùn)病變等；（3）mNGS檢出PJ序列；（4）由兩位及以上具有高級(jí)職稱且經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生共同診斷；（5）抗PJ治療有效。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡<18歲；（2）無(wú)肺部感染及病原學(xué)證據(jù)；（3）mNGS前行經(jīng)驗(yàn)性抗PJ治療者；（4）肺部真菌感染者，嚴(yán)重心臟疾病及嚴(yán)重心律失常者，近1個(gè)月發(fā)生心腦血管事件者，嚴(yán)重精神心理性疾病及無(wú)行為能力不能配合完成肺泡灌洗液mNGS檢查者等；（5）臨床資料不完整；（6）后期隨訪不符合診斷者。本研究通過(guò)江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（2022倫審科第009號(hào)）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 收集患者一般資料包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙史（定義：近1年內(nèi)平均至少吸煙1支/d）、基礎(chǔ)疾病及用藥史〔慢性腎臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、實(shí)體器官移植、慢性肺部疾病、糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑使用情況〕，臨床癥狀（發(fā)熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難、胸痛、咯血），影像學(xué)特點(diǎn)（磨玻璃滲出影、間質(zhì)改變、實(shí)變、結(jié)節(jié)、胸腔積液、囊狀），實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)〔白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、乳酸脫氫酶（LDH），動(dòng)脈血氧分壓/吸入氧濃度百分比（PaO2/FiO2）、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)〕，進(jìn)行血清G試驗(yàn)、半乳甘露聚糖檢測(cè)（GM試驗(yàn)，用于鑒別真菌感染患者）。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液采集 患者禁水、禁食4 h，2%利多卡因噴霧局部麻醉咽部和鼻腔后，在olympusBF-260型電子支氣管鏡下采集支氣管肺泡灌洗液，按《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)（2017年版）》[13]進(jìn)行操作，嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，灌洗部位根據(jù)胸部影像學(xué)確定，病變局限者選擇病變段，彌漫性病變者選擇右肺中葉或左肺上葉舌段。當(dāng)支氣管鏡到達(dá)目標(biāo)支氣管段或亞段后，將頂端嵌頓在入口處，經(jīng)操作孔道快速注入37℃ 0.9%氯化鈉溶液，總量60～120 ml，分次注入（20～50 m1/次），注入后立即以100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）負(fù)壓抽吸，回收率40%～60%，回收的灌洗液裝入滅菌容器中，一份（≥10 ml）送檢進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，一份（≥5 ml）行mNGS檢測(cè)。

1.2.3 mNGS檢測(cè)方法 支氣管肺泡灌洗液干冰保存送至深圳華大基因（mNGS標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸嚴(yán)格按照該公司標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范執(zhí)行）行mNGS檢測(cè)，對(duì)樣本中微生物核酸序列進(jìn)行分析，與該公司病原數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得出報(bào)告結(jié)果序列數(shù)，從而對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。檢測(cè)過(guò)程包括：核酸提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、目標(biāo)片段化、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序（測(cè)序下機(jī)后去除低質(zhì)量和長(zhǎng)度<35 bp的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)）、生物信息分析、報(bào)告解讀等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，采用Mann-whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)、校正χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線評(píng)估m(xù)NGS與血清G試驗(yàn)判斷PJ感染與定植的價(jià)值，計(jì)算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）、靈敏度、特異度、最佳截?cái)嘀?。采用Spearman秩相關(guān)分析mNGS與血清G試驗(yàn)相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料、基礎(chǔ)疾病及用藥史比較 兩組性別、年齡、BMI、吸煙史、基礎(chǔ)疾病情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；PJ感染組糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑使用率較PJ定植組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料、基礎(chǔ)疾病及用藥史比較Table 1 Comparison of general information，underlying diseases and medication history between two groups

2.2 臨床癥狀及影像學(xué)特點(diǎn)比較 PJ感染組與PJ定植組發(fā)熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難、胸痛、咯血比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PJ感染組磨玻璃滲出影、間質(zhì)改變比例高于PJ定植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組實(shí)變、結(jié)節(jié)、胸腔積液、囊狀比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組患者臨床癥狀及影像學(xué)特點(diǎn)比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of clinical symptoms and imaging characteristics between two groups

2.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 兩組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、PCT、CRP、LDH、PaO2/FiO2比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；PJ感染組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于PJ定植組，血清G試驗(yàn)、mNGS序列數(shù)高于PJ定植組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表3）。

表3 兩組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較Table 3 Comparison of laboratory indicators between two groups

2.4 mNGS序列數(shù)與血清G試驗(yàn)鑒別PJ感染與定植的價(jià)值 mNGS序列數(shù)與血清G試驗(yàn)鑒別PJ感染與定植的最佳截?cái)嘀捣謩e為24個(gè)、106.7 ng/L，AUC分別為0.95、0.89，靈敏度分別為95.2%、76.2%，特異度分別為78.9%、89.5%（圖1、表4）。

表4 mNGS序列數(shù)與血清G試驗(yàn)鑒別PJ感染與定植的價(jià)值Table 4 Value of the number of sequences of pneumocystis jirovecii detected by mNGS and serum G level measured by serum G test in differentiating pneumocystis jirovecii infection from colonization

圖1 mNGS序列數(shù)與血清G試驗(yàn)鑒別感染與定植ROC曲線Figure 1 The ROC curve of the number of sequences of pneumocystis jirovecii detected by mNGS and serum G level measured by serum G test in differentiating pneumocystis jirovecii infection from colonization

2.5 血清G試驗(yàn)與mNGS序列數(shù)相關(guān)性分析Spearman秩相關(guān)結(jié)果示mNGS檢出PJ序列數(shù)與血清G試驗(yàn)水平呈正相關(guān)（rs=0.769，P<0.001，圖2）。

圖2 mNGS檢出PJ序列數(shù)與血清G試驗(yàn)的相關(guān)性Figure 2 Correlation between the number of pneumocystis jirovecii sequences detected by mNGS and serum G level measured by serum G test

3 討論

由于呼吸道PJ定植相當(dāng)普遍[14-15]，為避免臨床過(guò)度治療及延誤治療，識(shí)別定植與感染很重要。本回顧性研究通過(guò)比較PJ感染與定植不同之處，以期能為臨床鑒定感染與定植提供依據(jù)。

在一般資料、基礎(chǔ)疾病、用藥史方面，本研究發(fā)現(xiàn)19例PJ定植組和21例PJ感染組絕大多數(shù)來(lái)自免疫缺陷患者如HIV感染、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、實(shí)體器官移植、自身免疫性疾病、長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑者等，部分來(lái)自慢性肺部疾病，另外定植組尚可見(jiàn)于免疫功能正常人群。因此，PJ感染或定植除需重點(diǎn)關(guān)注免疫抑制個(gè)體人群外，尚需關(guān)注慢性肺部疾病。BABIC-ERCEG 等[16]及LOWE等[17]的研究亦提示PJ感染或定植與慢性阻塞性肺疾病、肺囊性纖維化以及間質(zhì)性肺炎等多種呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。可見(jiàn)，慢性肺部疾病在PJ感染或定植中亦扮演一定角色。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)PJ感染組約52.4%患者接受過(guò)糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑治療，而PJ定植組19例中僅有1例使用過(guò)糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑，提示長(zhǎng)期應(yīng)用此類藥物可能是PJ感染的高危因素。因此，當(dāng)存在上述基礎(chǔ)疾病，尤其接受糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑治療的患者應(yīng)該警惕PJP的發(fā)生。

在臨床表現(xiàn)方面，本研究發(fā)現(xiàn)PJ感染組與定植組在臨床癥狀如發(fā)熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難、胸痛、咯血等癥狀間并無(wú)明顯差異，提示通過(guò)臨床癥狀無(wú)法區(qū)分二者。近年來(lái)，臨床上常用肺部影像學(xué)改變、血液中CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清G試驗(yàn)、LDH等[18-19]指標(biāo)輔助診斷或預(yù)測(cè)PJP。本研究發(fā)現(xiàn)PJ感染組典型磨玻璃滲出影、間質(zhì)改變高于PJ定植組，但兩組影像學(xué)特點(diǎn)如實(shí)變、結(jié)節(jié)、胸腔積液、囊狀改變間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，本研究中兩組LDH并無(wú)差異性，與ESTEVES等[2]研究一致，提示靠LDH無(wú)法鑒別定植與感染，分析原因可能為L(zhǎng)DH升高更多反映的是肺組織損傷的嚴(yán)重程度，不具特異性。但血清G試驗(yàn)PJ感染組明顯高于定植組，與LIU等[20]研究一致，分析原因可能與當(dāng)PJ感染后經(jīng)肺泡巨噬細(xì)胞吞噬、消化，1，3-β-D葡聚糖從胞壁中釋放入血有關(guān)。另本研究發(fā)現(xiàn)PJ感染組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于定植組，幾乎所有PJP患者的外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μl，而且發(fā)現(xiàn)此部分患者mNGS檢出PJ序列數(shù)明顯高于定植組。因此，對(duì)于某些免疫功能低下的患者，在治療過(guò)程中需密切監(jiān)測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，一旦CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢(shì)時(shí)，需警惕PJ感染，此時(shí)可結(jié)合影像學(xué)、血清G試驗(yàn)、mNGS檢查來(lái)判斷。

鑒于多項(xiàng)研究[4-6]顯示血清G試驗(yàn)對(duì)于診斷PJP以及判斷治療效果有一定的價(jià)值。而DAMIANI等[21]人發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以根據(jù)PJ序列數(shù)不同來(lái)區(qū)分PJ感染或定植，但是序列數(shù)的臨界值很難確定?；诖?，是否可以根據(jù)mNGS檢出PJ序列數(shù)及血清G試驗(yàn)來(lái)區(qū)分PJ感染和定植呢，其鑒別二者的臨界值又如何呢。本研究以臨床最終診斷PJP感染與定植為“金標(biāo)準(zhǔn)”，發(fā)現(xiàn)mNGS序列數(shù)與血清G試驗(yàn)鑒別感染與定植的最佳截?cái)嘀捣謩e為24個(gè)、106.7 ng/L，AUC分別為0.95、0.89，靈敏度分別為95.2%、76.2%，特異度分別為78.9%、89.5%。同時(shí)，本研究分析了血清G試驗(yàn)與mNGS檢出PJ序列數(shù)相關(guān)性，以期了解血清G試驗(yàn)與PJ負(fù)荷是否相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)mNGS檢出PJ序列數(shù)與血清G試驗(yàn)水平呈正相關(guān)，與JIANG等[22]研究一致，但與HELD等[23]和LIU等[20]的研究不同，他們認(rèn)為血清G試驗(yàn)與PJ負(fù)荷并不相關(guān)。分析造成差異的原因可能為：1，3-β-D葡聚糖并非PJ特異性標(biāo)志物，且各研究間納入分組標(biāo)準(zhǔn)及樣本量不同。因此，本研究提示血清G試驗(yàn)與mNGS除可以輔助診斷PJP外，尚可將PJ感染與定植區(qū)分，當(dāng)血清G試驗(yàn)水平≥106.7 ng/L、mNGS檢出PJ序列數(shù)≥24個(gè)時(shí)，診斷PJ感染價(jià)值較大，mNGS檢出PJ序列數(shù)與血清G試驗(yàn)水平呈正相關(guān)。

PJ定植相當(dāng)普遍，臨床上如何鑒別定植與感染是一大難題，本研究通過(guò)比較PJ感染者與定植者間臨床特點(diǎn)、血清G試驗(yàn)、肺泡灌洗液mNGS序列數(shù)的差異，從而探索血清G試驗(yàn)及肺泡灌洗液mNGS序列數(shù)判斷PJ感染與定植的價(jià)值，并求得截?cái)嘀担瑸榕R床判斷定植與感染提供了幫助，避免過(guò)度治療及延誤治療。但本研究亦存在一定局限性：（1）mNGS報(bào)告的解讀，尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，盡管本研究嘗試了判斷PJ感染與定植的mNGS序列數(shù)截?cái)嘀?，但由于受樣本量小的局限，未?dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清G試驗(yàn)與mNGS中PJ序列數(shù)變化以了解其對(duì)評(píng)估治療療效有無(wú)價(jià)值。今后需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。（2）對(duì)于判斷PJ感染與定植，無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的診斷參數(shù)，本研究以是否抗PJ治療有效且經(jīng)隨訪確認(rèn)，故可能存在一定選擇偏倚。

綜上，考慮鑒別PJ感染與定植的模型可能包含：（1）免疫缺陷，尤其糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑使用；（2）影像學(xué)表現(xiàn)為典型磨玻璃滲出影、間質(zhì)改變；（3）外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，尤其<200個(gè)/μl；（4）血清G試驗(yàn)升高；（5）mNGS檢出PJ序列數(shù)。血清G試驗(yàn)及mNGS檢出PJ序列數(shù)數(shù)值越高，感染可能性越大，血清G試驗(yàn)與PJ負(fù)荷呈正相關(guān)。今后研究方向：擴(kuò)大樣本量，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清G試驗(yàn)與mNGS中PJ序列數(shù)變化，了解其對(duì)評(píng)估治療療效有無(wú)價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)：張彩霞進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文章的可行性分析，文獻(xiàn)及資料收集、整理，撰寫論文；劉新年進(jìn)行論文的修訂；杜川協(xié)助采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)；王新衛(wèi)負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，技術(shù)支持，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。