氧化應激和能量代謝與中國男性精子質量的關聯性研究

趙曉龍，牛治平，譚繼東，韓東暉，楊發(fā)，溫偉紅，王安輝，秦衛(wèi)軍*

精子質量下降已經成為影響全球成年男性生殖健康的嚴重問題[1-5]。根據最近的一項Meta分析，在過去的40年，全球成年男性平均精子數量和精子密度分別下降了60%和52%，而且這一下降趨勢仍在繼續(xù)[2]。除了精子數量和密度快速下降外，精子活力的迅速下降使得男性生殖健康問題更加嚴重[6]。一項隊列研究收集了489例美國城市成年男性的9 425份精液樣本，結果發(fā)現2003—2013年精子總數和總活力均顯著下降[6]。鑒于男性生殖健康問題日益嚴重，探討其危險因素及其生物學機制具有重要意義[1]。

雖然精子質量下降的具體生物學機制尚未被闡明[7]，但氧化應激和能量代謝可能是其主要機制[8-10]。有研究表明，氧化應激升高和能量代謝降低與精子質量下降顯著相關[11-13]。一項病例對照研究招募了79例畸形精子癥患者和56例健康者，發(fā)現畸形精子癥患者精漿的氧化應激水平顯著高于健康男性[12]。30%～80%的男性不育是氧化應激導致的精子損傷[14]。同時，能量代謝在精子生成和精子運動中起著關鍵作用[15]。一項應用維生素D干預的研究表明，較高水平的三磷酸腺苷（ATP）與前向運動精子率的增加顯著相關[16]，可能通過改善精子線粒體氧化呼吸鏈的功能狀態(tài)來發(fā)揮作用。同時，精子運動速度和運動軌跡是評估男性生殖健康的客觀依據，一項在不育男性人群的橫斷面研究中發(fā)現精漿中白細胞異常組與正常組之間精子的運動速度和運動軌跡存在顯著差異[17]。然而，這些研究主要多基于動物實驗研究，缺少來自人群的流行病學證據，而且氧化應激和能量代謝主要影響精子運動速度或運動軌跡的哪些具體參數仍不清楚。因此，本研究開展了一項橫斷面調查，系統(tǒng)評估氧化應激和能量代謝水平對男性精子質量各個參數的影響，從而識別氧化應激和能量代謝水平主要引起精子哪些參數的改變。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2021年6—12月在空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院生殖醫(yī)學中心進行精液質量檢查的就醫(yī)者中招募109例志愿者作為研究對象。研究對象納入標準：（1）進行孕前檢查精液質量的初診男性；（2）年齡18～50歲；（3）自愿參加本次調查研究。排除標準：隱睪、患有精索靜脈曲張、未治愈的生殖系統(tǒng)感染或既往診斷為無精癥的患者。本研究由空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（KY20223104-TEMP），并在研究前取得所有志愿者的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 研究對象完成簡易的一般資料調查問卷，包括出生年月、學歷、身高、體質量、吸煙和飲酒狀況。其中吸煙定義為每天吸煙1支及以上，連續(xù)或累計6個月，飲酒定義為平均每周飲酒1次及以上[18]。

1.2.2 精液樣本采集 研究對象在禁欲3～7 d后，通過手淫的方法將采集的精液樣本置于無菌廣口精液收集瓶內，精液樣本保存在37 ℃的恒溫箱中，并在精液樣本完全液化后立即進行精子質量分析和氧化應激、能量代謝標志物的檢測。

1.2.3 精子質量分析 精子質量分析按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢驗與處理實驗室手冊》[19]進行。采集的精液樣本由專業(yè)的檢驗師首先觀察精液樣本的精液量、顏色、黏度和液化情況，并將其登記在電子系統(tǒng)中。待精液完全液化后，將每個志愿者的精液樣本取3 μl置于一次性精子檢測板（賽斯醫(yī)療技術北京有限公司），使用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）（賽斯醫(yī)療，SAS）和SASII?2.3版本軟件評估精子密度參數（精子密度、直線運動精子密度）、精子活動力參數〔精子總活力、前向運動率（PR）、非前向運動率（NP）〕、精子運動速度參數〔曲線速度（VCL）、直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）〕和精子運動軌跡參數〔平均側擺幅值（ALH）、平均鞭打頻率（BCF）、平均移動角度（MAD）、運動的直線性（LIN）、運動的擺動性（WOB）、運動的前向性（STR）〕，CASA檢測精子多項運動參數示意圖見圖1。

圖1 CASA檢測精子多項運動參數示意圖Figure 1 Schematic diagram of the computer-assisted sperm analysis system for detecting multiple sperm movement parameters

為確保精子質量檢測結果的可靠性，本研究精子質量檢測工作均采用同一精子質量分析儀完成。該精子質量分析儀已通過西北生殖醫(yī)學專科聯盟精子分析室間質量控制評估，為合格在控狀態(tài)。本研究所有精子質量檢測由同一檢驗技師完成，以避免人員誤差。此外，本研究所采用的精子質量分析儀的質量控制，每月使用標準濃度玻璃粉校準濃度，利用錄制的精液樣本標準視頻錄像校準精子活動力，并將CASA系統(tǒng)的結果與人工方法進行比較進行誤差分析。研究期間該研究所采用的精子質量分析儀均符合誤差要求。

1.2.4 氧化應激和能量代謝評估 氧化應激評估：將精液質量分析剩余的精液樣本在室溫下800×g離心15 min后，取精液上清液2 ml于EP管，后10 000×g離心30 min，取上清液，使用丙二醛（MDA）試劑盒（#BC0025，Solarbio，北京）和還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（#BC1175，Solarbio，北京）對精液樣本的氧化應激水平進行檢測。較高水平的MDA代表較高的氧化應激水平；GSH水平越高，表明抗氧化水平越高，氧化應激水平越低。

能量代謝評估：將精液質量分析剩余的精液樣本在室溫下800×g離心15 min，棄上清液，沉淀用2 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，緩慢加入盛有2 ml 50%Percoll溶液的15 ml離心管中，在室溫下1 000×g離心20 min。去掉上清液后，加入2 ml PBS洗滌1次，獲得最終沉淀物，立即使用增強型ATP分析試劑盒（#S0027，Beyotime，上海）對精液樣本的能量代謝水平進行檢測。ATP水平越高，表明精液樣本用于精子運動和結合的能量供應越好。

因單次可采集的精液量有限，并且精液樣本放置時間過長或凍融均會影響精液樣本氧化應激和能量代謝水平的準確性，本研究將采集的精液樣本分為兩部分，檢測精液樣本中氧化應激標志物（MDA和GSH）表達水平作為氧化應激組（n=67），檢測精液樣本中能量代謝標志物（ATP）表達水平作為能量代謝組（n=42）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用R 4.1.2統(tǒng)計學軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，非正態(tài)分布的計量資料以M（QR）表示；計數資料以相對數表示。繪制一般線性模型（GLM）分析MDA、GSH和ATP與精子質量各項參數的相關性。效應值表示為MDA每增加1 nmol/ml、GSH每增加10 mg/L、ATP水平每增加1 nmol/mg蛋白，男性精子質量各項參數的改變及95%置信區(qū)間（95%CI）。為了調整潛在的混雜因素并檢驗結果的穩(wěn)定性，本研究統(tǒng)計模型包括粗模型和調整模型。首先在沒有納入任何協變量的情況下進行GLM模型擬合（粗模型）。參考以往男性精子質量的研究[20-21]，將研究采集的精液量、研究對象的年齡、體質指數（BMI）、受教育程度、吸煙和飲酒狀況作為協變量納入模型（調整模型）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基本特征及氧化應激、能量代謝和精子質量參數結果 本研究共納入109例成年男性。氧化應激組MDA為2.78（1.69） nmol/ml，GSH為113.54（74.21）mg/L。能量代謝組ATP為6.61（2.26） nmol/mg蛋白。見表1。

表1 研究對象基本特征、氧化應激、能量代謝和精子質量參數結果Table 1 Statistical description of basic demographics，oxidative stress，energy metabolism and sperm quality parameters in subjects

2.2 氧化應激與精子質量各參數的關系 MDA水平與精子質量各參數的相關性上，粗模型結果顯示，在精子活動力方面，MDA水平與PR、NP、精子總活力呈負相關（P<0.05）；在精子運動速度方面，MDA水平與VCL、VSL、VAP呈負相關（P<0.05）；精子運動軌跡方面，MDA水平與精子ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR呈負相關（P<0.05）。在調整了研究對象的年齡、學歷、BMI、吸煙、飲酒和精液量差異后，精子密度方面，MDA水平與直線運動精子密度呈負相關（P<0.05），其余結果均與粗模型結果一致。MDA水平與精子質量各參數的關系詳見表2。

GSH水平與精子質量各項參數相關性上，粗模型結果顯示，在精子密度方面，GSH水平與精子密度和直線運動精子密度呈正相關（P<0.05）；在精子活動力方面，GSH水平與PR、精子總活力呈正相關（P<0.05）；在精子運動速度方面，GSH水平與精子VSL、VAP呈正相關（P<0.05）；精子運動軌跡方面，GSH水平與精子ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR呈正相關（P<0.05）。在調整了研究對象的年齡、學歷、BMI、吸煙、飲酒和精液量差異后，在精子密度參數方面，GSH水平與精子密度無相關性（P>0.05），其余結果均與粗模型一致。GSH水平與精子質量各項參數的關系詳見表3。

表3 精漿中GSH水平與精子密度、活動力、運動速度和運動軌跡的關系Table 3 Correlation of reduced glutathione in seminal plasma with sperm concentration，motility，movement velocity and trajectory

2.3 能量代謝與精子質量各參數的關系 能量代謝與精液質量各參數相關性上，粗模型結果顯示，在精子密度方面，ATP水平與直線運動精子密度呈正相關（P<0.05）；在精子活動力方面，ATP水平與PR、NP、精子總活力呈正相關（P<0.05）；在精子運動速度方面，ATP水平與精子VCL、VSL、VAP呈正相關（P<0.05）；精子運動軌跡方面，ATP水平與ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR均呈正相關（P<0.05）。在調整了研究對象的年齡、學歷、BMI、吸煙、飲酒和精液量差異后調整模型結果均與粗模型一致。ATP水平與精子質量各項參數的關系詳見表4。

表4 精子ATP水平與精子密度、活動力、運動速度和運動軌跡的關系Table 4 Correlation of ATP level in sperm with sperm concentration，motility，movement velocity and trajectory

3 討論

本研究探討了氧化應激和能量代謝對男性精子質量多項參數的影響。精液中MDA、GSH和ATP水平與精子活動力、運動速度和軌跡多項參數存在顯著相關性。以往研究主要探究了氧化應激和能量代謝對男性精子密度和活動力的影響，本研究系統(tǒng)地分析了精液氧化應激和能量代謝水平與男性精子密度、活動力、運動速度和運動軌跡10多項參數之間的相關性，提示可以通過應用降低氧化應激和提高能量代謝的補充劑改善男性精子質量，為促進男性生殖健康提供流行病學證據。

本研究表明，精液中的MDA和GSH水平與精子活動力、運動速度以及軌跡改變存在相關性。根據相關研究可知，MDA和GSH是氧化應激主要且研究最多的產物[22-23]。MDA是多不飽和脂肪酸過氧化常見的產物之一，已被廣泛用于評估氧化應激的水平[22]，并被認為是精漿脂質過氧化的直接指標[24]，較高水平的MDA代表嚴重的氧化應激水平。本研究結果表明，較高的MDA水平與較低的精子活動力、較低的精子運動速度和不良的軌跡改變相關，證明了過高的氧化應激水平對男性生殖健康的不利影響。一些研究報道了MDA與精子質量呈負相關[24-26]。例如，一項居住在波蘭的346例男性的橫斷面研究發(fā)現，患有弱精子癥的男性的MDA水平較對照組高12%[25]。GSH是保護脂質、蛋白質和核酸免受氧化損傷的非酶抗氧化防御系統(tǒng)的一部分[23]。GSH水平越高，表明抗氧化水平越高，氧化應激狀態(tài)越低，在一些研究中GSH也被用作生殖健康的重要生物標志物[27-28]。ATIG等[28]對250例成年男性開展的前瞻性研究發(fā)現健康男性的GSH水平顯著高于不育患者組；此外，該研究還指出GSH與精子總活力及精子密度顯著相關；較高的GSH水平與較好的精子質量和較低的生育風險相關，本研究結果與該研究一致。綜上所述，氧化應激對精子質量和男性生殖健康起著至關重要的作用。盡管氧化應激對精子質量的具體生物學機制尚不清楚，但不能忽視其對精子染色質破壞、精子膜過氧化和精子細胞凋亡增加的影響[29-30]。

ATP是精子功能的主要供能物質[31-33]。ATP水平越高越有利于精子產生足夠的能量來克服女性生殖通道中的物理障礙，到達卵母細胞，并穿透其透明帶[16]。本研究結果表明，較高的ATP水平與較高的精子活動力、較高的運動速度和軌跡正向變化相關，這表明能量代謝對男性精子質量有顯著影響。SHAN等[34]收集60例正常精子者和50例弱精子癥男性，發(fā)現弱精子癥患者組ATP水平顯著低于正常組〔（234.74±81.21）μmol/mg與（ 437.38±142.54）μmol/mg〕。JUERAITETIBAIKE等[16]開展了一項探討維生素D對精子活動力影響的研究，發(fā)現ATP水平的升高與精子的PR顯著相關。雖然ATP對精子質量產生影響的具體生物學機制尚不清楚，但已有試驗表明，呼吸鏈復合體活性的下降[35]、線粒體膜電位的降低[36-38]、線粒體DNA的改變[39]以及活性氧[40-41]對線粒體的損傷是關鍵機制。

本研究首次系統(tǒng)地評估了氧化應激和能量代謝水平對精子密度、活動力、運動速度和運動軌跡等多項參數的影響，研究將為全面了解氧化應激和能量代謝對男性生殖健康的影響提供參考。然而，本研究也存在一定局限性：首先，研究對象為醫(yī)院生殖醫(yī)學中心就診的育齡男性，盡管選取孕前檢查的初診志愿者，但也不能完全排除伴有生殖健康問題的志愿者，這與健康人群之間存在一定偏差。其次，因為參加精子質量檢查的門診志愿者不愿透露更多私人信息，本研究未能收集到研究對象的職業(yè)、生育情況和詳細生活習慣等信息，這導致研究中可能存在一些混雜因素。但本研究將研究者的年齡、學歷、BMI、吸煙、飲酒和精液量參數作為協變量納入調整模型，且調整模型的大多數結果與粗模型一致，表明本研究的結果是穩(wěn)定的。再次，本研究只納入了67份精液樣本用于氧化應激檢測，42份精液樣本用于能量代謝檢測，未來需要開展基于更大樣本量的研究來證實本研究的結果。最后，本研究采用了橫斷面研究設計，無法進行因果關系推斷，未來需要開展隊列研究來驗證本研究的發(fā)現。

綜上所述，較高的氧化應激水平與精子活動力降低、精子運動速度減慢以及運動軌跡發(fā)生不利改變有關，而較高的ATP水平與男性精子活動力升高、運動速度加快以及運動軌跡發(fā)生有利改變有關。針對日益嚴重的男性生殖健康問題，本研究提示通過應用降低氧化應激和提高能量代謝的補充劑可改善男性精子質量，為男性生殖健康的精準干預、保障我國人口穩(wěn)定提供科學依據。

作者貢獻：趙曉龍、牛治平負責病例資料收集和整理，并撰寫論文初稿；譚繼東負責試驗結果整理；韓東暉提出研究選題方向；楊發(fā)、溫偉紅負責論文的修訂；王安輝、秦衛(wèi)軍負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責。

本文無利益沖突。