普魯蘭酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉含量酶解工藝優(yōu)化

李 巖，孫康娜，宋曉凡，陳富章，金蘇宇，院珍珍，2

（1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810000）

青稞俗稱裸大麥，是青藏高原一種常見的糧食作物，具有耐高寒、適應(yīng)性強、高產(chǎn)早熟等特點[1]。特殊的生長環(huán)境賦予其高蛋白、高纖維、高維生素和低脂肪、低糖的三高兩低特性和富含β-葡聚糖等功能因子，具有很好的營養(yǎng)功能[2-3]，對預(yù)防心血管疾病、糖尿病等有顯著作用[4-6]。

淀粉是青稞的重要組成成分，被人體分解利用，供給人體熱量，因其消化性不同可以分為快消化淀粉（ready digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）和抗性淀粉（resistant starch，RS）三類[7]，快消化淀粉是指在小腸中20 min內(nèi)消化；慢消化淀粉是指能在小腸中20～120 min內(nèi)才能被消化；抗性淀粉指120 min內(nèi)無法在小腸中消化吸收。研究表明，快消化淀粉（RDS）作為日常主食的主要成分，使人很快饑餓增加食欲從而容易引致肥胖和影響脂類新陳代謝；慢消化淀粉（SDS）能夠緩慢釋放能量，可以保證飯后血糖的相對穩(wěn)定，避免造成大幅度的波動引起血糖過高和過低的現(xiàn)象，有益于高血壓、糖尿病和肥胖患者病情調(diào)控[8-9]；抗性淀粉（RS）作為一種新型的膳食纖維功能性成分，具有降低血糖指數(shù)、改善結(jié)腸微生物群落的潛力[10]。因此，降低快消化淀粉含量、提高慢消化淀粉含量的研究對人體健康有重要意義。青稞淀粉約占青稞籽粒干質(zhì)量的70%左右[11]，而快消化淀粉占青稞淀粉的75.17%、慢消化淀粉占青稞淀粉的12.32%、抗性淀粉占青稞淀粉的12.51%?？赏ㄟ^改性而改變淀粉的分子結(jié)構(gòu)、功能性、消化性等，制備成為青稞改性淀粉，從而擴大青稞淀粉的應(yīng)用[12]。改變淀粉結(jié)構(gòu)的方法有物理法、化學(xué)法、酶法、加工處理（如常壓、高壓蒸煮）等[13]。其中酶法具有效率高、能耗低、污染小等特點[14]。安攀宇[15]使用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶制備青稞慢消化淀粉，發(fā)現(xiàn)當(dāng)普魯蘭酶添加量為200 U時慢消化淀粉含量達到最高值；張倩倩[11]利用酶解法制備青稞慢性消化淀粉并進行工藝優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶的添加量200 U，酶解時間10 h，冷藏回生時間1 d，淀粉含量為15%時，慢消化淀粉含量為32.72%。GURAYA H S等[16]利用普魯蘭酶處理大米淀粉，結(jié)果顯示慢消化淀粉的含量增加。

本試驗以青稞為原料，通過普魯蘭酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉（RDS）含量?？疾烀柑砑恿?、料液比、酶解時間和溫度對青稞快消化淀粉含量的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以快消化淀粉含量為響應(yīng)值，選擇3因素3水平的響應(yīng)面試驗探究最優(yōu)酶解工藝參數(shù)，以期拓展青稞在食品上的應(yīng)用，推進高原健康食品的發(fā)展，對糖尿病患者及需低糖飲食人群有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萌芽黑青稞粉：青海漢和生物科技股份有限公司；普魯蘭酶（酶活力1 500 U/mL）、糖化酶（酶活力10萬U/mL）：江蘇銳陽生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力70萬U/mL）：上海吉至生化科技有限公司；豬胰α-淀粉酶（酶活力50 U/mg）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；淀粉含量檢測試劑盒（50T/48S）：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LR10M 冷凍離心機、H/T16MM 臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；THZ-82恒溫振蕩器：國華實業(yè)有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；Tissuelyser-96多樣品組織研磨儀：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；MULTISKAN Sky全波長酶標儀：北京平利洋經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 改性青稞粉的制備

酶改性青稞粉的制備參照王曉燕等[17]的方法并稍作修改。稱取6 g青稞粉溶于50 mL蒸餾水中并攪拌至無結(jié)塊，加入1 mol/L pH 5.2的乙酸鈉緩沖溶液（稱取6.804 g乙酸鈉蒸餾水溶解，后加入1.118 5 mL的乙酸，定容至50 mL）5 mL，加入一定量的普魯蘭酶和α-葡萄糖苷酶，然后立即放入溫度為65 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩器中振蕩2 h。反應(yīng)結(jié)束后立即將錐形瓶放入沸水浴鍋里滅酶10 min，冷卻后將錐形瓶中的樣品轉(zhuǎn)移到300 mL離心管中再入50 mL洗滌液，放入離心機中5 000 r/min離心10 min，得到的固體用蒸餾水洗滌并再次離心，重復(fù)2次，結(jié)束后取出沉淀物于平皿中，然后放入60 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干，采用多樣品組織研磨儀，在50 Hz條件下研磨70 s，備用。

1.3.2 酶添加量的確定

普魯蘭酶添加量的確定：在酶解溫度為65 ℃、料液比為1∶10（g∶mL）、酶解時間為2 h條件下，分別測定普魯蘭酶添加量分別為120 U/g、160 U/g、200 U/g、240 U/g、280 U/g時的快消化淀粉含量。

α-葡萄糖苷酶添加量的確定：選取最適普魯蘭酶添加量，在酶解溫度為65 ℃、料液比為1∶10（g∶mL）、酶解時間為2 h條件下，分別測定葡萄糖苷酶添加量分別為20 U/g、50 U/g、80 U/g、110 U/g、140 U/g時的快消化淀粉含量。

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化單因素試驗

在選出最佳雙酶添加量基礎(chǔ)上，以快消化淀粉含量為評價指標，分別考察酶解溫度（45℃、55℃、65℃、75℃、85℃）、酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）及料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））對酶解效果的影響。

1.3.4 酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定普魯蘭酶添加量為200 U/g，酶解溫度為55 ℃，選取α-葡萄糖苷酶添加量（A）、料液比（B）以及酶解時間（C）3個因素為自變量，以快消化淀粉含量（Y）為響應(yīng)值，采用3因素3水平中心組合設(shè)計，優(yōu)化酶降解青稞快消化淀粉酶解工藝，響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.3.5 總淀粉含量的測定

采用淀粉含量檢測試劑盒法測定總淀粉（total starch，TS）含量。以0.10mg/mL、0.05mg/mL、0.04mg/mL、0.03mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，以波長620 nm處測定的吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到標準曲線線性回歸方程：y=12.192x+0.002，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2?？偟矸酆坑嬎愎饺缦拢?/p>

式中：TS為總淀粉含量，mg/g；X為測得的吸光度值對應(yīng)標準曲線的葡萄糖含量，mg/mL；D為稀釋倍數(shù)1 000；V為提取后總體積，mL；W為稱取的改性青稞粉質(zhì)量，g。1.11為換算系數(shù)。

1.3.6 快消化淀粉含量的測定

快消化淀粉含量體外模擬消化參考繆銘等[18]的方法，并稍作修改。稱取酶改性青稞粉0.2 g，加入0.2 mol/L pH 5.2的乙酸鈉緩沖溶液（稱取6.804 g乙酸鈉蒸餾水溶解，后加入1.118 5 mL的乙酸，定容至250 mL）15 mL，同時加入5顆玻璃珠，加入混酶液10 mL。立即放入37 ℃的恒溫振蕩鍋中150 r/min分別反應(yīng)0、20 min后，取出沸水浴滅酶10 min，放入冷水中冷卻至常溫。取體外模擬消化后的溶液2 mL于離心管中，放入離心機4 500 r/min離心15 min，取上清液100 μL，加入900 μL蒸餾水后，加2 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS），沸水浴反應(yīng)5 min后，冷水循環(huán)冷卻至室溫后加入12 mL蒸餾水，混勻，使用紫外分光光度儀在波長540 nm處測定吸光度值，每個樣品分別做3組平行，并設(shè)置空白對照組，取平均值，快消化淀粉含量計算公式如下：

式中：G20為樣品酶解20 min時的葡萄糖含量，mg/g；G0為樣品酶解0 min 時葡萄糖的含量，mg/g；0.9為還原糖（以葡萄糖計）換算成淀粉的換算系數(shù)；TS為總淀粉含量，mg/g。

式中：G為葡萄糖含量，mg/g；At為吸光度值；D為稀釋倍數(shù)1 500；W為測定時稱取的青稞粉質(zhì)量，g。

1.3.7 改性青稞粉體外降血糖活性測定

（1）α-淀粉酶抑制率測定

參照梁宗瑤等[19]的方法，準備150 μL的樣品液和0.5 mg/mL的α-淀粉酶液150 μL，混合均勻后于37 ℃孵育10 min，然后將250 μL的1%的可溶性淀粉溶液加入混合液中，并在37 ℃繼續(xù)孵育10 min，加入500 μL的DNS停止反應(yīng)，在沸水浴中反應(yīng)5 min。冷卻后取200 μL于96孔板中，使用酶標儀在波長540 nm處測定吸光度值，每個樣品做3個平行，并設(shè)置空白對照，取平均值，α-淀粉酶抑制率計算公式如下：

式中：a為含有α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的測定吸光度值；b為不含α-葡萄糖苷酶溶液含有待測樣品的測定吸光度值；c為含有α-葡萄糖苷酶溶液卻不含待測樣品的測定吸光度值。

（2）α-葡萄糖苷酶抑制率測定

參照賴曉樺等[20]的方法，稱取0.05 g改性青稞粉，加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 6.8）600 μL，滴加300 μL 20 mmol/L的對硝基苯-α-D-吡咯葡萄糖苷（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，pNPG）溶液；并在37 ℃振蕩水浴鍋中反應(yīng)20 min，后滴加0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液200 μL，室溫反應(yīng)10 min后，加入反應(yīng)終止液0.1 mol/L Na2CO31.65 mL，并在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速條件下離心10 min，吸取200 μL上清液于96孔板中，用酶標儀于波長405 nm處測定其吸光度值。本試驗中的空白對照為pH 6.8、0.05 mol/L PBS溶液。α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式如下[18]：

式中：a為含有α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的測定吸光度值；b為不含α-葡萄糖苷酶溶液含待測樣品的測定吸光度值；c為含有α-葡萄糖苷酶溶液不含樣品的測定吸光度值；d為不含α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的測定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 普魯蘭酶添加量的確定

由圖1可知，當(dāng)普魯蘭酶添加量在120～200 U/g時，快消化淀粉含量隨著普魯蘭添加量的增大而下降；當(dāng)普魯蘭酶添加量在200 U/g時，快消化淀粉含量最低，為57.14%；當(dāng)普魯蘭酶添加量＞200 U/g之后，快消化淀粉含量有所上升。酶解產(chǎn)物積累至一定程度會反向抑制酶解，隨著添加量的增加，快消化淀粉含量逐漸增加，增加趨勢較大。普魯蘭酶酶解會增加直鏈淀粉含量[21]，直鏈淀粉比例與抗性淀粉含量呈正相關(guān)[22-24]，從而造成快消化淀粉含量減少。綜上，確定最適的普魯蘭酶添加量為200 U/g。

圖1 普魯蘭酶添加量對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.1 Effect of pullulanase addition on rapid digestible starch contents of highland barley

2.2 α-葡萄糖苷酶添加量的確定

由圖2可知，在α-葡萄糖苷酶添加量為20～80 U/g時，隨著α-葡萄糖苷酶添加量的增加，快消化淀粉的含量減少；當(dāng)普魯蘭酶添加量在80 U/g時，快消化淀粉含量最低，為57.01%；當(dāng)普魯蘭酶添加量＞80 U/g之后，快消化含量有所上升。因為α-葡萄糖苷酶可將游離的葡萄糖基轉(zhuǎn)移到其他底物上，并形成α-1,6-糖苷鍵，得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖酯、糖肽等[25]。因此，最佳α-葡萄糖苷酶的添加量為80 U/g。

圖2 α-葡萄糖苷酶添加量對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.2 Effect of α-glucosidase addition on rapid digestible starch contents of highland barley

2.3 酶解工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.3.1 料液比對青稞快消化淀粉含量的影響

由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶5～1∶15（g：mL）時，快消化淀粉含量隨之減少；當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL）時，快消化淀粉含量最低，為60.21%；當(dāng)料液比為1∶15～1∶25（g∶mL）時，隨著料液比的減小，酶解效果減弱?？赡苁且驗榱弦罕冗^小時，導(dǎo)致溶液中的酶濃度降低，酶與淀粉的接觸機率減少；當(dāng)料液比較大時，酶與淀粉之間的流動性較低，不易酶解，快消化淀粉含量降低較少[26]。因此，確定最佳酶解料液比為1∶15（g∶mL）。

圖3 料液比對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.3 Effect of solid and liquid ratio on rapid digestible starch contents of highland barley

2.3.2 酶解溫度對青稞快消化淀粉含量的影響

由圖4可知，快消化淀粉的含量隨著酶解溫度在45～85 ℃內(nèi)的升高呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。當(dāng)酶解溫度為45～55 ℃時，快消化淀粉含量隨之減少；當(dāng)酶解溫度達到55 ℃時，青稞快消化淀粉的含量最低，為59.09%。當(dāng)酶解溫度高于55 ℃之后，隨著酶解溫度升高，快消化淀粉含量升高，可能是因為溫度過高導(dǎo)致了淀粉的降解造成[27]。因此，確定最佳酶解溫度為55 ℃。

圖4 酶解溫度對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on rapid digestible starch contents of highland barley

2.3.3 酶解時間對青稞快消化淀粉含量的影響

由圖5可知，當(dāng)酶解時間為1～3 h時，青稞快消化淀粉的含量逐漸降低；當(dāng)酶解時間為3 h時，快消化淀粉含量最低，為56.39%；當(dāng)酶解時間＞3 h之后，青稞快消化淀粉含量逐漸升高。可能是因為酶解時間過長，支鏈淀粉含量減少，后期快消化淀粉酶解的速度大于慢消化淀粉，導(dǎo)致快消化淀粉的含量增加[28]。因此，確定最佳酶解時間為3 h。

圖5 酶解時間對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on rapid digestible starch contents of highland barley

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

基于單因素試驗結(jié)果，以α-葡萄糖苷酶添加量（A）、料液比（B）、酶解時間（C）為自變量，以快消化淀粉含量（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken模型設(shè)計出包括17個試驗點的試驗方案，響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

續(xù)表

2.4.1 回歸模型的建立與顯著性分析

對表2數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸擬合得到回歸模型方程如下：

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，該模型F值等于26.55，且P值＜0.000 1，表明擬合模型具有顯著性。失擬項是模型數(shù)據(jù)變異的體現(xiàn)，失擬項P值=0.791 3＞0.05，不顯著，說明該回歸方程無失擬因素，試驗結(jié)果的擬合度是比較好的[28]。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示試驗的精確度，CV越大越不可靠，本試驗中CV值（2.17%）較小，結(jié)果可靠。模型的決定系數(shù)R2為0.972 5，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.935 0，說明該模型可以解釋大概94%響應(yīng)值的變化。由P值可知，該模型的二次項A2、B2、C2對青稞快消化淀粉含量影響極顯著（P＜0.01），一次項B、交互項AB、BC對青稞快消化淀粉含量影響顯著（P＜0.05），一次項A、C和交互項AC對青稞快消化淀粉含量影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，影響青稞快消化淀粉含量因素順序為B（料液比）＞A（α-葡萄糖苷酶添加量）＞C（酶解時間）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.4.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

由圖6可知，α-葡萄糖苷酶添加量和料液比、料液比和酶解時間對青稞快消化淀粉含量有顯著影響（P＜0.05），α-葡萄糖苷酶添加量和酶解時間對青稞快消化淀粉含量影響不顯著（P＞0.05），這與表3的方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素間交互作用對青稞快消化淀粉含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on rapid digestible starch contents of highland barley

2.4.3 驗證試驗

由Design-Expert 8.0.6軟件分析后，得到最優(yōu)酶解工藝條件為：α-葡萄糖苷酶添加量80.3 U/g、料液比為1∶15（g∶mL）、酶解時間為2.9 h。在此優(yōu)化條件下，青稞快消化淀粉含量預(yù)測值為57.85%。為了便于實際操作，將最優(yōu)酶解工藝條件修正為：α-葡萄糖苷酶添加量80 U/g、料液比1∶15（g∶mL）、酶解時間3.0 h。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，青稞快消化淀粉含量實際值為54.95%，與預(yù)測值差別不大。

2.5 改性青稞粉體外降血糖活性測定結(jié)果

淀粉等先在人體內(nèi)被α-淀粉酶水解為麥芽糖等雙糖，再被α-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖、果糖等單糖，之后被小腸吸收，因此抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性可以降低餐后血糖。由圖7可知，改性青稞粉的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為90.94%和91.89%，比原粉分別增加了68.1%和50.4%，說明經(jīng)過普魯蘭酶和α-葡萄糖苷酶雙酶酶解后，青稞淀粉的體外降血糖活性得到了明顯提高，可以為后期低血糖生成指數(shù)（glycemic index，GI）食品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

圖7 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.7 Inhibitory rate of α-amylase and α-glucosidase

3 結(jié)論

本試驗研究普魯蘭酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉含量的酶解工藝條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計響應(yīng)面試驗分析優(yōu)化α-葡萄糖苷酶添加量、料液比、酶解時間對快消化淀粉含量的影響。結(jié)果表明，普魯蘭酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉含量的最佳酶解工藝條件為：普魯蘭酶添加量200 U/g、α-葡萄糖苷酶添加量80 U/g、料液比1∶15（g∶mL）、酶解時間3 h、酶解溫度55 ℃。在此優(yōu)化條件下，改性青稞粉快消化淀粉含量為54.95%，比未處理過的青稞粉中快消化淀粉含量（75.17%）降低了20.22%。體外降血糖活性測定結(jié)果表明，改性青稞粉的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為90.94%和91.89%，比原粉分別增加了68.1%和50.4%，說明經(jīng)過雙酶協(xié)同酶解后，青稞淀粉的體外降血糖活性得到了明顯提高，為后期研發(fā)低GI青稞產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)。