原料熱處理方式對蘋果蒸餾酒中甲醇含量和香氣的影響

張志兵，崔聰聰，趙 蕾，連 琛，安貴陽

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

蘋果蒸餾酒一般是指以蘋果為原料，經(jīng)過酵母發(fā)酵后，再經(jīng)過過濾、蒸餾、陳釀等工藝制得的蒸餾酒[1-3]。蘋果中含有較多的果膠[4]，在果膠酶的作用下，果膠中的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，甲氧基從半乳糖醛酸長鏈上游離出來，經(jīng)過分子變形形成甲醇[5]。過量的甲醇攝入會(huì)對人體的健康產(chǎn)生危害，人體攝入甲醇含量＞5 g，會(huì)引起中毒；甲醇攝入量＞12.5 g可造成人體死亡[6-7]。甲醇在人體內(nèi)還會(huì)發(fā)生一系列的氧化還原反應(yīng)，生成甲醛或者甲酸，甲醛和甲酸作為甲醇的氧化物，擁有比甲醇更強(qiáng)的毒害性[8]。因此，我國在GB 2757—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)蒸餾酒及其配制酒》[4]中對水果蒸餾酒中甲醇含量作出了規(guī)定：以谷物外的其他原料生產(chǎn)蒸餾酒，其甲醇含量不得超過2.00 g/L（以100%酒精計(jì)）。

有研究發(fā)現(xiàn)，釀酒原料經(jīng)過熱處理后，不僅可以降低蒸餾酒中甲醇的含量[9]，還會(huì)對酯類及芳香類物質(zhì)的形成有促進(jìn)作用，豐富白酒的風(fēng)味成分、提升白酒的質(zhì)量[10]。因此，本研究采用不同的熱處理方式對釀酒原料進(jìn)行處理后釀造蘋果蒸餾酒，使用氣相色譜法（gas chromatography，GC）測定蒸餾酒中甲醇的含量，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)及電子鼻技術(shù)測定香氣物質(zhì)，考察不同原料熱處理方式對蘋果蒸餾酒中甲醇含量及香氣的影響，并基于蘋果蒸餾酒中共有的香氣成分進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），建立關(guān)于蘋果蒸餾酒品質(zhì)的主成分分析評(píng)價(jià)模型，通過該模型計(jì)算出各處理方式蘋果蒸餾酒的綜合得分。以期降低蘋果蒸餾酒中的甲醇含量，并且獲得具有良好香氣物質(zhì)成分的蒸餾酒，為蘋果蒸餾酒的深加工提供重要指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

釀酒蘋果：品種為長富2號(hào)，采摘自西北農(nóng)林科技大學(xué)洛川蘋果試驗(yàn)站，挑選無破損、無霉變的成熟果實(shí)作為釀酒原料。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：深圳麥上生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

3-辛醇（純度≥98%）、氯化鈉（純度≥99.5%）、甲醇（純度≥99%）：樂尚生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ISQ&TRACEISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）儀：美國賽默飛科技有限公司；HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國Agilent公司；Uni Bloc電子天平：日本Shmadzu公司；SPME手柄、57329-U DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司；PEN3型電子鼻：德國AIRSENSE公司；RDN-1000D-4型人工氣候箱：寧波東南儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果蒸餾酒釀造工藝及操作要點(diǎn)[11]

操作要點(diǎn)：

原料預(yù)處理：選擇色澤鮮艷、無腐爛、無病斑、達(dá)到食用成熟度的長富2號(hào)蘋果作為釀酒原材料，并對原料蘋果進(jìn)行清洗浸泡，清除原料中雜物，之后控干水分備用。在蘋果破碎過程中，加入0.1%偏重亞硫酸鈉，防止氧化。

熱處理：1#（對照）：把蘋果放在室內(nèi)晾曬20 min；2#：把蘋果放于70 ℃的恒溫裝置中熱處理20 min；3#：把蘋果放于70 ℃的恒溫裝置中熱處理30 min；4#：把蘋果放于90 ℃的恒溫裝置中熱處理20 min；5#：把蘋果放于90 ℃的恒溫裝置中熱處理30 min；

酵母活化、接種：按發(fā)酵底物0.05%的比例準(zhǔn)確稱取5 g活性干酵母，并將活性干酵母置于100 mL、35 ℃、2%的葡萄糖水中活化1 h。把活化好的酵母倒入準(zhǔn)備好的發(fā)酵底物中，并攪拌均勻。

發(fā)酵：將加入酵母的蘋果漿放入密閉的發(fā)酵桶中，然后將裝好的發(fā)酵桶轉(zhuǎn)移到恒溫氣候箱中于25 ℃進(jìn)行恒溫發(fā)酵，每天排放發(fā)酵產(chǎn)生的氣體。

過濾、蒸餾：發(fā)酵結(jié)束后，取出發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行過濾，收集濾液，放入蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾，得到的蒸餾液即為蘋果蒸餾原酒。

陳釀：將蘋果蒸餾原酒置于10 ℃以下的環(huán)境中陳釀3個(gè)月得到蘋果蒸餾酒。

1.3.2 測定方法

（1）甲醇含量的測定

參照文獻(xiàn)[12]中的GC法測定甲醇含量。色譜條件：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持1 min，以5.0 ℃/min的速率升溫至130 ℃，再保持5 min；檢測器溫度和進(jìn)樣口溫度均為250 ℃；分流比為20∶1；載氣為高純氦氣（He），流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為1.0 μL。

定性定量方法：根據(jù)保留時(shí)間定性，采用外標(biāo)法定量。

（2）香氣物質(zhì)的GC-MS測定

參照文獻(xiàn)[13]中的頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定香氣成分。

頂空固相微萃取條件：量取酒樣5 mL放入15 mL的頂空瓶中，添加質(zhì)量濃度為5 g/L的3-辛醇6 μL至頂空瓶中作為內(nèi)標(biāo)，準(zhǔn)確稱取1.5 g NaCl加入頂空瓶中，密封后置于40 ℃平衡30 min，然后用已經(jīng)老化的固相微萃取頭進(jìn)行萃取。萃取完成后，把萃取頭放入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口，在260 ℃的條件下解吸3 min[14]。

GC條件：升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持3 min；然后以8 ℃/min的速率升溫至80 ℃，再保持10 min；接著以10 ℃/min速率升溫至250 ℃；進(jìn)樣口溫度設(shè)置為260 ℃，載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min；不進(jìn)行分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度設(shè)置為230 ℃，儀器掃描范圍為35～400 amu，電子能量70 eV。

定性定量方法：根據(jù)檢測出的未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）library、Wileylibrary相匹配，選擇匹配度＞85%的物質(zhì)作為有效香氣成分，結(jié)合文獻(xiàn)中的保留指數(shù)進(jìn)行香氣物質(zhì)的定性；以3-辛醇為內(nèi)標(biāo)（質(zhì)量濃度5 g/L），按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各成分質(zhì)量濃度實(shí)現(xiàn)定量。

（3）香氣物質(zhì)的電子鼻測定[15]

準(zhǔn)確量取5 mL蘋果蒸餾酒酒樣于香氣富集瓶中，然后在室溫條件下富集5 min后再進(jìn)行測量，在每次測樣前，對電子鼻進(jìn)行清洗，清洗時(shí)間為5 min。電子鼻測試參數(shù)為預(yù)進(jìn)樣時(shí)間5 s，酒樣檢測時(shí)間60 s，載氣流速和樣品單位通過量為300 mL/min。測量結(jié)束后，采用曲線平穩(wěn)區(qū)域作為香氣分析區(qū)域[16-17]。電子鼻10個(gè)金屬氧化物傳感器及其對應(yīng)的香氣類型見表1。本試驗(yàn)提取了10個(gè)傳感器對相應(yīng)物質(zhì)的特征值，然后對不同蘋果蒸餾酒酒樣進(jìn)行PCA。1.3.3 數(shù)據(jù)處理及分析

表1 傳感器及其對應(yīng)的香氣類型Table 1 Sensors and their corresponding aroma types

用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，電子鼻所測數(shù)據(jù)用其自帶的Winmuster 9.0.7軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料的不同熱處理方式對蒸餾酒中甲醇含量的影響

采用5種不同熱處理的原料釀造蘋果蒸餾酒，測定其甲醇含量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，1#（對照）所釀造的蘋果蒸餾酒中甲醇含量最高，5#甲醇含量最低，5種蘋果蒸餾酒中甲醇含量排序?yàn)?#（2.35 g/L）＞2#（2.16 g/L）＞3#（2.03 g/L）＞4#（1.89 g/L）＞5#（1.78 g/L）。其中，相對于1#、2#、3#、4#、5#蘋果蒸餾酒中的甲醇含量有所下降，可能是熱處理方式使果膠酶發(fā)生變性失活，從而抑制了甲醇的生成。張少云[18]采用熱處理后的紅棗釀造蒸餾酒，蒸餾酒中的甲醇含量明顯降低，與本研究結(jié)果一致。

圖1 5種蘋果蒸餾酒中甲醇含量的測定結(jié)果Fig.1 Determination results of methanol contents in 5 kinds of apple distilled liquors

2.2 原料的不同熱處理方式對蘋果蒸餾酒中香氣物質(zhì)的影響

2.2.1 GC-MS對不同蘋果蒸餾酒香氣物質(zhì)的分析結(jié)果

5種不同熱處理原料所釀造的蘋果蒸餾酒的香氣成分種類及含量見表2。由表2可知，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從5種熱處理原料釀造的蘋果蒸餾酒酒樣中共檢測鑒定出47種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類23種、醇類10種、酸類3種、醛酮類5種、其他類6種。1#、2#、3#、4#、5#蒸餾酒中鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為34種、31種、35種、33種、33種，共有物質(zhì)為23種，但香氣組成成分和含量仍存在較大差異。

表2 5種蘋果蒸餾酒中揮發(fā)性香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 2 Results of volatile aroma components in 5 kinds of apple distilled liquors analyzed by GC-MS

酯類物質(zhì)是蒸餾酒中不可缺少的重要成分，能夠使蘋果蒸餾酒香氣飄逸、香味濃厚，是酒體香氣最重要的組成部分，可決定蒸餾酒的品質(zhì)[19]。5種處理釀造的蘋果蒸餾酒中共檢測出酯類物質(zhì)23種，1#、2#、3#、4#、5#蘋果蒸餾酒中酯類物質(zhì)分別為14種、13種、15種、15種、14種，共有酯類物質(zhì)9種。其中，乙酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯含量較高，可賦予蘋果蒸餾酒梨香、香蕉香、菠蘿香、椰子香。在本研究中，5#蒸餾酒的酯類物質(zhì)含量最高（132.79 mg/L），且辛酸乙酯的含量（40.96 mg/L）也顯著高于其他4種蒸餾酒（P＜0.05），具有更濃郁的果香和花香[20]。

醇類物質(zhì)是蒸餾酒中含量最多的一類物質(zhì)[21]，正是由于醇類物質(zhì)的存在，才使得蒸餾酒醇香甘甜，酒體豐滿[22]。5種蘋果蒸餾酒中共檢測出醇類物質(zhì)10種，1#、2#、3#、4#、5#蘋果蒸餾酒中檢出醇類物質(zhì)分別為9種、8種、9種、8種、8種，其中共有醇類物質(zhì)7種。5種蘋果蒸餾酒中異丁醇、正丁醇、異戊醇、正己醇、苯乙醇的含量較高，可賦予蘋果蒸餾酒醇香、酒精香、苦杏仁香、青草香、玫瑰花香[23]。其中5#蒸餾酒的醇類物質(zhì)含量最高（132.16 mg/L），且異戊醇的含量（101.63 mg/L）顯著高于其他4種蒸餾酒（P＜0.05），具有更濃郁的清香和苦杏仁香[24]。

蒸餾酒中酸類物質(zhì)含量較少，其主要是產(chǎn)生于發(fā)酵過程，然后在蒸餾時(shí)被水蒸氣帶出。5種蘋果蒸餾酒中共檢測出酸類物質(zhì)3種，其中乙酸和辛酸為共有酸類物質(zhì)，可賦予蘋果蒸餾酒刺激性酸味和奶酪味[25]。

醛酮類物質(zhì)能刺激人體的味覺器官，在高等植物之中廣泛存在[26]。在5種蘋果蒸餾酒樣品中共有5種醛酮類物質(zhì)和6種其他類物質(zhì)。在5種蘋果蒸餾酒的研究中，發(fā)現(xiàn)醛酮類和其他類物質(zhì)相較于酯類和醇類，含量更低，但也有一定的貢獻(xiàn)作用，其中乙醛、3-辛酮、苯甲醛等能夠賦予蘋果蒸餾酒果香味、蘋果香、特殊芳香植物味[27]。

2.2.2 基于共有香氣成分5種蘋果蒸餾酒的主成分分析

在蘋果蒸餾酒中，酒的香氣不是由一種或者幾種單獨(dú)的物質(zhì)決定的，而是各種成分之間相互促進(jìn)、抑制和疊加的效果[28-29]。為了判斷各個(gè)熱處理原料釀造的蒸餾酒香氣復(fù)合情況，對5種蘋果蒸餾酒中共有的23種香氣化合物進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3。由表3可知，4個(gè)主成分的特征值分別為13.913、4.922、2.849、1.317，其方差貢獻(xiàn)率分別為60.491%、21.398%、12.387%和5.724%，4個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)100.000%，說明了主成分分析法可用于蘋果蒸餾酒香氣物質(zhì)的分析。

表3 5種蘋果蒸餾酒中23種共有香氣成分主成分的方差貢獻(xiàn)率Table 3 Variance contribution rate of principal component of 23 common aroma components in 5 kinds of apple distilled liquors

5種蘋果蒸餾酒酒樣中23種共有香氣成分主成分分析的因子負(fù)荷矩陣分析結(jié)果見表4，載荷圖見圖3。由表4可知，第一個(gè)主成分與20種香氣物質(zhì)呈正相關(guān)，3種物質(zhì)成負(fù)相關(guān)，因此，第一主成分的香氣貢獻(xiàn)值主要來源于與其呈正相關(guān)的20種物質(zhì)；第二主成分與14種物質(zhì)呈正相關(guān)，9種物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)；第三主成分與12種物質(zhì)呈正相關(guān)，11種物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)；第四主成分與13種物質(zhì)呈正相關(guān)，10種物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。由圖3可知，在5種蘋果蒸餾酒中，大多數(shù)香氣化合物分布較為集中，但仍有少數(shù)幾個(gè)物質(zhì)（乙酸、正己醇等）較為散亂，說明5個(gè)熱處理原料所釀得的蒸餾酒香氣品質(zhì)存在差異。

表4 5種蘋果蒸餾酒中23種共有香氣成分旋轉(zhuǎn)后的因子負(fù)荷矩陣Table 4 Factor load matrix after rotation of 23 common aroma components in 5 kinds of apple distilled liquors

圖2 5種蘋果蒸餾酒中23種共有香氣成分主成分分析的載荷圖Fig.2 Loading diagram of principal component analysis of 23 common aroma components in 5 kinds of apple distilled liquors

根據(jù)23種共有香氣成分指標(biāo)（X1～X23）在4個(gè)主成分（Y1～Y4）中的載荷量，計(jì)算每個(gè)指標(biāo)在不同主成分上的系數(shù)，各指標(biāo)的線性組合系數(shù)是用不同指標(biāo)的各主成分特征向量除以該主成分特征值的算數(shù)平方根得到[30]，具體主成分函數(shù)表達(dá)式如下：

根據(jù)主成分的方差貢獻(xiàn)率，建立綜合評(píng)價(jià)模型為：Y=0.605Y1+0.214Y2+0.124Y3+0.057Y4。利用該模型計(jì)算得到5種蘋果蒸餾酒品質(zhì)的綜合得分，并按分?jǐn)?shù)高低進(jìn)行排序，結(jié)果見表5。由表5可知，5#蘋果蒸餾酒酒樣的綜合得分最高（2.866分），品質(zhì)最好，其次為4#蘋果蒸餾酒酒樣，3#蘋果蒸餾酒酒樣綜合得分最低，品質(zhì)最差。

表5 5種蘋果蒸餾酒酒樣的主成分得分及綜合得分Table 5 Main components scores and comprehensive scores of 5 kinds of apple distilled liquors samples

2.2.3 電子鼻對不同蘋果蒸餾酒香氣物質(zhì)的分析結(jié)果

基于電子鼻分析結(jié)果對5種蘋果蒸餾酒進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖3。

圖3 基于電子鼻分析的5種蘋果蒸餾酒酒樣主成分分析結(jié)果Fig.3 Principal component analysis results of 5 kinds of apple distilled liquors samples based on electronic nose analysis

由圖3可知，第一主成分方差貢獻(xiàn)率為92.304%，第二主成分方差貢獻(xiàn)率為6.598%，兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為98.902%，其測出的香氣物質(zhì)能夠充分的代表蒸餾酒的總體香氣情況[31-32]。由圖3可知，5種蘋果蒸餾酒均可以被電子鼻顯著區(qū)分，這說明采用不同原料熱處理方式釀得的蘋果蒸餾酒具有各自不同的香氣特色，并且電子鼻可以根據(jù)不同酒樣的香氣特點(diǎn)將其區(qū)分開來。

3 結(jié)論

釀酒蘋果原料經(jīng)5種不同熱處理后釀造蘋果蒸餾酒，GC分析結(jié)果顯示，酒樣中的甲醇含量從低到高依次為5#、4#、3#、2#、1#，其中4#、5#熱處理酒樣中的甲醇含量＜2.00 g/L，分別為1.89 g/L、1.78 g/L。HS-SPME-GC-MS分析結(jié)果顯示，從5種蘋果蒸餾酒樣中共檢測鑒定出47種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類23種、醇類10種、酸類3種、醛酮類5種、其他類6種，香氣物質(zhì)總量從高到低依次為5#、4#、3#、2#、1#；通過構(gòu)建共有香氣成分分析評(píng)價(jià)模型得出，5#蘋果蒸餾酒的綜合得分最高（2.866分），香氣成分更加突出；電子鼻技術(shù)結(jié)合PCA方法，能夠很好地區(qū)分5種蘋果蒸餾酒。