基于高通量測序技術分析豆腐乳中微生物多樣性

蘭 林，段樹華，汪晟羽，羅 浩，汪靜心，李玉鋒

（1.西華大學 食品與生物工程學院 食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川 成都 610039；2.成都紡織高等?？茖W校，四川 成都 611731）

豆腐乳，又稱腐乳、霉豆腐，是以大豆為原料制成的發(fā)酵類食品，在國外有著東方“奶酪”的美譽，其制作方法最早可追溯到魏代，憑借其獨特的風味和細膩的口感備受廣大消費者的喜歡[1]。豆腐乳發(fā)酵是一個龐大微生物群落演替的過程，利用其微生物產生的多種酶系，促使豆腐乳中蛋白質分解為營養(yǎng)價值高的氨基酸和一些風味物質、脂肪分解為脂肪酸、淀粉轉化為糖類等人體所必需且易吸收的小分子物質[2-3]。發(fā)酵后的豆腐乳大幅度提升了大豆蛋白的吸收率，同時富含有低聚糖、大豆異黃酮等功能性物質，對于抗氧化、提高人體免疫力、降血壓等方面具有積極作用[4]。

我國地勢遼闊，不同區(qū)域的氣候差異性孕育了多種具有代表性的豆腐乳：如桂林豆腐乳、北京青豆腐乳、湖南永州茶油豆腐乳和四川特色豆腐乳等[5]。豆腐乳所具有的獨特風味及營養(yǎng)價值與發(fā)酵期間微生物的群落結構密切相關，豆腐乳根據發(fā)酵類型分為自然發(fā)酵豆腐乳和純種發(fā)酵豆腐乳，雖然市場銷售已有工業(yè)化生產的純種發(fā)酵豆腐乳，但自然發(fā)酵豆腐乳因制作成本低和操作簡單等因素也出現在各大銷售市場上。豆腐乳的風味往往由酶系的豐富程度所決定，自然發(fā)酵處于開放性環(huán)境中，其中包含有利于發(fā)酵的菌株同時也包括有害微生物，有害微生物在豆腐乳發(fā)酵過程中因其種類的不確定性和發(fā)酵不受控制，易造成產品質量的不穩(wěn)定帶來食品安全性等問題[6-7]。自然發(fā)酵是完全利用環(huán)境中的微生物協同發(fā)酵，分泌的多種酶系使口感和風味有所提升，但自然發(fā)酵不受人工控制，致病菌和腐敗菌一但大量繁殖就會給產品安全性及消費者健康帶來危害[8]。純種發(fā)酵利用特定的菌種和先進工藝技術進行發(fā)酵，保證了產品的穩(wěn)定和安全性，純種發(fā)酵工藝隨著越來越多的企業(yè)和研究人員的不斷投入和研究，將帶來更大的經濟效應[9]。因此，研究豆腐乳傳統(tǒng)自然發(fā)酵體系的微生物群落結構，為后續(xù)純種的發(fā)酵豆腐乳的改善提供一定的理論基礎。

變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）[10]、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）克隆文庫[11]和16S rRNA基因文庫[12]等技術存在測序通量低、操作復雜、干擾較多和檢測效率不高等問題，而高通量測序技術因檢測通量更高、準確度高以及同時分析多個樣品的特點[13]，被廣泛應用在豆瓣醬、豆豉、泡菜、食醋等發(fā)酵類食品中檢測微生物的組成及其豐度的變化[14-15]。本研究基于高通量測序技術對四川樂山地區(qū)的兩種發(fā)酵類型豆腐乳中的細菌和真菌群落多樣性進行分析，以期了解其發(fā)酵優(yōu)勢菌屬和可能導致腐敗的菌株，為改善豆腐乳品質及優(yōu)化發(fā)酵工藝提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

純種發(fā)酵豆腐乳（LA-1～LA-3）：樂山闕劑食品有限公司；自然發(fā)酵豆腐乳（LB-1～LB-3）；工廠自然發(fā)酵豆腐乳；自然發(fā)酵豆腐乳（LC-1～LC-3）：市售；自然發(fā)酵豆腐乳（LD-1～LD-3）：家庭自制。

1.1.2 試劑

DNA檢測試劑盒：美國OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司；TaqDNA聚合酶和Hieff NGSTMDNA Selection Beads：上海翌圣生物科技股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TP421型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Pico-21臺式離心機：美國Thermo Fisher公司；VORTEX 3旋渦混勻器：德國IKA公司；ETC 811聚合酶鏈式反應（poly merase chain reaction，PCR）儀：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達科技有限公司；DYY-4C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Tanon-2500型凝膠成像儀：上海天能生物科技有限公司；1Sorvall Stratos冷凍高速離心機：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 豆腐乳樣品微生物基因組DNA的提取與檢測

參考李榮源等[16]的方法，利用基因組DNA提取試劑盒對豆腐乳樣品微生物的基因組DNA進行提取，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。

1.3.2 PCR擴增

參考茍萌等[17]的方法，對微生物總DNA精確定量，以其為模板，采用通用引物341F（5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′）和805R（5′-GACTGGAGTTCCGGCACCCGAGAATTCCA-3′）對細菌16S rDNA的V3-V4區(qū)基因序列進行PCR擴增。采用通用引物1737F（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATCGATGC-3′）對真菌在ITS1區(qū)基因序列進行PCR擴增，PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，26個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，采用試劑盒回收純化后的PCR擴增產物，并將樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 數據處理及分析

經過高通量測序得到的序列通過拼接、精確匹配、去除無法拼接序列，得到最終序列。利用Usearch（3.0.1.1）軟件將具有97%相似度的序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，每個OTU對應一種代表序列；利用Uchime去除嵌合體序列。利用核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）、Silva、Unite等數據庫進行基因序列比對和注釋。實驗作圖軟件使用R軟件和Origin 9.1。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 稀釋性曲線

不同豆腐乳樣品中微生物菌群稀釋曲線見圖1。由圖1可知，豆腐乳樣品中細菌和真菌菌群的OTU數均隨序列數的增加呈先增加后趨于平坦的趨勢，說明本次樣品的取樣量充足且測序數據合理。

圖1 不同豆腐乳樣品細菌（a）和真菌（b）菌群的稀釋性曲線Fig.1 Dilution curves of bacterial (a) and fungal (b) flora of different sufu samples

2.2 數據統(tǒng)計與OTU分析

經過濾和雙端拼接，細菌菌群的16S rDNA基因序列共獲得160 858條有效序列，平均堿基長度為420 bp；真菌菌群的ITS1區(qū)基因序列共獲得187 339條有效序列，平均堿基長度為310 bp。所獲得的序列按照97%的相似度進行分類，細菌菌群得到838個OTU，真菌菌群得到509個OTU，采用R軟件繪制韋恩（Venn）圖，結果見圖2。

圖2 不同豆腐乳樣品細菌（a）和真菌（b）菌群OTU Venn圖Fig.2 OTU Venn diagram of bacterial (a) and fungal (b) flora of different sufu samples

由圖2可知，4個豆腐乳樣品共有的細菌OTU數為158個，真菌OTU數為45個，其中，樣品LD的細菌和真菌OTU數均最高，分別為221個和169個，可以看出在家庭自制發(fā)酵豆腐乳中微生物的種類繁多不受人為環(huán)境控制，極易存在更高食品安全隱患。

2.3 α-多樣性分析

不同豆腐乳樣品中細菌及真菌菌群的α-多樣性分析結果分別見表1和表2。由表1可知，所有樣品的覆蓋率均＞99%，說明測序結果代表了本次樣品中微生物群落的真實情況。由OTU數、Chao1指數和ACE指數可以看出，無論是細菌菌群還是真菌菌群，樣品LD的微生物菌群豐富度最高。由Simpson指數和Shannon指數可以看出，樣品LA的多樣性均大于其他3個樣品，樣品LA為純種毛霉發(fā)酵而來，多樣性指數偏高可能是因為在生產過程中由于操作不當造成微生物交替污染。雖然樣品LA多樣性較高，但OTU數卻不是最多的；Shannon指數最低和Simpson指數最高的樣品分別為LC和LD，但OTU數卻不是最低的，因此，可以看出Shannon指數和Simpson指數的高低與樣品中OTU數不成正相關。通過比較分析細菌與真菌菌群Shannon指數多樣性可知，細菌菌群Shannon指數略高于真菌菌群，表明細菌菌群的多樣性更為豐富，在豆腐乳發(fā)酵過程中同樣起著重要的作用。細菌菌群在豆腐乳發(fā)酵期間的協同作用增添多種酶系，使豆腐乳的風味更加均濃厚，口感更加細膩，同樣在豆腐乳發(fā)酵過程中一旦有害細菌過多或成為優(yōu)勢菌，會造成產品腐敗變質[18]。

表1 不同豆腐乳樣品細菌菌群的α-多樣性指數Table 1 α-diversity indexes of bacterial flora of different sufu samples

表2 不同豆腐乳樣品真菌菌群的α-多樣性指數Table 2 α-diversity indexes of fungal flora of different sufu samples

2.4 微生物群落結構分析

2.4.1 基于門水平的微生物群落結構分析

基于門水平，不同豆腐乳樣品中的微生物菌群結構見圖3。由圖3a可知，從4種豆腐乳樣品中共得到3個優(yōu)勢細菌門（平均相對豐度＞1%），分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes），均為4種豆腐乳樣品的優(yōu)勢細菌門。其中，變形菌門在樣品LA中平均相對豐度最高，為59.83%；厚壁菌門在樣品LB中平均相對豐度最高，為45%；擬桿菌門在樣品LC中平均相對豐度最高，為34.43%。眾多研究表明，變形菌門是細菌中最大的一類門，為革蘭氏陰性菌且廣泛存在于自然界中[19]；厚壁菌門可以產生芽孢，在缺水及極端發(fā)酵環(huán)境中均發(fā)現其芽孢，這可能是厚壁菌門細菌在含鹽量高、油漬產品中仍被發(fā)現的原因[20]；擬桿菌門同樣在發(fā)酵類食品（如奶制品、肉制品和醬油）中均有被發(fā)現，與杜瑞等[21]的研究結果一致。

圖3 基于門水平不同豆腐乳樣品細菌（a）和真菌（b）菌群結構分析結果Fig.3 Analysis results of bacterial (a) and fungal (b) flora structure of different sufu samples based on phylum level

由圖3b可知，從4種豆腐乳樣品中共得到6個優(yōu)勢真菌門（平均相對豐度＞1%），分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、輪孢菌門（Rozellomycota）、膽子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和壺菌門（Chytridiomycota）。樣品LA中的優(yōu)勢真菌門分別為子囊菌門、毛霉菌門和被孢霉門；樣品LB中的優(yōu)勢真菌門分別為子囊菌門、毛霉菌門和擔子菌門，樣品LC中的優(yōu)勢真菌門分別為子囊菌門、毛霉菌門、輪孢菌門和壺菌門；樣品LD中的優(yōu)勢真菌門分別為子囊菌門、毛霉菌門和擔子菌門。4種豆腐乳共有的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門、毛霉菌門和擔子菌門，子囊菌門在樣品LA、LB、LC和LD中的平均相對豐度分別為68.61%、80.55%、75.32%、86.23%；毛霉菌門在樣品LA、LB、LC和LD中的平均相對豐度分別為20.31%、12.93%、8.11%和8.46%；擔子菌門在樣品LA、LB、LC和LD中的平均相對豐度分別為6.19%、5.11%、8.74%和1.75%。

2.4.2 基于屬水平的微生物群落結構分析

基于屬水平，不同豆腐乳樣品中的微生物菌群結構見圖4。

圖4 基于屬水平不同豆腐乳樣品細菌（a）和真菌（b）菌群結構分析結果Fig.4 Analysis results of bacterial (a) and fungal (b) flora structure of different sufu samples based on genus level

由圖4a可知，從4種豆腐乳樣品中共得到13個優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度＞1%），分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、透明顫菌屬（Vitreoscilla）、魏斯氏菌屬（Weissella）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泰氏菌屬（Tissierella）、依格納季氏菌屬（Ignatzschineria）、哈夫尼菌屬（Hafnia）、沙雷氏菌屬（Serratia）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、庫特氏菌屬（Kurthia）、馬闊里類芽孢桿菌屬（Paenisporosarcina）。不同豆腐乳樣品間的細菌菌群結構有所差異，在樣品LA中的優(yōu)勢細菌屬分別為乳桿菌屬、透明顫菌屬、假單胞菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬，平均相對豐度分別為52.77%、30.12%、15.92%、12.11%和6.24%；樣品LB的優(yōu)勢細菌屬分別為假單胞菌屬、乳桿菌屬、透明顫菌屬、魏斯氏菌屬、泰式菌屬、不動桿菌和明串珠菌屬，平均相對豐度分別為37.93%、19.87%、13.7%、9.31%、7.06%、5.64%和4.13%；樣品LC的優(yōu)勢細菌屬分別為假單胞菌屬、魏斯氏菌屬、不動桿菌屬、乳桿菌屬、透明顫菌屬、明串珠菌屬、依格納季氏菌屬、馬闊里類芽孢桿菌屬和沙雷氏菌屬，平均相對豐度分別為62.05%、13.45%、7.53%、6.14%、3.08%、2.21%、1.55%、1.50%和1.04%；樣品LD的優(yōu)勢細菌屬分別為假單胞菌屬、不動桿菌屬、魏斯氏菌屬、透明顫菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、哈夫尼菌屬和庫特氏菌屬，平均相對豐度分別為59.12%、15.57%、12.45%、5.16%、4.27%、3.28%、1.91%、1.50%和1.03%。在4種豆腐乳樣品中共有優(yōu)勢細菌屬為假單胞菌屬、乳桿菌屬、透明顫菌屬、魏斯氏菌屬、不動桿菌屬和明串珠菌屬。其中假單胞菌屬是微生物的重要類群，也是分布最廣的微生物之一，為革蘭氏陰性、無芽孢、需氧、直或稍彎曲桿狀[22]，其易分解蛋白質，在蛋白質含量較高的肉類、大豆和奶類制品常受到假單胞菌的污染，是造成食品腐敗的常見菌屬[23-24]，且在市售及家庭小作坊自然發(fā)酵的豆腐乳中的相對豐度較高，表明易受該細菌的污染造成豆腐乳的腐敗和變質。

由圖4b可知，從4種豆腐乳樣品中共得到19個優(yōu)勢真菌屬，分別為酵母屬（Saccharomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、短梗霉屬（Aureobasidium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、毛霉屬（Mucor）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、青霉菌（Penicillifer）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、絲孢畢赤氏酵母屬（Hyphopichia）、被孢霉屬（Mortierella）、枝孢屬（Cladophialophora）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、雙生子囊屬（Dipodascus）、乳香菌屬（Talaromyces）、東方伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）、柯達酵母菌屬（Kodamaea）、球囊菌屬（Plectosphaerella）。在樣品LA中的優(yōu)勢真菌屬為酵母屬、毛霉屬、曲霉屬、德巴利氏酵母屬、有孢圓酵母屬和被孢霉屬，平均相對豐度分別為44.42%、20.87%、5.73%、7.86%、5.56%和5.22%；樣品LB中的優(yōu)勢真菌屬為德巴利氏酵母屬、酵母屬、曲霉屬、短梗霉屬、青霉屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、絲孢畢赤氏酵母屬和有孢圓酵母屬，平均相對豐度分別為31.23%、17.13%、14.92%、9.66%、7.14%、4.29%、4.12%、3.82%和2.93%；樣品LC中的優(yōu)勢真菌屬為曲霉屬、短梗霉屬、酵母屬、鐮刀菌屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、有孢圓酵母屬、德巴利氏酵母屬、絲孢畢赤氏酵母屬、東方伊薩酵母菌屬、雙生子囊屬、柯達酵母菌屬和球囊菌屬，平均相對豐度分別為25.43%、14.94%、8.09%、7.36%、6.22%、6.02%、4.52%、4.49%、4.02%、2.69%、1.97%、1.81和1.68；樣品LD中的優(yōu)勢真菌屬為曲霉屬、鐮刀菌屬、短梗霉屬、畢赤酵母屬、酵母屬、青霉屬、德巴利氏酵母屬、假絲酵母屬、支孢屬、有孢圓酵母屬、被孢霉屬、毛孢子菌屬和乳香菌屬，平均相對豐度分別為29.28%、17.41%、9.43%、7.18%、6.92%、6.16%、5.25%、4.69%、3.73%、3.31%、1.63%、1.27%和1.15%。在4種豆腐乳樣品中共有優(yōu)勢真菌屬為曲霉屬、曲霉屬、德巴利氏酵母屬、短梗霉屬、假絲酵母屬和有孢圓酵母屬。由此可以看出，豆腐乳真菌菌群以酵母菌為主。酵母菌是發(fā)酵食品中的優(yōu)良發(fā)酵劑[25]，不僅增加發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值還賦予其獨特的風味口感[26]。

2.5 基于屬水平不同豆腐乳樣品間微生物群落主成分分析結果

基于屬水平，不同豆腐乳樣品間的微生物群落主成分分析結果（principal component analysis，PCA）見圖5。由圖5a可知，樣品LA與LD相距較遠，說明這兩種樣品間的細菌菌群多樣性差異較大，樣品LA與LB主要集中在第三象限，表明這兩種樣品中的細菌菌落有一定的相似性，樣品LC與其他3個樣品相距較遠，細菌菌群結構差異較大。由圖5b可知，樣品LA主要集中在第四象限，與其他3個樣品分布距離較大，這可能是因為樣品LA主要以純種毛霉發(fā)酵而成。樣品LC和LD主要集中在第一象限，表明這兩個樣品真菌菌群多樣性差異較小，樣品LB集中在第三象限，與其他3個樣品相距較遠。真菌菌群結構差異較大，這可能是因為生產環(huán)境中微生物種類復雜，溫度及濕度等參數不固定導致樣品間微生物種類及豐度有所差異[27]。綜上，可以看出純種發(fā)酵豆腐乳與其他自然發(fā)酵豆腐乳的微生物群落差異性較大。

圖5 基于細菌（a）和真菌（b）屬水平不同豆腐乳樣品的主成分分析結果Fig.5 Principal component analysis results of different sufu samples based on bacteria (a) and fungi (b) at genus level

3 結論

本研究基于高通量測序技術對4種豆腐乳樣品中微生物菌群多樣性進行較為全面的分析。結果表明，4種豆腐乳樣品中的微生物多樣性及豐度存在一定的差異，在門水平上，共有優(yōu)勢細菌門（平均相對豐度＞1%）為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門；優(yōu)勢真菌門為子囊菌門、毛霉菌門和擔子菌門；在屬水平，優(yōu)勢細菌屬為假單胞菌屬、乳桿菌屬、透明顫菌屬、魏斯氏菌屬、不動桿菌屬和明串珠菌屬；優(yōu)勢真菌屬為曲霉屬、曲霉屬、德巴利氏酵母屬、短梗霉屬、假絲酵母屬和有孢圓酵母屬。這些共有優(yōu)勢菌影響著豆腐乳發(fā)酵體系風味物質的生成和產品品質。利用高通量測序技術分析純種發(fā)酵和自然發(fā)酵豆腐乳中微生物組成及相對豐度，為發(fā)酵豆腐乳產品的微生物結構提供了一定的理論依據。