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    復方丹參雙相膠囊體內(nèi)外評價研究

    2023-02-21 06:37:52夏明艷吳秋焱王燦堅李東勲魏鑫華王堂勛張觀生張文锍張國松
    中草藥 2023年4期
    關鍵詞:龍腦冰片丹參

    夏明艷,吳秋焱,王燦堅,陽 濤,李東勲,魏鑫華,王堂勛,張觀生,張文锍*,張國松*

    ·藥劑與工藝·

    復方丹參雙相膠囊體內(nèi)外評價研究

    夏明艷1, 2,吳秋焱1, 3#,王燦堅1, 2,陽 濤1,李東勲1, 2,魏鑫華1, 2,王堂勛1, 2,張觀生1, 2,張文锍1, 2*,張國松1, 2*

    1. 江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330006 2. 中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心,江西 南昌 330006 3. 康龍化成(北京)新藥技術股份有限公司,北京 101100

    對比研究復方丹參雙相膠囊(Fufang Danshen Biphasic Capsules,F(xiàn)DBC)與復方丹參膠囊(Fufang Danshen Capsules,F(xiàn)DC),證實復方丹參雙相膠囊可降低冰片揮發(fā)損失且不會影響其他有效成分的體內(nèi)外釋藥行為。采用GC法測定FDBC與FDC處于高溫、高濕、光照及加速實驗條件后冰片的含量;以pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和純水為溶出介質(zhì),采用小杯法測定FDBC和FDC中丹參酮IIA、丹酚酸B、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在不同時間點的累積溶出率,繪制溶出曲線;采用鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)制備大鼠急性心肌缺血模型,預防給藥7 d后監(jiān)測大鼠心電圖ST段變化,HE染色觀察心肌組織病理損傷,并利用試劑盒測定大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、心肌肌鈣蛋白-T(cardiac troponin-T,cTn-T)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。FDBC在高溫、高濕、光照條件下及加速實驗條件下冰片含量均保持在94.61%以上,而FDC中冰片含量顯著降低;FDBC與FDC的體外溶出曲線相似;FDBC可以改善ISO致心肌缺血大鼠心電圖ST段改變,減少血清中心肌酶的含量,保持心肌細胞結構完整,具有明顯的抗心肌缺血作用,與FDC具有相同的抗心肌缺血作用。與FDC相比,F(xiàn)DBC可以顯著減少冰片揮發(fā)損失,且不會影響其他成分的體外釋放和藥理作用,顯示出FDBC的優(yōu)越性。

    復方丹參雙相膠囊;復方丹參膠囊;穩(wěn)定性;體外溶出;冰片;丹參酮IIA;丹酚酸B;三七皂苷R1;人參皂苷Rg1;人參皂苷Rb1;心肌缺血;心肌酶

    復方丹參制劑是臨床常用的治療冠心病心絞痛的經(jīng)典中藥復方制劑,臨床常用劑型有片劑、滴丸和顆粒等,由丹參、三七、冰片3味中藥組成,具有活血化瘀、理氣止痛的功效[1]。其中,冰片可“引藥入心經(jīng)”,對心腦血管疾病具有重要的藥效作用[2]?,F(xiàn)代研究表明,冰片可以顯著增加心血管制劑中有效成分的血藥濃度并提高生物利用度[3-8]、舒張血管[9]、提高血腦屏障通透性[10]。冰片主要成分龍腦是一種雙環(huán)單萜類化合物,此外,冰片中還含有多種倍半萜及三萜類化合物[11],具有揮發(fā)性,對熱、空氣和光照敏感,常規(guī)處理工藝難以解決其穩(wěn)定性問題[12-13],影響制劑的質(zhì)量與藥理作用[14-15]。因此,合理有效解決冰片的穩(wěn)定性問題,是保證含冰片制劑質(zhì)量和藥效的關鍵所在。

    針對上述問題,課題組設計構建一種“液相”與“固相”并存的新型釋藥系統(tǒng)——復方丹參雙相膠囊(Fufang Danshen Biphasic Capsules,F(xiàn)DBC),即將冰片與適量溶劑制成“液相”封裝于微型軟膠囊中,丹參、三七提取物制成顆粒/微丸/小片,與軟膠囊裝填于同一硬膠囊中,通過處方篩選與優(yōu)化,確定了丹參水溶性顆粒、丹參脂溶性固體分散體、三七總皂苷提取物顆粒和冰片軟膠囊的制備工藝,評價了軟膠囊殼的性能,結果表明其具有優(yōu)良的溶解、隔水和機械性能,并以純水為溶出介質(zhì),對FDBC進行了體外釋藥初步評價,各成分均可快速溶出[16]。本課題在前期研究的基礎上,擬對FDBC中冰片的穩(wěn)定性進行考察,通過對比FDBC與復方丹參膠囊(Fufang Danshen Capsules,F(xiàn)DC)的體外溶出行為和大鼠體內(nèi)藥效學差異,為闡釋FDBC的優(yōu)越性提供實驗依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    6890N氣相色譜儀,美國Agilent公司;MS 105DU型分析天平,瑞士Mettler Toledo公司;安捷倫7890 B-7000 D氣質(zhì)聯(lián)用儀,美國Agilent公司;101-3-BS-II電熱恒溫鼓風干燥箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;LS-3000UV低溫光照儀,北京天星科儀科技有限公司;TEMI800恒溫恒濕試驗箱,北京中科環(huán)試儀器有限公司;LC-20AT高效液相色譜儀,日本島津公司;ZRS-8G溶出試驗儀,天津市天大天發(fā)科技有限公司;FE28 pH計,瑞士Mettler Toledo公司;HC-3016R高速冷凍離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;Genius 3型渦旋混合器,德國IKA集團;YB-6LF生物組織石蠟包埋機,湖北亞光醫(yī)用電子技術有限公司;RM2235石蠟切片機、DM2500光學顯微鏡,徠卡公司;PT-3502C光柵型全波長酶標儀,江西華科精密儀器有限公司;PowerLad生理記錄儀,AD Instrument公司。

    1.2 材料與藥品

    萘標準品,質(zhì)量分數(shù)99.9%,批號C10636105,北京盛世康普化工技術研究院;龍腦對照品,質(zhì)量分數(shù)≥98.0%,批號DST210312-194,成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司;FDC,批號202101001,葵花藥業(yè)集團(佳木斯)有限公司;對照品丹酚酸B(質(zhì)量分數(shù)96.6%,批號111562-201917)、丹參酮IIA(質(zhì)量分數(shù)98.9%,批號110760-202022)、三七皂苷R1(R1,質(zhì)量分數(shù)93.1%,批號110745-201820)、人參皂苷Rg1(Rg1,質(zhì)量分數(shù)91.7%,批號110703- 201530)、人參皂苷Rb1(Rb1,質(zhì)量分數(shù)93.1%,批號110704-201424)均購自中國食品藥品檢定研究院;丹參水溶性提取物(批號MZ180420)、冰片(批號TB20180801),均購自西安明澤生物科技有限公司;丹參脂溶性提取物,批號20180820,四川宏益生物工程有限公司;三七總皂苷提取物,批號TB20180801,西安天寶生物科技有限公司;糊精,批號2016081101,廣饒麗楓生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),批號20170306,湖南爾康制藥有限公司;泊洛沙姆188,批號WPAK524B,上海昌為醫(yī)藥輔料有限公司;聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40,批號57184468EO,德國巴斯夫公司;聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)400,批號160524,西隴科學股份有限公司;明膠,批號20170328,廣東羅塞洛明膠股份有限公司;甘油,批號20170624,南昌白云藥業(yè)有限公司;山梨醇,批號F010G423165004H,廣西南寧化學制劑有限公司;0號膠囊,蘇州膠囊有限公司;聚山梨酯80(Tween 80,T80),批號170402,四川金山制造有限公司;鹽酸(批號180108)、氯化鈉(批號120108)、醋酸(批號200914)、氫氧化鈉(批號190218)、磷酸二氫鈉(批號100107),均購自西隴科學股份有限公司;無水乙酸鈉,批號20130117,廣東光華科技股份有限公司;鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO),美國Sigma公司;羧甲基纖維素鈉,批號170308,安徽山河藥用輔料股份有限公司;乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)試劑盒(批號20211229)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒(批號20211229)、心肌肌鈣蛋白-T(cardiac troponin-T,cTn-T)試劑盒(批號20220105)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒(批號20211229)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號20211229)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)試劑盒(批號20220105)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)試劑盒(批號20220105)均購自南京建成生物工程研究所;三氯乙醛水合物,麥克林公司;4%多聚甲醛,阿達瑪斯公司;蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液,福州飛凈生物科技有限公司;正己烷、甲醇、乙腈、甲酸為色譜純;水為超純水;其他為分析純試劑。

    1.3 動物

    SD大鼠48只,雄性,SPF級,體質(zhì)量180~220 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2019-0004。本研究動物實驗方案已獲得江西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的批準(JZLLSC20210021)。

    2 方法與結果

    2.1 樣品的制備

    2.1.1 FDBC的制備及老化 按照課題組前期優(yōu)化的處方工藝[16],稱取處方量丹參水溶性提取物、糊精,混合均勻,制粒,得顆粒①,備用;稱取處方量丹參脂溶性提取物、SDS、泊洛沙姆188,采用熔融法制備固體分散體,制粒,得顆粒②,備用;稱取處方量三七總皂苷提取物、糊精,制粒,得顆粒③,備用;稱取適量冰片細粉于研缽中,加入聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40、PEG400,研磨混合,得冰片內(nèi)容物,備用;再以明膠、甘油、山梨醇、PEG 400為膠皮配方,采用滴制法制備冰片微型軟膠囊④,備用;將處方量的顆粒①②③混合均勻,與④裝入同一0號膠囊中,即得FDBC。將FDBC置于(40±2)℃,相對濕度(75±5)%的條件下加速1個月,即得老化的FDBC。

    2.1.2 FDC的制備及老化 按“2.1.1”項下方法制備顆粒①②③,將處方量冰片細粉與顆粒①②③混合均勻,裝入0號膠囊中,即得FDC。將FDC置于(40±2)℃,相對濕度(75±5)%的條件下加速1個月,即得老化的FDC。

    2.2 FDBC中冰片穩(wěn)定性考察

    2.2.1 色譜條件 色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm,0.25 μm)柱;進樣口溫度180 ℃;檢測器溫度220 ℃;柱溫120 ℃;載氣為N2;體積流量1 mL/min;進樣量1 μL;分流比10∶1。

    2.2.2 溶液的配制

    (1)對照品溶液的配制:精密稱取一定量龍腦對照品于棕色量瓶中,醋酸乙酯溶解并定容,得質(zhì)量濃度為1.41 mg/mL的龍腦對照品溶液。

    (2)內(nèi)標溶液的配制:精密稱取一定量萘標準品于棕色量瓶中,醋酸乙酯溶解并定容,得質(zhì)量濃度為1.38 mg/mL萘內(nèi)標溶液。

    (3)供試品溶液的配制:取FDBC內(nèi)容物約0.5 g,精密稱定,剪破微型軟膠囊后置量瓶中,精密加入0.8 mL內(nèi)標溶液,加醋酸乙酯超聲10 min(250 W、40 kHz),放冷,醋酸乙酯定容,過0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

    (4)陰性對照溶液的配制:取不含冰片的FDBC內(nèi)容物約0.5 g,精密稱定,剪破微型軟膠囊后置量瓶中,精密加入0.8 mL內(nèi)標溶液,加醋酸乙酯超聲10 min(250 W、40 kHz),放冷,醋酸乙酯定容,過0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液作為陰性對照溶液。

    2.2.3 方法學考察

    (1)系統(tǒng)適用性試驗:在樣品氣相色譜圖中,龍腦的理論塔板數(shù)為6110,分離度為2.47,拖尾因子為0.81,系統(tǒng)適用性良好。

    (2)專屬性考察:將對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液依法測定,結果表明該方法專屬性良好。

    (3)線性關系考察:以龍腦質(zhì)量濃度為橫坐標(),龍腦與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標()進行線性回歸,得回歸方程=7.424 5+0.013 8,2=0.999 6,結果表明龍腦在0.028~1.125 mg/mL線性關系良好。

    (4)精密度考察:取同一龍腦對照品溶液重復進樣6次,得龍腦與內(nèi)標峰面積比值的RSD為0.63%,結果表明儀器精密度良好。

    (5)穩(wěn)定性試驗:取FDBC供試品溶液,分別于制備后0、2、4、8、10、12 h進樣分析,得龍腦與內(nèi)標峰面積比值的RSD為0.53%,供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

    (6)重復性試驗:平行制備6份FDBC供試品溶液,進樣分析,得龍腦與內(nèi)標峰面積比值的RSD為1.63%,結果表明該方法重復性良好。

    (7)加樣回收試驗:取已測定龍腦含量的FDBC內(nèi)容物,精密加入定量龍腦對照品溶液,平行制備6份供試品溶液,分別進樣分析,計算得龍腦的平均加樣回收率為96.29%,RSD為1.72%。

    2.2.4 影響因素考察 取FDBC、自制FDC與市售FDC,置于蒸發(fā)皿中,于高溫(40±2)℃、高濕(25 ℃,相對濕度92.5%)、光照(4500±500)lx條件下分別放置15 d,分別于0、3、5、7、10、15 d取樣,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進樣分析,計算冰片相對含量(相對于冰片初始值的含量,以龍腦含量計),結果如表1所示。FDBC于高溫(40±2)℃、高濕(25 ℃,相對濕度92.5%)、光照(4500±500)lx條件下放置15 d,冰片含量相對穩(wěn)定,自制和市售FDC于3種條件下放置,隨著時間延長,冰片含量逐漸下降,結果表明在高溫、高濕和光照條件下FDBC中冰片穩(wěn)定存在,而自制和市售FDC中冰片不穩(wěn)定。

    2.2.5 加速實驗 取FDBC、自制FDC、市售FDC,置于(30±2)℃、相對濕度(65±5)%的恒溫恒濕試驗箱中,分別于1、2、3、6個月末取樣,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進樣分析,計算冰片相對含量(以龍腦含量計),結果如表2所示。加速實驗6個月后,F(xiàn)DBC中冰片稍有下降,但仍大于90%;自制和市售FDC加速實驗2個月后,冰片含量已不足50%,加速實驗6個月后,冰片質(zhì)量分數(shù)分別下降至33.46%和42.86%。表明在加速實驗條件下,F(xiàn)DBC中冰片相對穩(wěn)定,自制和市售FDC中冰片不穩(wěn)定。

    表1 高溫、高濕、光照對冰片穩(wěn)定性的影響(, n = 3)

    表2 加速實驗結果

    2.3 FDBC體外溶出評價

    2.3.1 溶液的制備

    (1)對照品溶液的制備:①丹參混合對照品溶液:精密稱取一定量丹酚酸B、丹參酮IIA對照品置量瓶中,甲醇溶解并定容,得丹參混合對照品溶液(丹酚酸B與丹參酮IIA的質(zhì)量濃度分別為114.43、40.12 μg/mL)。②三七混合對照品溶液:精密稱取一定量R1、Rg1、Rb1對照品置量瓶中,甲醇溶解并定容,得三七混合對照品溶液(質(zhì)量濃度分別為R1140.5 μg/mL、Rg1282.4 μg/mL、Rb1293.9 μg/mL)。

    (2)供試品溶液的制備:取FDBC內(nèi)容物約0.5 g,精密稱定,剪破微型軟膠囊后置量瓶中,加70%甲醇超聲30 min(250 W、40 kHz),放冷,70%甲醇定容,過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

    (3)陰性對照溶液的制備:取不含丹參水溶性、脂溶性提取物和三七總皂苷提取物的FDBC內(nèi)容物約0.5 g,精密稱定,剪破微型軟膠囊后置量瓶中,加70%甲醇超聲30 min(250 W、40 kHz),放冷,70%甲醇定容,過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液作為陰性對照溶液。

    (4)龍腦對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液的制備:同“2.2.2”項。

    2.3.2 丹參和三七成分色譜條件

    (1)丹參成分色譜條件:色譜柱為Diamonisl C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-0.5%甲酸水溶液,梯度洗脫:0~12 min,30%乙腈;12~20 min,30%~80%乙腈;20~30 min,80%乙腈;30~35 min,80%~30%乙腈;35~40 min,30%乙腈;柱溫30 ℃;體積流量1 mL/min;進樣量20 μL;檢測波長286、270 nm。

    (2)三七成分色譜條件:色譜柱為Diamonisl C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-水,梯度洗脫:0~12 min,19%乙腈;12~35 min,19%~38%乙腈;35~45 min,38%乙腈;45~50 min,38%~19%乙腈;50~55 min,19%乙腈;柱溫30℃;體積流量1 mL/min;進樣量20 μL;檢測波長203 nm。

    (3)專屬性考察:在上述色譜條件下分別進樣測定對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液,各成分的分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子與信噪比結果見表3,均符合要求,專屬性良好。

    表3 各成分系統(tǒng)適用性結果

    2.3.3 龍腦檢測條件

    (1)色譜條件:色譜柱為VF-WAXms毛細管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);柱溫145 ℃;進樣口溫度250 ℃;載氣He;體積流量1 mL/min;分流比20∶1;進樣量1 μL。

    (2)質(zhì)譜條件:傳輸線溫度250 ℃;EI源能量70 eV;離子源溫度230 ℃;溶劑延遲4 min;SIM掃描(龍腦95,萘128)。

    (3)專屬性考察:在上述檢測條件下分別進樣測定龍腦對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液,結果表明該方法專屬性良好。

    2.3.4 方法學考察

    (1)線性關系考察:以質(zhì)量濃度為橫坐標(),峰面積為縱坐標()進行線性回歸,得丹酚酸B、丹參酮IIA、R1、Rg1、Rg1的回歸方程分別為= 21 123-72 007(2=0.999 8)、=32 760- 5 709.9(2=1.000 0)、=4 532.7+9 797.1(2=0.999 5)、=8 716.3+14 709(2=0.999 9)、=4 324.9+3 682.2(2=0.999 8),線性范圍分別為4.005~114.427、1.404~40.118、2.195~140.500、2.206~282.400、2.296~293.900 μg/mL,結果表明各成分線性關系良好。

    以龍腦質(zhì)量濃度為橫坐標(),龍腦與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標(),進行線性回歸,得線性回歸方程=0.357 5+0.030 6,2=0.999 7,結果表明龍腦在0.793~317.200 μg/mL線性關系良好。

    (2)精密度考察:分別取丹參混合對照品溶液、三七混合對照品溶液,重復進樣6次,得丹酚酸B、丹參酮IIA、R1、Rg1和Rb1的RSD分別為1.34%、1.10%、1.95%、1.59%、1.59%,結果表明儀器精密度良好。

    (3)穩(wěn)定性考察:取FDBC供試品溶液,分別于制備后0、2、4、8、10、12、24、36、48、60、72 h進樣分析,得丹酚酸B、丹參酮IIA、R1、Rg1和Rb1的RSD分別為1.82%、1.86%、1.00%、2.06%、1.59%,結果表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

    (4)重復性考察:平行制備6份FDBC供試品溶液進樣分析,得丹酚酸B、丹參酮IIA、R1、Rg1和Rb1的RSD分別為1.85%、1.54%、1.65%、1.57%、1.45%,結果表明該方法重復性良好。

    (5)加樣回收率考察:取已測定各成分含量的FDBC,精密加入定量丹參混合對照品溶液和三七混合對照品溶液,平行制備6份供試品溶液進樣分析,得丹酚酸B、丹參酮IIA、R1、Rg1和Rb1的平均加樣回收率分別為92.36%、91.05%、101.87%、102.01%、96.53%,RSD分別為1.44%、2.19%、1.95%、1.25%、1.99%。

    2.3.5 體外溶出試驗

    (1)溶出介質(zhì):本實驗選擇pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、含0.5% SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液和純水4種溶出介質(zhì)進行溶出度試驗。

    (2)介質(zhì)體積的選擇:分別以上述4種介質(zhì)進行測試,介質(zhì)體積500 mL,轉(zhuǎn)速100 r/min,取FDBC,按《中國藥典》2020年版四部通則溶出度測定方法第二法[17]操作,在60 min時取樣,進樣分析,結果只有丹參酮IIA的信噪比>10,可以定量,其他4種成分的信噪比<10,無法定量,故考慮采用小杯法,介質(zhì)體積250 mL。

    (3)溶出轉(zhuǎn)速的選擇:取FDBC,以pH 6.8磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì),體積為250 mL,轉(zhuǎn)速分別為50、75、100 r/min,按《中國藥典》2020年版四部通則溶出度測定方法第三法操作,在5、10、15、30、45、60 min取樣5 mL,過0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液適量,分別按“2.3.2”項下丹參和三七色譜條件進樣分析。另取剩余續(xù)濾液1 mL,加入0.8 mL萘內(nèi)標溶液,振搖1 min后,以3500 r/min(離心半徑16 cm)離心5 min,取上層液,按“2.3.2”項下龍腦檢測條件進樣。各成分累積溶出率測定結果見圖1。由結果可知,轉(zhuǎn)速為75、100 r/min時,各成分的累積溶出率均優(yōu)于50 r/min;其中,Rg1在75 r/min時的累積溶出率明顯高于100 r/min時的累積溶出率,而其他成分在75、100 r/min時累積溶出率差異不明顯。故綜合來看,轉(zhuǎn)速選擇75 r/min。由于在3種轉(zhuǎn)速下,丹參酮IIA的累積溶出率均極小,故考慮在溶出介質(zhì)中添加表面活性劑來增加其溶出度。

    圖1 各成分在不同轉(zhuǎn)速下的溶出曲線

    (4)表面活性劑種類及用量的選擇:取FDBC,分別以pH 6.8磷酸鹽緩沖液,含0.01%、0.1%、0.5% T80及SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì),體積為250 mL,轉(zhuǎn)速為75 r/min,按《中國藥典》2020年版四部通則溶出度測定方法第三法操作,分別在5、10、15、30、45、60 min取樣,按“2.3.2”項下丹參色譜條件檢測丹參酮IIA,計算累積溶出率,結果見圖2。由結果可知,添加0.1% SDS、0.5% T80和0.5% SDS后可顯著提高丹參酮IIA在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的累積溶出率,且丹參酮IIA在含0.5% SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中累積溶出率最大,故表面活性劑選擇SDS,用量為0.5%。

    圖2 添加不同表面活性劑后丹參酮IIA的溶出曲線

    (5)溶出曲線的測定:按照《中國藥典》2020年版四部通則溶出度測定方法第三法,取脫氣后的溶出介質(zhì)250 mL,溫度(37.0±0.5)℃,轉(zhuǎn)速75 r/min,取FDBC 6粒,分別投入溶出杯中,分別于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300 min取樣5 mL,同時補充等溫等體積溶出介質(zhì),過0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液適量按“2.3.2”項下丹參和三七色譜條件進樣測定各成分的含量。

    另取剩余續(xù)濾液1 mL加入0.8 mL萘內(nèi)標溶液,振搖1 min后,以3500 r/min(離心半徑16 cm)離心5 min,吸取上層液,按“2.3.2”項下龍腦檢測條件進樣測定龍腦的含量。

    依次更換溶出介質(zhì),分別按照上述方法進行溶出測定。FDC及老化后的FDBC、FDC的溶出度測定與上述方法相同。結果見圖3~6。

    由圖3可知,在pH 1.2鹽酸溶液中,前45 min各膠囊中龍腦的累積溶出率差異不大,45~60 min老化的FDC中龍腦的累積溶出率明顯低于其他3種膠囊。在pH 1.2鹽酸溶液中,300 min內(nèi)4種膠囊中除龍腦外其他有效成分的累積溶出率均不足10%,可能是在酸性條件下,大部分丹酚酸B、R1、Rg1及Rb1發(fā)生了降解反應[18-19],導致檢測到的濃度減少,計算所得累積溶出率相應減少。

    由圖4~6可知,①在pH 4.5醋酸緩沖液、含0.5% SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液和純水3種溶出介質(zhì)中,與FDC相比,F(xiàn)DBC和老化的FDBC中各成分的溶出曲線均相似,表明FDBC將冰片制備成微型軟膠囊不會對各有效成分的體外釋藥行為產(chǎn)生影響;②老化的FDC在3種溶出介質(zhì)中各有效成分的溶出曲線均與FDC有明顯差異,表明FDC老化后會影響有效成分的體外釋藥行為;③FDBC與老化的FDBC相比,各有效成分的溶出曲線無明顯差異,表明老化處理對FDBC中各有效成分的體外釋藥行為無明顯影響,冰片微型軟膠囊沒有導致釋藥遲緩。

    2.4 FDBC對急性心肌缺血大鼠的保護作用

    2.4.1 動物分組與給藥 SD大鼠,雄性,48只,適應性飼養(yǎng)7 d,隨機分為6組:對照組、模型組(ISO,5 mg/kg)、FDBC組(SX-Z,400 mg/kg)、FDBC老化組(SX-L,400 mg/kg)、FDC組(PT-Z,400 mg/kg)和FDC老化組(PT-L,400 mg/kg)。FDC和FDBC中的固體顆粒用0.5%羧甲基纖維素鈉按所需劑量配制成混懸液,ig給藥,給藥體積為10 mL/kg,F(xiàn)DBC中的冰片軟膠囊用膠囊投灌胃藥器給予,每天1次,對照組和模型組ig相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,連續(xù)給藥7 d。

    圖4 pH 4.5醋酸緩沖液中各有效成分溶出曲線

    Fig 4 Dissolution curve of each active component in pH 4.5 acetate buffer

    圖5 含0.5% SDS的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中各有效成分溶出曲線

    2.4.2 異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血模型的制備 給藥第5~7天,除對照組外,所有各組給藥30 min后,背部多點sc ISO(5 mg/kg),每天1次,連續(xù)3 d制作急性心肌缺血模型,時間間隔24 h,對照組注射等體積生理鹽水[20],實驗期間動物自由飲食和飲水。

    圖6 含0.5% SDS的純水中各有效成分溶出曲線

    2.4.3 心電圖的測量 末次sc ISO前,以10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠,仰臥固定,連接生理記錄儀,記錄肢體II導聯(lián)體表心電圖,分析ST段的變化,結果見表1。由結果可知,ISO誘導前,各組大鼠心電圖ST段無明顯差異;ISO誘導后,與對照組比較,模型組大鼠ST段值升高近0.2 mV,差異顯著(<0.01);與模型組比較,各給藥組大鼠ST段值均降低,其中SX-Z組、SX-L組與PT-Z組降低顯著,有統(tǒng)計學差異(<0.05),PT-L組無統(tǒng)計學差異。

    表1 各組心電圖ST段變化(, n = 8)

    與對照組比較:##<0.01;與模型組比較:*<0.05,表2同

    ##< 0.01control group;*< 0.05model group, same as table 2

    2.4.4 心臟指數(shù)的測定 實驗完畢處死大鼠,迅速開胸取心臟,生理鹽水沖洗余血,至心臟基本不出血為止,濾紙吸干多余水分后稱定質(zhì)量,計算心臟指數(shù)(心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量),結果見表2。與對照組相比,模型組大鼠心臟指數(shù)顯著升高(<0.01);與模型組相比,SX-Z組、SX-L組、PT-Z組和PT-L組心臟指數(shù)明顯降低(<0.05)。

    表2 各組心臟指數(shù)測定結果(, n = 8)

    2.4.5 心肌病理學檢查 心臟稱定質(zhì)量后,取心尖組織,4%多聚甲醛固定24~72 h,固定好的組織經(jīng)系列乙醇、二甲苯脫水處理后,石蠟包埋,切片,脫蠟,蘇木素染色,1%鹽酸乙醇溶液分化,自來水洗反藍后,伊紅染色,中性樹脂封片。光鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學變化并拍照,結果見圖7??芍瑢φ战M心肌細胞紋理清晰排列整齊,結構完整,無炎細胞浸潤;模型組心肌細胞紋理界限模糊,排列紊亂,心肌細胞水腫,有大量炎細胞浸潤;SX-Z組、SX-L組、PT-L組和PT-Z組均可不同程度減輕ISO引起的心肌組織病變,心肌細胞水腫減輕,炎細胞浸潤明顯減少。

    圖7 各組HE染色結果(HE, ×20)

    2.4.6 血清指標的測定 心電圖監(jiān)測完成后,腹主動脈取血6 mL,室溫凝聚1 h后,3500 r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min,分離上層血清放入EP管內(nèi),?80 ℃冰箱保存。測定時快速解凍,按照試劑盒說明書檢測定血清中CK、LDH、cTn-T、SOD、MDA、TNF-α和IL-6水平,結果見表3。

    與對照組相比,模型組大鼠血清中CK活力和cTn-T水平顯著升高(<0.01),LDH活力也明顯升高(<0.05);與模型組相比,SX-Z組、SX-L組、PT-Z組和PT-L組大鼠血清中CK活力顯著降低(<0.01),LDH活力也明顯降低(<0.05);與模型組相比,SX-Z組和PT-Z組大鼠血清中cTn-T水平顯著降低(<0.01),SX-L組和PT-L組大鼠血清中cTn-T水平也明顯降低(<0.05)。

    與對照組相比,模型組大鼠血清中SOD活力顯著降低,MDA、TNF-α和IL-6含量顯著升高(<0.01);與模型組相比,SX-Z組、SX-L組和PT-Z組大鼠血清中SOD活力明顯升高(<0.05),炎癥因子IL-6含量顯著降低(<0.01),PT-L組大鼠血清中SOD活力無明顯差異,IL-6含量明顯降低(<0.05);與模型組相比,SX-Z組、SX-L組、PT-L組和PT-Z組大鼠血清中MDA含量顯著降低(<0.01);與模型組相比,SX-Z組大鼠血清中炎癥因子TNF-α含量顯著降低(<0.01),SX-L組和PT-Z組大鼠血清中炎癥因子TNF-α含量明顯降低(<0.05),PT-L組大鼠血清中炎癥因子TNF-α含量無明顯差異。

    表4 血清中CK、LDH、cTn-T、SOD、MDA、IL-6和TNF-α測定結果(, n = 8)

    與對照組比較:#<0.05##<0.01;與模型組比較:*<0.05**<0.01

    #< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

    3 討論

    3.1 FDBC對冰片穩(wěn)定性的影響

    通過比較FDBC與FDC在高溫、高濕、光照條件下放置15 d及加速實驗6個月后冰片含量的變化,發(fā)現(xiàn)FDBC中冰片含量更為穩(wěn)定,表明將冰片制成微型軟膠囊后再與其它固體成分裝填于同一硬膠囊的處理方式可以顯著提高冰片的穩(wěn)定性。

    3.2 FDBC對其他成分體外釋放的影響

    通過對溶出轉(zhuǎn)速、介質(zhì)體積及表面活性劑等進行考察,確立了丹參酮IIA、丹酚酸B、R1、Rg1及Rb1溶出度測定方法。比較發(fā)現(xiàn),F(xiàn)DBC與FDC的溶出曲線基本一致,表明FDBC對冰片的特殊處理不會對其體外釋藥行為產(chǎn)生影響。其次FDC老化后各時間點的累積溶出率明顯減少,說明FDC老化后釋藥速率降低,釋藥遲緩,而FDBC老化后,各時間點的累積溶出率與FDBC無明顯差異,說明老化處理不會影響其體外釋藥行為,顯示出FDBC的優(yōu)越性。

    3.3 FDBC對急性心肌缺血大鼠的保護作用

    ISO是一種β受體激動劑,可興奮心臟,造成心肌細胞缺血缺氧,其發(fā)病機制可能與氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、炎癥反應、脂質(zhì)過氧化、細胞自噬和凋亡等直接或間接相關,與人體心肌缺血損傷的代謝和形態(tài)學異常有許多相似之處[21]。ISO誘導的動物模型,實驗操作簡單易行、成本低,常用于制備輕度心肌損傷、心肌肥厚(多用5 mg/kg)、心肌梗死(10~120 mg/kg或150~400 mg/kg,常用85 mg/kg)以及心力衰竭等動物模型[22],因此,本實驗采用5 mg/kg的ISO制備SD大鼠急性心肌缺血模型。

    心電圖ST抬高是臨床心肌缺血診斷標志之一,其抬高程度可以反映心肌缺血和損傷的程度[23]。本實驗大鼠注射ISO后,模型組心電圖ST段明顯抬高,出現(xiàn)心肌缺血癥狀,而FDBC和FDC干預可抑制ST段的抬高,說明二者均有一定的抗心肌缺血作用。2種膠囊老化后也均可抑制ST段的抬高,其中老化的FDBC的抑制效果更明顯。

    CK、LDH是心肌組織中特異性較高的酶,當心肌損傷時,心肌細胞膜通透性改變,多種心肌酶從心肌細胞中釋放入血,使CK、LDH等在血清中含量顯著升高[24]。cTn-T是一種心肌收縮調(diào)節(jié)蛋白,一般在心肌細胞受損14~24 h,其血清水平達高峰,是反映心肌損傷的標志物之一[25]。本實驗發(fā)現(xiàn),大鼠注射ISO后,大鼠血清中CK、LDH和cTn-T水平顯著升高,而FDBC和FDC干預可以明顯改善這些心肌酶水平的升高。FDBC老化后,仍可抑制血清中CK、LDH和cTn-T水平顯著升高,只是對cTn-T水平的抑制作用稍減弱;FDC老化后,對CK和cTn-T的抑制作用均減弱。

    心肌組織病理學結果顯示,ISO誘導心肌缺血后,心肌細胞破損,排列紊亂,并伴有細胞間隙水腫及大量炎細胞浸潤,F(xiàn)DBC可以明顯改善由ISO引起的心肌組織病理學改變,F(xiàn)DC和老化后的兩種膠囊也可改善該心肌組織病理學改變。

    SOD是機體內(nèi)抗氧化酶防御機制之一,在消除氧自由基中起重要作用,MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,SOD的活力和MDA的含量可間接反應細胞所承受的自由基的損傷程度[26-27]。當心肌組織缺氧,會引起炎癥細胞的聚集并釋放IL-6、TNF-α等炎癥因子,同時產(chǎn)生大量的自由基,進一步引起心肌損傷[28],有文獻報道丹酚酸類成分能對抗炎性因子而保護心肌[29]。本實驗結果顯示,F(xiàn)DBC、FDBC和老化的FDBC可以顯著降低ISO誘導的心肌缺血大鼠血清中MDA、IL-6及TNF-α水平,提高SOD活力,提示其改善心肌缺血的機理可能與對抗缺血心肌的氧化應激及炎癥反應有關。FDC老化后雖仍可對抗氧化應激及炎癥反應,但抑制TNF-α水平和提高SOD活力的效果不明顯。

    綜上所述,F(xiàn)DBC特有的冰片處理方式可以顯著降低冰片揮發(fā)損失,同時不會對其有效成分的體內(nèi)外釋藥行為及藥效作用產(chǎn)生不利影響,顯示出FDBC的制劑優(yōu)越性,為解決中藥揮發(fā)性物質(zhì)不穩(wěn)定問題提供了研究思路。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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    andevaluation of Fufang Danshen Biphasic Capsules

    XIA Ming-yan1, 2, WU Qiu-yang1, 3, WANG Can-jian1, 2, YANG Tao1, LI Dong-xun1, 2, WEI Xin-hua1, 2, WANG Tang-xun1, 2, ZHANG Guan-sheng1, 2, ZHANG Wen-liu1, 2, ZHANG Guo-song1, 2

    1. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, China 2. National Engineering Research Center of Chinese Medicine Solid Preparation Manufacturing Technology, Nanchang 330006, China 3. Pharmaron Beijing Co., Ltd., Beijing 101100, China

    In order to confirm that Fufang Danshen Biphasic Capsules (FDBC, 復方丹參雙相膠囊) can reduce the mass loss caused by volatilization of borneol without affecting theanddrug release behavior of other active ingredients, a comparative study was conducted between FDBC and Fufang Danshen Capsules (FDC, 復方丹參膠囊).GC method was used to determine the content of borneol in FDBC and FDC under high temperature, high humidity, bright light and accelerated experimental conditions. Using pH 1.2 hydrochloric acid solution, pH 4.5 acetate buffer, pH 6.8 phosphate buffer and pure water as the dissolution medium, the cumulative dissolution rate of tanshinone IIA, salvianolic acid B, notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1at different time points was adopted by the small cup method, then the dissolution curve was drawn. The rat model of acute myocardial ischemia was prepared by isoprenaline hydrochloride (ISO). After 7 days of prophylactic administration, the changes of ST segment of the rat's electrocardiogram were monitored, the pathological damage of myocardial tissue was observed by hematoxylin-eosin staining, and the levels of creatine kinase (CK), lactic dehydrogenase (LDH), cardiac troponin-T (cTn-T), superoxide dismutase (SOD), malonaldehyde (MDA), tumornecrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in rat serum were determined with kits.The content of borneol in FDBC remained above 94.61% under high temperature, high humidity, bright light conditions and accelerated experimental conditions, while the content of borneol in FDC decreased significantly. The dissolution profiles of FDBC and FDC were similar. FDBC could improve the changes of ST segment of ECG in rats with myocardial ischemia induced by ISO, reduce the content of myocardial enzymes in serum, keep the structure of myocardial cells intact, and have obvious anti-myocardial ischemia effect. FDC had the same anti-myocardial ischemia effect.Compared with FDC, FDBC can significantly reduce the mass loss caused by volatilization of borneol without affecting therelease and pharmacological effects of other components, showing the advantages of FDBC.

    Fufang Danshen Biphasic Capsules; Fufang Danshen Capsules; stability;dissolution; borneol; tanshinone IIA; salvianolic acid B; notoginsenoside R1; ginsenoside Rg1; ginsenoside Rb1; myocardial ischemia; myocardial enzymes

    R283.6

    A

    0253 - 2670(2023)04 - 1064 - 12

    10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.006

    2022-08-12

    國家自然科學基金資助項目(81660667);國家自然科學基金資助項目(81960720);江西省主要學科學術和技術帶頭人資助項目(20182BCB22023);江西中醫(yī)藥大學創(chuàng)新藥物研究與開發(fā)創(chuàng)新團隊資助;南昌市高層次科技創(chuàng)新人才“雙百計劃”項目資助;江西中醫(yī)藥大學博士科研啟動基金項目資助(2021BSZR014)

    夏明艷(1991—),女,碩士研究生,研究方向為新藥開發(fā)及仿制藥一致性評價研究。Tel: (0791)87119617 E-mail: 2844797505@qq.com

    張國松(1981—),男,博士,教授,博士生導師,研究方向為藥物新劑型與新技術研究。Tel: (0791)87119623 E-mail: zhgs81411@aliyun.com

    張文锍(1976—),男,碩士,副教授,碩士生導師,研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)的研究。Tel: (0791)87119623 E-mail: 1764523036@qq.com

    #共同第一作者:吳秋焱(1997—),女,碩士研究生,研究方向為藥物新劑型與新技術。

    [責任編輯 鄭禮勝]

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