幽門螺桿菌6S RNA敲除菌株構(gòu)建及對細(xì)胞毒性的影響

崔古貞，管玉祝，劉 芳，王鑫鑫，吳道艷，洪 偉,3，向 松，張崢嶸，張玉典，陳崢宏

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一類定植在人類胃粘膜上皮細(xì)胞可引起慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等多種疾病的主要病原體[1-3]。全球約50%以上人口感染Hp，僅我國感染人數(shù)就達(dá)7億之多，是人類最大的潛在危害因素之一，被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌因子[3-5]。深入研究Hp致病機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制，對Hp感染、預(yù)防、治療及疫苗研發(fā)等方面具有重要意義。

6SRNA是一類與RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)全酶特異性結(jié)合干擾靶基因轉(zhuǎn)錄的非編碼小調(diào)控RNA[6-7]。6SRNA由一個(gè)帶有中間環(huán)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)組成，與解鏈的DNA啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)相似，可與解鏈的DNA啟動(dòng)子競爭結(jié)合RNAP，從而抑制靶基因表達(dá)。因此，6SRNA作為一類抗轉(zhuǎn)錄因子(Anti-Transcription Factor)調(diào)控RNAP活性[8-10](圖1)。

A：幽門螺桿菌6S RNA(Hp-6S RNA)二級結(jié)構(gòu)示意圖；B：解鏈啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意圖；C：6S RNA調(diào)控模型圖1 6S RNA結(jié)構(gòu)及調(diào)控模型Fig.1 6S RNA structure and regulation model

近來，利用差異RNA測序發(fā)現(xiàn)Hp也編碼一類特殊的6SRNA(我們稱之為Hp-6SRNA)，能以自身RNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩類不同的小產(chǎn)物RNA(pRNA)，可能具有調(diào)節(jié)自身活性的功能[11]。此外，由于Hp缺乏多種常規(guī)操縱子，沒有RNA分子伴侶(Hfq)輔助RNA加工和成熟，僅有3種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(σ80、σ54和σ28)，編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子極其有限[12-13]。因此，我們推測Hp-6SRNA可能具有調(diào)控多種細(xì)胞表型的重要功能。

為了研究Hp-6SRNA的生物學(xué)功能及其對Hp毒力的影響，本文構(gòu)建了Hp-6SRNA敲除載體，并利用同源重組技術(shù)敲除了Hp-6SRNA基因，成功獲得了HpΔ6SRNA工程菌株，并檢測了Hp-6SRNA敲除對幽門螺桿菌生長及細(xì)胞毒力的影響，為Hp-6SRNA生物學(xué)功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 大腸桿菌E.coliDH5ɑ菌株在LB液體培養(yǎng)基(1%氯化鈉，1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母抽提物)中置于180 r/min、37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)。菌落篩選時(shí)利用LB固體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基中補(bǔ)充1.5%瓊脂)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，必要時(shí)補(bǔ)充終濃度50 μg/mL的卡那霉素。

幽門螺桿菌(ATCC_700392)利用BHI液體培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于10% CO2、120 r/min、37 ℃微需氧條件下振蕩培養(yǎng)。菌落篩選時(shí)利用含10%脫脂棉羊血的BHI固體培養(yǎng)基(1.5%瓊脂)于10% CO2、37 ℃微氧條件下培養(yǎng)，必要時(shí)補(bǔ)充終濃度25 μg/mL的卡那霉素。

1.1.2 主要試劑及儀器

1.1.2.1 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶、T4連接酶購自賽默飛世爾科技(中國)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，抗生素、胰蛋白胨、酵母抽提物等常規(guī)生化耗材購自索萊寶科技有限公司，引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.1.2.2 主要儀器 隔水式培養(yǎng)箱(武漢精華，303A13-4型)，全溫振蕩器(朗越儀器，RH-Q型)，光學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器，SMART系列)，基因?qū)雰x(東芝-SCIENTZ)，PCR儀、離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)，電泳儀(北京六一，DYY-7C型)，凝膠成像分析系統(tǒng)系統(tǒng)(北京百晶生物技術(shù)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(Heal Force，HF151型)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.1.3 引物 本研究所用引物詳見表1。

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建 首先，以Hp26695基因組DNA為模板，以6S-QU1/6S-QD1為引物，PCR擴(kuò)增6SRNA基因上游同源臂(Up)，利用EcoRI與PstI酶切后與經(jīng)同源酶切的pSD質(zhì)粒連接，構(gòu)建上游同源臂載體pSD-6S-U；然后，以Hp26695基因組DNA為模板，以6S-QU2/6S-QD2為引物，PCR擴(kuò)增6SRNA基因下游同源臂(Down)，利用BamH I與ClaI酶切后與經(jīng)同源酶切的pSD-6S-U質(zhì)粒連接，構(gòu)建6SRNA基因敲除載體pSD-6S(圖2A)。將6SRNA基因與CatP基因鏈接后經(jīng)XbaI和BglII雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pSD-LctP質(zhì)粒鏈接構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒pGZ-6SRNA。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；終延伸72 ℃ 2 min。

1.3 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化子篩選 感受態(tài)細(xì)胞制備：首先，接種Hp26695菌種至BHI 血瓊脂平板，置于37 ℃微需氧(10% CO2、5% O2、85% N2)條件下培養(yǎng)1～2 d；然后，用接種環(huán)刮取Hp菌體至預(yù)冷的感受態(tài)制備緩沖液(15%甘油，9%蔗糖)，菌懸液濃度稀釋至1×108～1×109CFU/mL，然后利用預(yù)冷的感受態(tài)制備緩沖液離心(4 ℃，5 000 r/min，5 min)洗滌3次；最后，將菌懸液以50 μL/管進(jìn)行分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選：首先，取-80 ℃凍存的感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，加入0.5～2 μg質(zhì)粒混勻后置于冰上2～5 min，吸取混合液至預(yù)冷的0.2 mm的電擊杯中，冰上繼續(xù)放置1 min；然后，利用電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)條件設(shè)置為2.5 kV、50 Ω、1 F，電轉(zhuǎn)后立即向電擊杯中加入100 μL胎牛血清，混勻后吸出接種至BHI血瓊脂平板，于37 ℃、微需氧條件培養(yǎng)24 h，收集菌體于0.85%生理鹽水中，混勻接種于含卡那霉素的BHI血平板，37 ℃、微需氧繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d；最后，挑取卡那霉素抗性平板上生長的菌落，液體培養(yǎng)后提取基因組DNA，利用引物Kan-1/Kan-2、6S-QD1/6S-QU2進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)以野生型Hp26695基因組DNA做對照，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測6SRNA基因敲除情況。

A：6S RNA敲除質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；B：6S RNA敲除菌株篩選示意圖圖2 幽門螺桿菌6S RNA敲除質(zhì)粒構(gòu)建及敲除菌株篩選示意圖Fig.2 Construction of the 6S RNA knockout plasmid for H. pylori and screening of the knockout strain

1.4 RNA制備及qRT-PCR 根據(jù)總RNA制備試劑盒(RNAprep Pure，天根生化科技有限公司)操作說明提取野生菌株及工程菌株的總RNA，利用HiFiScript cDNA試劑盒(北京康為世紀(jì)，CW2569M)制備cDNA，最后，根據(jù)UltraSYBR mixture試劑盒操作說明進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。

1.5 掃描電鏡觀察 將-80 ℃保存的幽門螺桿菌接種至BHI固體培養(yǎng)基，挑取單菌落與BHI液體培養(yǎng)基中置于37 ℃、微需氧條件下培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，1×PBS緩沖液洗滌2～3次，加2.5%固定液固定過夜，電鏡觀察幽門螺桿菌細(xì)胞表面形態(tài)的變化。

1.6 生長曲線 首先，將-80 ℃保存的幽門螺桿菌接種于BHI血瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃、10% CO2微需氧條件下培養(yǎng)2～3 d，挑選固體培養(yǎng)基上透明針尖樣菌落接種至新鮮的BHI血瓊脂固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后；然后，用接種環(huán)取適量細(xì)菌至0.85%無菌生理鹽水中，制備麥?zhǔn)?.0的菌懸液，按1∶100比例接種至含10%胎牛血清的BHI液體培養(yǎng)基(pH7.5)中，于37 ℃、120 r/min、微需氧條件下振蕩培養(yǎng)，繪制不同菌株的生長曲線。

1.7 幽門螺桿菌胞內(nèi)提取物制備 分別取100 mL培養(yǎng) 24 h、36 h、48 h和60 h的細(xì)菌培養(yǎng)液于4 ℃、5 000 r/min條件下離心收集菌體，加入10 mL RPMI 1640培養(yǎng)液混勻后置冰上超聲破碎(10 s/10 s，30 min)，離心后收集上清并用 0.22 μm 濾膜過濾，利用BCA法測定蛋白濃度。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性分析 取100 L GES-1胃粘膜上皮細(xì)胞懸液(5103)加入96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別取10 L幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液及胞內(nèi)提取物(蛋白濃度為2.5 mg/mL)加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在每孔內(nèi)加入10 L的CCK-8試劑(日本DOJINDO 公司)，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度。

2 結(jié) 果

2.1Hp-6SRNA轉(zhuǎn)錄分析 取培養(yǎng)至對數(shù)期的幽門螺桿菌分別接種至BHI培養(yǎng)基中于37 ℃、150 r/min、微需氧(10% CO2，5% O2，85% N2)條件下培養(yǎng)，提取總RNA，利用qRT-PCR分析Hp-6SRNA轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果如圖3所示，Hp-6SRNA在對數(shù)期轉(zhuǎn)錄最豐富，隨細(xì)胞生長其轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度逐漸降低，至生長末期幾乎不轉(zhuǎn)錄，表明Hp-6SRNA可能在生長前期對幽門螺桿菌起主要調(diào)控作用。

圖3 6S RNA在不同生長階段轉(zhuǎn)錄分析Fig.3 Transcriptional analysis of 6S RNA at different growth stages

2.2Hp-6SRNA敲除菌株及回補(bǔ)菌株構(gòu)建 以pSD自殺質(zhì)粒為基礎(chǔ)，將6SRNA上下游同源臂構(gòu)建到卡那霉素抗性基因兩側(cè)，構(gòu)建6SRNA基因敲除質(zhì)粒pSD-6S(質(zhì)粒構(gòu)建流程詳見圖2)，利用PCR檢測敲除質(zhì)粒，如圖4A所示，測序證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。然后，將敲除質(zhì)粒pSD-6S利用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化Hp26695，涂布卡那霉素抗性平板，篩選陽性菌株，利用PCR進(jìn)行檢測，瓊脂糖凝膠電泳分析條帶大小與預(yù)期一致(圖4B)，表明Hp-6SRNA敲除菌株構(gòu)建成功，工程菌株命名為：HpΔ6SRNA。利用同樣方法將回補(bǔ)質(zhì)粒pGZ-6S RNA轉(zhuǎn)化到HpΔ6SRNA中，構(gòu)建回補(bǔ)菌株HpΔ6SRNA::6SRNA，氯霉素抗性篩選及PCR檢測與預(yù)期結(jié)果一致(圖4C)，表明回補(bǔ)菌株構(gòu)建成功。

A：6S RNA敲除載體PCR檢測，泳道1：引物6S-QU1和6S-QD1；泳道2：引物6S-QU2和6S-QD2。B：6S RNA敲除菌株(HpΔ6S RNA)PCR檢測,引物6S-QD1和6S-QU2，泳道1：野生型對照；泳道2：HpΔ6S RNA。C：6S RNA回補(bǔ)菌株(HpΔ6S RNA::6S RNA)PCR檢測，泳道1：引物pGZ-1和pGZ-2，HpΔ6S RNA::6S RNA；泳道2：引物pGZ-6sTY1和pGZ-6sTY2，HpΔ6S RNA::6S RNA；泳道3：引物pGZ-1和pGZ-2，野生型對照；泳道4：引物pGZ-6sTY1和pGZ-6sTY2，野生型對照；泳道5-6：空白對照。圖4 6S RNA敲除菌株及回補(bǔ)菌株P(guān)CR檢測Fig.4 PCR detection of the Hp-6S RNA knockout vector and strain

2.3Hp-6SRNA敲除對幽門螺桿菌生長的影響 如圖5所示，6SRNA敲除后細(xì)菌生長方式顯著改變，細(xì)菌生長遲緩期延長，表明6SRNA可能在幽門螺桿菌生長初期起重要的調(diào)控作用。然而，6SRNA基因回補(bǔ)之后，回補(bǔ)菌株的生長方式與敲除菌株類似，并沒有恢復(fù)到野生型(圖5)。

圖5 幽門螺桿菌生長曲線Fig.5 Growth curve of H. pylori

2.4Hp-6SRNA敲除影響了幽門螺桿菌上游基因表達(dá) 為了檢測6SRNA敲除對幽門螺桿菌上下游基因表達(dá)的影響，我們提取細(xì)菌總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測。如圖6所示，6SRNA敲除后對下游基因Hp1217和Hp1218表達(dá)水平影響較小，但顯著增強(qiáng)了其上游基因Hp1220和Hp1221的表達(dá)。盡管6SRNA基因回補(bǔ)能夠恢復(fù)Hp1220和Hp1221的表達(dá)，但Hp1220基因的表達(dá)仍顯著增強(qiáng)(圖6)。上述結(jié)果表明6SRNA基因敲除影響其上游基因的表達(dá)，可能與上游基因存在一定的連鎖關(guān)系。

A：6S RNA基因所在位置示意圖。Hp1218編碼甘氨酰胺核苷酸合成酶基因purD，Hp1220編碼ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因yhcG；B：6S RNA上下游基因相對轉(zhuǎn)錄水平圖6 6S RNA敲除對上下游基因水平表達(dá)的影響Fig.6 Effects of 6S RNA knockout on the expression of upstream and downstream genes

2.5Hp-6SRNA敲除對細(xì)菌形態(tài)的影響 為了檢測6SRNA敲除對細(xì)菌形態(tài)的影響，我們?nèi)?shù)生長期的幽門螺桿菌進(jìn)行了掃描電鏡觀察(圖7)。電鏡觀察結(jié)果表明，野生菌株與敲除菌株其細(xì)菌形態(tài)均呈現(xiàn)彎曲桿狀，未見顯著變化。盡管電鏡下發(fā)現(xiàn)部分菌體出現(xiàn)球變現(xiàn)象，但球變是多數(shù)幽門螺桿菌培養(yǎng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)的正常現(xiàn)象，且野生株與突變株均存在球變現(xiàn)象?？傊?，掃描電鏡結(jié)果表明6SRNA敲除對細(xì)菌表面形態(tài)無顯著影響。

A：6S RNA野生型；B：6S RNA敲除菌株圖7 掃描電鏡觀察幽門螺桿菌Fig.7 Scanning electron microscopy for H.pylori

2.6Hp-6SRNA敲除降低了幽門螺桿菌對GES-1細(xì)胞的毒性 為了分析6SRNA敲除對幽門螺桿菌毒力的影響，我們利用CCK8實(shí)驗(yàn)比較分析了野生菌株與6SRNA敲除菌株的培養(yǎng)上清液及細(xì)胞內(nèi)容物對GES-1胃粘膜上皮細(xì)胞毒性的影響。如圖8所示，6SRNA敲除后，細(xì)菌培養(yǎng)上清液對GES-1細(xì)胞的毒性降低(OD450的吸光度增加)，盡管在培養(yǎng)36 h時(shí)上清液毒性變化不顯著，但在整個(gè)細(xì)菌生長周期敲除菌株的毒性均有所下降(圖8A)。此外，6SRNA敲除后，細(xì)胞內(nèi)容物的毒性也顯著降低，尤其是在細(xì)菌生長中后期(48 h和60 h)，其細(xì)胞毒性降低更為顯著(圖8B)。從圖3可知，6SRNA在細(xì)菌生長中后期顯著下降，預(yù)示6SRNA不僅對細(xì)菌生長周期具有調(diào)控功能，而且可能負(fù)調(diào)控細(xì)菌毒力相關(guān)基因的表達(dá)。

另外，我們發(fā)現(xiàn)無論是野生菌株還是突變菌株，利用培養(yǎng)上清液處理組的OD450吸光度顯著低于細(xì)胞內(nèi)容物處理組，表明幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液對GES-1細(xì)胞的毒性顯著高于細(xì)胞內(nèi)容物的毒性，進(jìn)一步說明幽門螺桿菌可能合成大量的胞外毒力因子輔助細(xì)菌的定植和其他生理功能?？傊?，6SRNA敲除降低了幽門螺桿菌對GES-1胃粘膜上皮細(xì)胞的毒性，表明6SRNA在調(diào)控細(xì)菌毒力因子方面具有重要功能。

A：幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液對GES-1細(xì)胞毒性的影響；B：幽門螺桿菌細(xì)胞內(nèi)容物對GES-1細(xì)胞毒性的影響圖8 6S RNA敲除對GES-1細(xì)胞毒性的影響Fig.8 Effect of 6S RNA knockout on the cytotoxicity of GES-1

3 討 論

6SRNA作為一種非編碼小調(diào)控RNA在多個(gè)物種中具有重要的調(diào)控功能。本文敲除6SRNA后，發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌生長遲緩期顯著延長，表明6SRNA參與幽門螺桿菌生長調(diào)控的變化，并影響幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)容物對GSE-1胃粘膜上皮細(xì)胞的毒力，表明6SRNA具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，能夠調(diào)控幽門螺桿菌毒力相關(guān)的因子。然而，幽門螺桿菌編碼多種細(xì)胞毒力因子，例如尿素酶、過氧化氫酶、過氧化物歧化酶、CagA、VacA等數(shù)十種，6SRNA具體調(diào)控哪種或哪些細(xì)胞毒力因子，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)功能是什么，6SRNA是如何調(diào)控眾多的毒力因子影響其生長繁殖及在胃粘膜的定植，諸如上述問題的解決仍需大量實(shí)驗(yàn)深入分析和研究。

此外，大量研究表明，6SRNA可對多種信號做出反應(yīng)。例如，在大腸桿菌中，當(dāng)細(xì)菌從指數(shù)期向穩(wěn)定期過渡或營養(yǎng)匱乏時(shí)，6SRNA大量積累，抑制σ70-RNAP活性，激活σ38-RNAP依賴的靶基因表達(dá)[14-15]；6SRNA還受胞內(nèi)嘌呤核苷酸濃度、ppGpp信號、anti-σ因子等多個(gè)信號的調(diào)控，從而對噬菌感染、饑餓、酸堿度、氧脅迫等做出反應(yīng)，調(diào)控生物膜形成、細(xì)胞生長、芽胞形成及多種細(xì)胞代謝[16]。幽門螺桿菌定植在胃內(nèi)極復(fù)雜的環(huán)境中，受飲食、pH等多種因素的影響，上述因素是否可以通過調(diào)控Hp-6SRNA的轉(zhuǎn)錄而調(diào)控幽門螺桿菌的定植和毒力。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6SRNA基因敲除后，其上游基因(Hp1220，Hp1221)的表達(dá)受到一定的影響(圖6)，這種影響是6SRNA基因的直接影響還是6SRNA基因通過調(diào)控其他基因間接影響上游基因的表達(dá)，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，在后續(xù)工作中，我們需從生理生化、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、細(xì)胞功能以及動(dòng)物模型等多方面進(jìn)一步深入分析6SRNA的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制?？傊?，本研究為幽門螺桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究提供了新思路，為幽門螺桿菌致病機(jī)理研究提供了新視野。

利益沖突：無