組學(xué)方法篩選結(jié)核病生物標志物的應(yīng)用進展

張皓博，蘇華彬，2，劉蒙達，亓 菲，張研博，范偉興，孫淑芳，樊曉旭

當(dāng)前，結(jié)核病(tuberculosis)在世界范圍內(nèi)仍是最嚴重的傳染病之一。2020年，WHO報告新發(fā)結(jié)核病感染病例1 000萬，死亡150萬(包括214 000名HIV感染者)[1]。據(jù)估計，全球結(jié)核潛伏感染患者約為17億[2]。在報告病例中，30個結(jié)核病高負擔(dān)國家的病例占新增結(jié)核病病例的86%，印度、中國、印度尼西亞、菲律賓、巴基斯坦、尼日利亞、孟加拉國和南非這8個國家占病例總數(shù)的三分之二[1]。此外，結(jié)核病還是重要的人獸共患病，盡管一些國家宣布根除了牛結(jié)核病，但牛分枝桿菌在大多數(shù)發(fā)展中國家仍然普遍存在。有研究表明，2009-2019年全球人感染牛分枝桿菌的感染率為12.1%[3]。

結(jié)核病診斷方法主要包括涂片檢查、細菌培養(yǎng)、PCR、X光、結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)和干擾素-γ釋放試驗(IGRA)等。這些方法在臨床上應(yīng)用廣泛，然而涂片檢查的敏感性較低[4]；作為“金標準”的細菌培養(yǎng)耗時較長，通常需3～12周[5]；X光法只能證明受影響器官存在結(jié)核病的放射學(xué)特征，但無法確診[6]；PCR和免疫學(xué)方法，雖然能夠區(qū)分大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌感染和卡介苗免疫干擾，但常因假陽性和假陰性結(jié)果影響后續(xù)的干預(yù)治療措施[7]。此外，在潛伏感染病例中，由于宿主體內(nèi)含菌量較低且未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，這些檢測方法無法判斷感染情況，以及發(fā)展為活動性結(jié)核的風(fēng)險。因此，需要利用更多的特異性生物標志物，建立有效、快速、靈敏的結(jié)核病診斷方法，快速識別感知發(fā)病情況并及時采取干預(yù)措施。

理想的結(jié)核病生物標志物是在潛伏感染、活動性結(jié)核以及耐受等不同階段，可以檢測到的特異性生化指標，人們可以通過其水平差異變化，及時做出感染預(yù)警。結(jié)核病生物標志物主要包括細胞因子、宿主蛋白、microRNA以及結(jié)核病原菌成分等。目前，人們所知的用于結(jié)核病早期診斷的有效生物標志物還很少[8]，因此需要利用新技術(shù)、新方法發(fā)現(xiàn)和驗證更多敏感、特異的結(jié)核感染生物標志物。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)方法成為篩選生物標志物的有效手段。本文就組學(xué)方法篩選結(jié)核病生物標志物的應(yīng)用情況做一綜述。

1 基因組學(xué)篩選結(jié)核病生物標志物

隨著全基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，人們將基因組學(xué)技術(shù)用于篩選結(jié)核病生物標志物。最經(jīng)典的是比較基因組學(xué)方法，分析不同病原及病原不同亞種之間的核心基因，鑒定新的標志物。Zhou等比較了4 294個結(jié)核分枝桿菌全基因組和14個非結(jié)核分枝桿菌全基因組，發(fā)現(xiàn)ku基因(又稱為mku或Rv0937c)在分枝桿菌基因組中廣泛存在，在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中高度保守，有望成為區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的生物標志物[9]。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選結(jié)核病生物標志物

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是通過檢測低水平的結(jié)核分枝桿菌抗原、識別與結(jié)核分枝桿菌感染的免疫表型以及檢測宿主RNA和蛋白特征性變化等，確定生物標志物[10-11]。與單一檢測方法相比，轉(zhuǎn)錄組學(xué)評估宿主mRNA變化，能夠更全面、更有效的挖掘不同感染階段生物標志物[12]。過去10年，應(yīng)用最為廣泛的是利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法比較潛伏感染、活動性結(jié)核患者與健康人群血液中mRNA的變化，根據(jù)不同健康狀態(tài)下基因表達差異，特別是循環(huán)系統(tǒng)中免疫細胞基因表達變化及其在血液中相對豐度的不同，確定可能將活動性結(jié)核患者與潛伏感染區(qū)分開的標志物[13]。

已有研究表明，在無癥狀個體中，一部分活動性結(jié)核病相關(guān)轉(zhuǎn)錄分子(82個Log2FC>1.5的上調(diào)表達基因)，如Fcγ受體1基因FCGR1A(Log2FC=1.334)、絲氨酸肽酶抑制劑成員基因SERPING1(Log2FC=1.511)和補體成分基因C1QC(Log2FC=1.134)，在發(fā)展為活動性結(jié)核之前，就能夠用PET/CT成像技術(shù)檢測到表達水平差異，這對于疾病預(yù)測具有重要意義[14]。對高危人群的研究也表明，生物標志物在轉(zhuǎn)錄水平的特征可在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)1年前，幫助判斷發(fā)展為活動性結(jié)核的可能性[15]。在牛結(jié)核病研究中，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)對結(jié)核感染早期和晚期牛血液進行分析，確定了潛在生物標志物，對于了解發(fā)病機制和病程進展、制定合理的控制策略至關(guān)重要[16]。此外，根據(jù)深度測序結(jié)果，結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫進行分析，也是篩選結(jié)核病生物標志物的有效方法，Wen等對肺組織代謝組數(shù)據(jù)進行分析，并通過ELISA對篩選出的差異基因進行驗證，發(fā)現(xiàn)CCL5 在健康個體和結(jié)核病患者中的水平存在差異(AUC=0.723)，CCL19 在結(jié)核病患者和其他呼吸系統(tǒng)疾病患者中的水平存在顯著不同(AUC=0.811)，提示上述基因可能成為有效的生物標志物[17]。有研究對肺組織和血液的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者IRF1基因與健康個體相比，顯著上調(diào)，提示IRF1基因可能是結(jié)核病診斷的生物標志物[18]。

目前，在一些研究中，發(fā)現(xiàn)的16個候選生物標志物，如daCosta3包含3個基因用以區(qū)分活動性結(jié)核與其他疾病，Jacobsen3包含3個基因用以區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏感染，然而這些生物標志物存在一定的局限性，可能只適用于所研究的群體，在2年內(nèi)，預(yù)測結(jié)核病進展的敏感性和特異性都低于75%[19-20]，但在活動性結(jié)核患者中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法在區(qū)分活動性結(jié)核與健康個體的平均靈敏度為93%，特異性為97%；在區(qū)分活動性結(jié)核與潛伏感染的平均靈敏度為88%，特異性為85%；在區(qū)分活動性結(jié)核與其他疾病的靈敏度為82%，特異性為79%[21]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法在診斷潛伏感染人群敏感性和特異性不盡如人意，這是由于基因在不同宿主體內(nèi)表達有所差異，且結(jié)核病發(fā)病機制復(fù)雜，例如免疫功能低下人群，血液中基因的轉(zhuǎn)錄水平可能不同。此外，其他疾病共感染也會影響轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的特異性，例如，干擾素上調(diào)表達是結(jié)核病感染的主要特征，同時也是HIV感染的重要信號[16]。盡管如此，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選生物標志物預(yù)測結(jié)核病進展依然是有效的方法之一，但操作需要進一步簡化。Cepheid等公司正在開發(fā)通過GeneXpert平臺實時監(jiān)測宿主mRNA豐度的試劑盒。一旦成功，就可以用于臨床預(yù)測判斷結(jié)核病進程。

3 蛋白組學(xué)篩選結(jié)核病生物標志物

檢測血清中生物標志物是疾病診斷的有效手段[22]。結(jié)核分枝桿菌入侵機體后，可以改變不同蛋白的表達，并通過不同途徑將抗原蛋白釋放到血液中，使宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體[23]。然而，由于結(jié)核病抗原多樣性和復(fù)雜性，結(jié)核病患者體內(nèi)抗體表現(xiàn)出極大多樣性。因此，傳統(tǒng)血清學(xué)方法在檢測多種結(jié)核分枝桿菌抗原時敏感性和特異性不盡如人意。蛋白組學(xué)篩選結(jié)核病生物標志物不是針對結(jié)核分枝桿菌單個抗原的抗體，而是囊括并分析血清中所有蛋白質(zhì)，包括結(jié)核分枝桿菌相關(guān)蛋白。因此，可利用蛋白組學(xué)篩選血清中結(jié)核病生物標志物對結(jié)核病作出有效診斷[24-25]。

許多研究已利用蛋白組學(xué)技術(shù)比較分析結(jié)核病患者和健康個體的蛋白質(zhì)水平差異。基于質(zhì)譜(MS)、磁珠與質(zhì)譜相結(jié)合、表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)等強大的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究人員在血清蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)許多差異表達的蛋白，這些蛋白參與免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和組織修復(fù)等[26-28]。此外，鑒于艾滋病和結(jié)核病合并感染情況，研究人員利用蛋白組學(xué)技術(shù)在血清中成功發(fā)現(xiàn)除干擾素外艾滋病單一患者與合并感染患者血清中的25種差異蛋白，這些蛋白參與宿主免疫反應(yīng)過程，最主要的是一種候選蛋白內(nèi)皮糖蛋白 (ENG)，在艾滋病合并感染患者種，iTRAQ法增加了4.9倍，ELISA法增加了11.5倍[24]。這些蛋白有可能成為結(jié)核病診斷的血清生物標志物。在牛結(jié)核病研究中，Mazorra-Carrillo等使用2D-GE和LC-ESI-MS/MS方法篩選血清生物標志物，發(fā)現(xiàn)健康牛中伯胺氧化酶、補體C5和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白表達水平高于患病牛，診斷靈敏度達70%以上，特異性80%以上，表明這些蛋白質(zhì)有望成為牛結(jié)核病診斷新的生物標志物[29]。

不僅在血清樣本中，人們利用蛋白組學(xué)在其他樣品中篩選出結(jié)核病生物標志物。在尿液中，Wang等利用二維電泳、高效液相色譜與電噴霧質(zhì)譜相結(jié)合的方法，從結(jié)核病患者和健康對照中鑒定出19個差異表達的尿蛋白[30]。無獨有偶，通過iTRAQ標記腦脊液樣品進行LC-MS/MS分析，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)表皮生長因子(NELL2)過度表達，并證明其是潛在的結(jié)核病診斷生物標志物[31]。

4 代謝組學(xué)篩選結(jié)核病生物標志物

過去10年，代謝組學(xué)已成為探索和識別新生物標志物的有效方法。代謝物是各種生物過程的最終產(chǎn)物，一定程度上能夠反映上游的生物事件，如基因突變和環(huán)境變化等。通過提取痰液、血液、尿液樣本中代謝物，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者的許多生物過程相比健康個體出現(xiàn)異常和紊亂，特別是患者能量消耗、糖酵解、脂肪分解、氨基酸代謝和核苷酸生物合成過程[32-33]。研究表明，結(jié)核病患者與潛伏性感染者、健康個體相比，氨基酸代謝發(fā)生明顯變化[34]，1-甲基組氨酸、乙酰乙酸、丙酮、谷氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、乳酸、賴氨酸、煙酸、苯丙氨酸、丙酮酸和酪氨酸的濃度增加，同時丙氨酸、甲酸、甘氨酸、甘油磷酸膽堿的濃度降低。

然而，不同代謝組學(xué)研究篩選的生物標志物存在較大差異，無法徹底解釋和區(qū)分結(jié)核病引起的代謝途徑和信號通路變化，這些生物標志物檢測的特異性較低[35]，且不同生物樣本得出的研究結(jié)果也存在差異。此外，結(jié)核病引起的代謝水平變化，也可能由其他疾病導(dǎo)致，這些生物標志物很少通過其他組學(xué)進一步驗證，重復(fù)性較差，可信度較低。因此，需要運用多種組學(xué)方法綜合分析，嚴格設(shè)計驗證結(jié)核病生物標志物，全面揭示結(jié)核病發(fā)病機制。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，人們整合代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析血液中結(jié)核病生物標志物，例如，研究人員利用LC-MS方法分別分析了活動性結(jié)核和健康個體血液中的代謝圖譜，接下來將代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)在診斷和藥物敏感的整個治療過程中進行整合。N-乙酰神經(jīng)氨酸在診斷時的AUC為0.66。喹啉在治療1個月后的AUC為0.77，吡哆醇在治療成功完成后的AUC為0.87[36]。這表明不同組學(xué)的整合進一步提高了實驗結(jié)果可信度。

5 展 望

及時有效診斷和干預(yù)對于結(jié)核病防治至關(guān)重要，結(jié)核病生物標志物有助于了解疾病發(fā)病機制，實現(xiàn)早期診斷。迄今為止，有關(guān)結(jié)核病生物標志物的研究超過9 000項[10]，然而大多數(shù)生物標志物經(jīng)初步篩選無后續(xù)詳實的驗證。盡管組學(xué)方法是篩選新結(jié)核病生物標志物的有效手段，但由于很多疾病與結(jié)核病有相似的生物學(xué)變化，生物標志物的敏感性或特異性仍有待提高。此外，通過單一組學(xué)方法和不同類型樣本得到的結(jié)核病生物標志物也不足以完全闡明結(jié)核病發(fā)病機制，目前尚未鑒定出高特異性的結(jié)核病生物標志物。

WHO標準規(guī)定理想的生物標志物敏感性應(yīng)大于90%，特異性大于70%[37]。然而，在早期許多結(jié)核病生物標志物相關(guān)研究中，樣本量較低。目前結(jié)核診斷生物標志物主要為血液中C反應(yīng)蛋白(CRP)、尿液中脂阿拉伯甘露糖(LAM)和痰液中結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因(MTB/RIF)。雖然CRP檢測特異性相對較低，但仍可用于社區(qū)篩查[38]，尿液LAM敏感性不高，無法用于篩查，但可用于HIV陽性患者結(jié)核病診斷，且操作簡便[39]。痰液Xpert檢測具有高特異性和高敏感性，但在初篩時，不同痰液樣本基質(zhì)成分會影響診斷敏感性[40]。組學(xué)的發(fā)展使高通量篩選結(jié)核病生物標志物成為可能。多組學(xué)整合可進一步驗證并提高生物標記物的可靠性。雖然目前尚無理想的結(jié)核病單一生物標志物，但相信通過多種方法綜合篩選驗證，未來將有單一或多種生物標志物組合用于不同場景下結(jié)核病診斷。

利益沖突：無