加味黃芪桂枝五物湯抑制線粒體凋亡預(yù)防奧沙利鉑周圍神經(jīng)毒性機(jī)制*

吳艾平 吳林龍 張紅穎 魏國利 馬駿

(1.淮安市中醫(yī)院，江蘇 淮安 223001；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028)

奧沙利鉑為臨床最常用的化療藥物之一，尤其對消化系統(tǒng)腫瘤常作為基石使用，但奧沙利鉑導(dǎo)致的周圍神經(jīng)毒性(Oxa-inducedperipheralneuropathy，OIPN)是其最常見的毒副作用之一，發(fā)生率可高達(dá)90%，然而目前國內(nèi)外相關(guān)指南未推薦任何可行方法來預(yù)防OIPN，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及療效[1-2]。OIPN的主要癥狀為肢體末端的感覺異常、麻木、疼痛及遇冷加重等，歸屬中醫(yī)學(xué)"血痹"的范疇[3]，有研究[4]證實(shí)加味黃芪桂枝五物湯可減輕OIPN。氧化應(yīng)激及線粒體損傷在OIPN的發(fā)病機(jī)制中處于重要的地位[2,5]。本研究通過OIPN大鼠模型，觀察加味黃芪桂枝五物湯對氧化應(yīng)激及線粒體損傷的影響，探討加味黃芪桂枝五物湯預(yù)防OIPN的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康WISTA雌鼠40只(購自南京君科生物工程有限公司)，體重180～220 g。飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物中心，恒溫恒濕，每天8：00～20：00開燈，保證大鼠休息規(guī)律。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加味黃芪桂枝五物顆粒由黃芪20 g、桂枝10 g、白芍10 g、當(dāng)歸10 g、大棗10 g、生姜10 g組成(購自江陰天江藥業(yè)有限公司)，加入80℃水至25 mL，混勻至殘?jiān)?，備用。奧沙利鉑注射液50 mg(購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：191226AN)；谷胱甘肽注射液 1.2 g(山東綠葉制藥有限公司，批號：190901205)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 低溫高速離心機(jī)及熒光酶標(biāo)儀購自德國Eppendorf；Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)以及MiniTrans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad；紫外分光光度計(jì)購自美國Beckman；二氧化碳培養(yǎng)箱購自YILIANG；水平脫色搖床購自華利達(dá)；ROS試劑盒購自碧云天；特級胎牛血清及PCR試劑盒購自美國ThermoPierce；疼痛觸覺測試套件購自美國Stoelting。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及造模 將40只WISTA雌鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、谷胱甘肽(GSH)組、加味黃芪桂枝五物湯組，每組各10只。空白組給予相同體積溶劑 (5%葡萄糖溶液) 腹腔注射，模型組、加味黃芪桂枝五物湯組(中藥組)和GSH組按照Cheng等[6]方法進(jìn)行OIPN大鼠造模[在第1、2、8、9、15、16、22、23 d時(shí)重復(fù)腹腔注射奧沙利鉑溶液(2.5 mg/kg，5%葡萄糖溶液稀釋)]，GSH組在化療當(dāng)天及前后2 d分別給予谷胱甘肽1.5 g/m2/d尾靜脈注射。

1.2.2 給藥 加味黃芪桂枝五物湯灌胃給藥(10 mL/kg,1次/日)，空白組、模型組、GSH組予0.9%生理鹽水灌胃(10 mL/kg,每日1次)。奧沙利鉑用藥當(dāng)天，中藥于奧沙利鉑應(yīng)用前1 h給藥。

1.2.3 檢測指標(biāo) ①機(jī)械疼痛觸覺檢測：在第0、7、14、21、28 d運(yùn)用VonFrey試驗(yàn)檢測大鼠機(jī)械縮足反射閾值。②脊髓過氧化酶活性及產(chǎn)物檢測：奧沙利鉑造模后第28 d稱重，每組選擇5只大鼠處死，大鼠背根神經(jīng)節(jié)取出后再取出脊髓研碎，加入生理鹽水混勻離心，取上清檢測超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶活性(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(Malonic dialdehyde,MDA)含量。③背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的ROS熒光測定 造模第28 d稱重，麻醉后取大鼠L4-5背根神經(jīng)節(jié)(Dorsalrootganglion，DRG)，制成細(xì)胞懸液并離心收集DRG細(xì)胞，進(jìn)行PBS進(jìn)行重懸→裝載熒光探針→培育→混勻→洗滌細(xì)胞→冰凍切片，顯微鏡觀察并計(jì)量熒光強(qiáng)度。④p53和p53相關(guān)線粒體凋亡蛋白表達(dá)水平測定：對DRG樣品進(jìn)行總蛋白的提取→總蛋白定量→SDS-PAGE電泳分析→蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜→轉(zhuǎn)印膜封閉→一抗(p53、PUMA、Bax、Bcl-2、cytoc、cleavedcaspase-3、cleavedPARP1、GAPDH)雜交→T-TBS漂洗→二抗(Goatanti-MouseIgG(H+L)Secondaryantibody、Goatanti-RabbitIgG(H+L)Secondaryantibody、Rabbitanti-GoatPolyclonal(HRP) Antibody)雜交→T-TBS漂洗。采用SuperSignal?WestDuraExtendedDurationSubstrate，按說明書制備約1mlECL工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜，去除多余ECL試劑，予以保鮮膜密封，然后在暗盒中放上X-rayfilm曝光5～10 m后進(jìn)行顯影和定影。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間機(jī)械性縮足閾值變化 模型組第7 d即出現(xiàn)機(jī)械性縮足閾值下降(P<0.05)，并隨著時(shí)間延長逐漸加重，第21、28 d顯著下降，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。加味黃芪桂枝五物湯組及GSH組優(yōu)于模型組(P<0.05)，且加味黃芪桂枝五物湯組優(yōu)于GSH組(P<0.05)，表明其可降低OIPN引起的大鼠機(jī)械性縮足閾值且優(yōu)于GSH。見圖1。

圖1 加味黃芪桂枝五物湯對大鼠機(jī)械性縮足反射閾值的影響Figure 1 Effect of Modified Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on the threshold of mechanical foot contraction reflex in rats

2.2 各組大鼠脊髓過氧化酶活性及產(chǎn)物含量 第28 d測各組SOD、GSH-Px活性及MDA含量，結(jié)果顯示模型組SOD、GSH-Px活性顯著低于空白組，MDA含量顯著高于空白組(均P<0.01)，表明OIPN存在顯著的氧化應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致DRG損傷；加味黃芪桂枝五物湯組及GSH組在SOD、GSH-Px活性及MDA含量均優(yōu)于模型組(P<0.01)，加味黃芪桂枝五物湯組SOD、GSH-Px活性及MDA含量與GSH組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明加味黃芪桂枝五物湯可減輕奧沙利鉑引起的大鼠脊髓氧化應(yīng)激反應(yīng)，與GSH能力相當(dāng)。見表1。

表1 各組大鼠脊髓過氧化相關(guān)酶活性及產(chǎn)物含量比較(U/mg)Table 1 Comparison of activity and product content of peroxidation related enzymes in rat spinal cord

2.3 各組大鼠DRG細(xì)胞的ROS生成影響 第28 d取出大鼠L4-5背根神經(jīng)節(jié)，經(jīng)處理后于顯微鏡觀察并計(jì)量熒光強(qiáng)度來評定各組ROS生成的影響，結(jié)果顯示GSH組及加味黃芪桂枝五物湯組熒光強(qiáng)度顯著低于模型組(P<0.01)，GSH組與加味黃芪桂枝五物湯相比二者熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明加味黃芪桂枝五物湯可降低OIPN大鼠DRG細(xì)胞ROS生成，見圖2。

圖2 各組大鼠DRG細(xì)胞的ROS生成的影響Figure 2 Effect of Modified Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on ROS production of DRG cells

2.4 加味黃芪桂枝五物湯對DRG細(xì)胞P53蛋白表達(dá)的影響 加味黃芪桂枝五物湯對線粒體凋亡關(guān)鍵蛋白P53表達(dá)的影響，分離L4-5 DRG，加味黃芪桂枝五物湯可以顯著降低P53蛋白的表達(dá)(P<0.01)，GSH組與加味黃芪桂枝五物湯組曝光強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示抑制P53的表達(dá)，可能是加味黃芪桂枝五物湯減少背根神經(jīng)節(jié)損傷預(yù)防 OIPN的重要機(jī)制。見圖3、圖4。

圖4 各組DRG細(xì)胞P53蛋白表達(dá)曝光強(qiáng)度比較Figure 4 Comparison of exposure intensity of P53 protein expression in DRG cells of each group

2.5 加味黃芪桂枝五物湯對DRG細(xì)胞P53-Bax信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 為進(jìn)一步了解P53通路相關(guān)的線粒體凋亡途徑在加味黃芪桂枝五物湯防治OIPN的作用機(jī)制，對P53相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)加味黃芪桂枝五物湯可以顯著降低P53-Bax通路Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)，提高Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.01)，GSH組與加味黃芪桂枝五物湯曝光強(qiáng)度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示P53-Bax通路受抑制，可能是加味黃芪桂枝五物湯抑制背根神經(jīng)節(jié)線粒體凋亡的重要機(jī)制。見圖5、圖6。

圖5 加味黃芪桂枝五物湯對DRG細(xì)胞P53-Bax信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of Jiawei Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on the expression of key proteins of P53 Bax signal pathway in DRG cells

圖6 各組DRG細(xì)胞P53-Bax信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)曝光強(qiáng)度比較Figure 6 Comparison of exposure intensity of key protein expression of P53-Bax signal pathway in DRG cells of each group

3 討論

2020年，全球新發(fā)癌癥約1900萬，我國的新發(fā)癌癥病例也達(dá)到了450萬[7-8]，需要一線化療的患者數(shù)量將增加53%，從2018年的980萬增加到2040年的1500萬[9]?；煂?dǎo)致的CIPN是臨床常見的藥物劑量限制性不良反應(yīng)，因此，CIPN的發(fā)病將大大增加。CIPN發(fā)生率較高，在所有患者中大于60%，長期遭受CIPN折磨的患者約有20%～30%[10-11]。奧沙利鉑在消化系統(tǒng)腫瘤中廣泛使用，尤其是結(jié)直腸癌的化療中尤為重要，但對于使用奧沙利鉑化療的患者，發(fā)生OIPN的幾率遠(yuǎn)高于其他藥物，可達(dá)到76%～90%[12-13]。OIPN的發(fā)生導(dǎo)致了部分患者不得不減少奧沙利鉑的用量甚至停藥，嚴(yán)重影響了患者的生存及生活質(zhì)量，增加了社會及家庭負(fù)擔(dān)。

OIPN的發(fā)生機(jī)制尚不明確，雖然目前國內(nèi)外開展了多種藥物防治OIPN的臨床研究，如鈣鎂合劑、普瑞巴林、神經(jīng)節(jié)苷脂、乙酰-l-左旋肉堿、甲鈷胺、加巴噴丁、維生素E、鈣錳福地吡等，但仍無明確的防治效果，且部分藥物可能出現(xiàn)不可預(yù)測的風(fēng)險(xiǎn)甚至導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[14-16]。因OIPN發(fā)生后尚無有效逆轉(zhuǎn)方法，目前國內(nèi)外指南無推薦使用的預(yù)防藥物[2]。

黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗組成，是治療的血痹的特效方，具有益氣溫經(jīng)、和營通痹的傳統(tǒng)功效，多項(xiàng)研究表明其可降低急、慢性O(shè)IPN的發(fā)生率并減輕其引起的麻木、疼痛、冷刺激過敏等相關(guān)癥狀，可修復(fù)OIPN所致的大鼠背根神經(jīng)節(jié)的損傷[17-19]。因OIPN屬血痹氣虛血瘀型，手術(shù)及化療可導(dǎo)致血虛，加味黃芪桂枝五物湯為黃芪桂枝五物湯加用當(dāng)歸組成，是治療OIPN經(jīng)驗(yàn)方。在臨床觀察有效的基礎(chǔ)上，本人前期開展了加味黃芪桂枝五物湯預(yù)防OIPN 的多中心RCT研究，共納入56例大腸癌根治術(shù)后輔助化療患者，結(jié)果顯示加味黃芪桂枝五物湯可減輕OIPN癥狀，并可推遲慢性疼痛出現(xiàn)的時(shí)間，減輕奧沙利鉑引起的外周神經(jīng)損傷[20]。

DRG是四肢感覺傳導(dǎo)的初級神經(jīng)元，具有傳輸和調(diào)節(jié)機(jī)體感覺、接受和傳導(dǎo)傷害性感受的功能。奧沙利鉑主要是通過損傷DRG上感官神經(jīng)元，其發(fā)生率及病情程度與劑量強(qiáng)度、累積劑量、治療進(jìn)度、給藥持續(xù)時(shí)間等密切關(guān)[21-22]。鉑類藥物通可過破壞DRG線粒體結(jié)構(gòu)和生物能量學(xué)、增加硝基氧化應(yīng)激和改變線粒體運(yùn)輸、分裂、融合和有絲分裂吞噬而導(dǎo)致周圍感覺神經(jīng)線粒體損傷，從而出現(xiàn)相關(guān)的周圍神經(jīng)毒性癥狀[23-24]。鉑類是通過何途徑損傷DRG的線粒體，研究[25-27]顯示多個(gè)途徑可能參與了DRG線粒體損傷，其中P53-Bax通路是DRG線粒體損傷中重要的途徑。

目前針對DRG細(xì)胞凋亡保護(hù)研究極少，尤其是基于P53-Bax通道暫無系統(tǒng)研究，本實(shí)驗(yàn)為預(yù)防OIPN這一腫瘤治療領(lǐng)域難點(diǎn)提供新的思路，也為預(yù)防OIPN的藥物研發(fā)奠定一定基礎(chǔ)，但加味黃芪桂枝五物湯如何調(diào)控P53-Bax通道，抑制氧化應(yīng)激與抑制P53-Bax通道是否相關(guān)，這些問題尚不清楚，需進(jìn)一步研究明確。

本實(shí)驗(yàn)成功建立OIPN模型，并從氧化應(yīng)激及P53-Bax通道介導(dǎo)的線粒體損傷途徑共同探討了加味黃芪桂枝五物湯對OIPN的防治作用，結(jié)果顯示加味黃芪桂枝五物湯可降低OIPN引起的大鼠機(jī)械性縮足閾值且優(yōu)于GSH；降低OIPN大鼠DRG細(xì)胞ROS生成，減輕奧沙利鉑引起的大鼠脊髓氧化應(yīng)激反應(yīng)；抑制P53的表達(dá)，降低P53-Bax通路Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)，提高Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明加味黃芪桂枝五物湯可通過減輕奧沙利鉑引起的大鼠脊髓氧化應(yīng)激反應(yīng)，并通過P53-Bax通路減輕線粒體損傷從而防治OIPN。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，加味黃芪桂枝五物湯可通過抗氧化應(yīng)激及抑制P53-Bax通路誘導(dǎo)的DRG細(xì)胞線粒體損傷來預(yù)防OIPN。