新型冠狀病毒快速與普通核酸檢測系統(tǒng)的臨床組合應(yīng)用研究*

朱艷秋 張攀 褚明亮 王莎 胡棉

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽 550001)

新型冠狀病毒(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)具有非常強的傳染性[1-5]。加大檢測力度，對于及時發(fā)現(xiàn)并切斷病毒傳播至關(guān)重要。新冠核酸檢測的方法以熒光PCR法為主，其檢測時間在1.5～2 h之間。加上采樣時間，核酸提取時間及其他因素等，傳統(tǒng)的核酸檢測時間多在6 h以上。早發(fā)現(xiàn)、早隔離、及時阻斷病毒的傳播、縮短核酸檢測時間非常重要[6]。國內(nèi)外近期研發(fā)了一系列快速核酸檢測系統(tǒng)(含試劑、儀器等)，并陸續(xù)進(jìn)入臨床應(yīng)用[7-8]。本研究比較了某品牌的快速檢測系統(tǒng)與普通檢測系統(tǒng)在新冠核酸擴(kuò)增敏感性及時間上的差異，為臨床檢測應(yīng)用提供部分參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 普通檢測系統(tǒng)：病毒采樣管(粵深械備20200187)；核酸提取(磁珠法)試劑盒(陜西械備20140007)；普通新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(國械注準(zhǔn)20203400063)；磁珠法核酸提取儀(西安天隆科技有限公司，型號：NP968-C)；普通熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司，型號：SLAN-96P)?？焖贆z測系統(tǒng)：直接裂解法(粵穗械備20200113)；快速新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(國械注準(zhǔn)20203400749)；快速熒光定量PCR儀(國械注準(zhǔn)20203220748)。新型冠狀病毒液體質(zhì)控品(北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司，型號：S1，濃度25000 cp/mL)。

1.2 核酸提取方法

1.2.1 核酸提取法 將新冠核酸質(zhì)控品S1(濃度25000 cp/mL)，用病毒采樣管中的保存液作為稀釋液，分別稀釋到200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。按照操作要求，使用核酸提取法試劑盒(qEx-DNA/RNA)在磁珠法核酸提取儀(NP968-C)上進(jìn)行提取。提取得到的核酸RNA，-80℃保存待用。以上操作，每個濃度的樣品重復(fù)3次。

1.2.2 直接裂解法 將新冠核酸質(zhì)控品S1(濃度25000 cp/mL)，用裂解釋放劑中的裂解液作為稀釋液，分別稀釋到200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。按照直接裂解法的說明要求，震蕩裂解釋放15 min，-80℃保存待用。以上操作，每個濃度的樣品重復(fù)3次。

1.3 熒光PCR擴(kuò)增

1.3.1 核酸提取法/直接裂解法+普通擴(kuò)增試劑+普通熒光定量PCR儀器 將1.2.1核酸提取法和1.2.2 核酸直接裂解法得到的RNA，各取5 μL，分別加入普通新型冠狀病毒核酸檢測試劑中，在普通熒光定量PCR儀(SLAN-96P)上進(jìn)行擴(kuò)增。FAM和/或VIC通道的Ct 值≤40，且有擴(kuò)增曲線時，判為N基因和/或ORF1ab基因陽性(+)；FAM和/或VIC通道的Ct 值位于40～45之間，但有明顯擴(kuò)增曲線，則進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致則判為N基因和/或ORF1ab基因弱陽性(±)。

1.3.2 核酸提取法/直接裂解法+快速擴(kuò)增試劑+普通熒光定量PCR儀器 將1.2.1核酸提取法和1.2.2 核酸直接裂解法得到的RNA，各取5 μL，分別加入快速新型冠狀病毒核酸檢測試劑中，在普通熒光定量PCR儀(SLAN-96P)上進(jìn)行擴(kuò)增。FAM和/或VIC通道的Ct 值≤30，且有擴(kuò)增曲線時，判為N基因和/或ORF1ab基因陽性(+)；FAM和/或VIC通道的Ct 值位于30～32之間，但有明顯擴(kuò)增曲線，則進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致則判為N基因和/或ORF1ab基因弱陽性(±)。

1.3.3 核酸提取法/直接裂解法+快速擴(kuò)增試劑+快速熒光定量PCR儀器 將1.2.1核酸提取法和1.2.2 核酸直接裂解法得到的RNA，各取5 μL，分別加入快速新型冠狀病毒核酸檢測試劑中，在快速熒光定量PCR儀(AGS8830-16)上進(jìn)行擴(kuò)增。判斷標(biāo)準(zhǔn)同1.3.2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用等級資料秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核酸提取法和直接裂解法兩種方法核酸擴(kuò)增結(jié)果的比較

2.1.1 以普通擴(kuò)增試劑及普通熒光定量PCR儀器為基準(zhǔn)，比較核酸提取法和直接裂解法兩種方法的擴(kuò)增結(jié)果 樣本的初始濃度為2000 cp/mL和1000 cp/mL時候，核酸提取法和裂解釋放提取法兩種方法PCR的結(jié)果都顯示有明顯的擴(kuò)增曲線，核酸的N基因(藍(lán)色曲線)和ORF1ab 基因(綠色曲線)，都為陽性。當(dāng)樣本的初始濃度為500 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結(jié)果顯示N基因和ORF1ab 基因陽性；而裂解釋放提取法PCR的結(jié)果N基因為弱陽性，ORF1ab 基因為陰性。當(dāng)樣本的初始濃度為200 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結(jié)果顯示N基因陽性，ORF1ab 基因弱陽性；而裂解釋放提取法PCR的結(jié)果N基因和ORF1ab 基因均為陰性(見圖1)。兩種方法在200 cp/mL和500 cp/mL濃度中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 核酸提取法和直接裂解法得到的核酸在普通擴(kuò)增試劑及普通熒光定量PCR儀器上擴(kuò)增得到的結(jié)果 Figure 1 Amplification results between nucleic acid extraction method and direct lysis method using common amplification reagent and common RT PCR instrument 注：樣本的初始濃度分別為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。藍(lán)色曲線表示N基因，綠色曲線表示ORF1ab基因

2.1.2 以快速擴(kuò)增試劑及普通熒光定量PCR儀器為基準(zhǔn)，比較核酸提取法和直接裂解法兩種方法的擴(kuò)增結(jié)果 樣本的初始濃度為2000 cp/mL和1000 cp/mL時候，核酸提取法和裂解釋放兩種方法PCR結(jié)果顯示，核酸的N基因(藍(lán)色曲線)和ORF1ab基因(綠色曲線)都為陽性或弱陽性。當(dāng)樣本的初始濃度為500 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結(jié)果顯示N基因和ORF1ab基因為陽性；而裂解釋放法PCR的結(jié)果顯示N基因為弱陽性，ORF1ab 基因為陰性。當(dāng)樣本的初始濃度為200 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結(jié)果N基因為陽性，ORF1ab基因為陰性；而裂解釋放法PCR的N基因和ORF1ab基因均為陰性(見圖2)。兩種方法在200 cp/mL和500 cp/mL濃度中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 核酸提取法和直接裂解法得到的核酸在快速擴(kuò)增試劑及普通熒光定量PCR儀器上擴(kuò)增得到的結(jié)果Figure 2 Amplification results between nucleic acid extraction method and direct lysis method using rapid amplification reagent and common RT PCR instrument注：樣本的初始濃度分別為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。藍(lán)色曲線表示N基因，綠色曲線表示ORF1ab基因

2.1.3 以快速擴(kuò)增試劑及快速熒光定量PCR儀器為基準(zhǔn)，比較核酸提取法和直接裂解法兩種方法的擴(kuò)增結(jié)果 樣本的初始濃度為2000 cp/mL和1000 cp/mL時候，核酸提取法和裂解釋放兩種方法PCR結(jié)果顯示，核酸的N基因(黑色曲線)和ORF1ab基因(黃色曲線)都為陽性。當(dāng)樣本的初始濃度為500 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結(jié)果顯示N基因和ORF1ab基因為陽性；而裂解釋放法的N基因為陽性，ORF1ab基因為陰性。當(dāng)樣本的初始濃度為200 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結(jié)果顯示N基因陰性，ORF1ab基因陽性；而裂解釋放法PCR結(jié)果的N基因和ORF1ab基因均為陰性(見圖3)。兩種方法在200 cp/mL和500 cp/mL濃度中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 核酸提取法和直接裂解法得到的核酸在快速擴(kuò)增試劑及快速熒光定量PCR儀器上擴(kuò)增得到的結(jié)果 Figure 3 Amplification results between nucleic acid extraction method and direct lysis method using rapid amplification reagent and rapid RT PCR instrument注：樣本的初始濃度分別為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL。黃色曲線表示N基因，黑色色曲線表示ORF1ab 基因

2.2 普通擴(kuò)增試劑和快速擴(kuò)增試劑的比較

2.2.1 以核酸提取法提取的核酸及普通熒光定量PCR儀器為基準(zhǔn)，比較普通擴(kuò)增試劑和快速擴(kuò)增試劑的擴(kuò)增結(jié)果 樣本的初始濃度為500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通擴(kuò)增試劑和快速擴(kuò)增試劑兩種試劑PCR結(jié)果的N基因和ORF1ab基因都為陽性。當(dāng)樣本濃度為200 cp/mL時候，普通擴(kuò)增試劑PCR結(jié)果的N基因為陽性，ORF1ab基因為弱陽性；而快速擴(kuò)增試劑PCR結(jié)果的N基因為陽性，ORF1ab基因為陰性(見圖1核酸提取法和圖2核酸提取法)。兩種方法之間僅在200 cp/mL濃度中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2 以直接裂解法的核酸及普通熒光定量PCR儀器為基準(zhǔn)，比較普通擴(kuò)增試劑和快速擴(kuò)增試劑的擴(kuò)增結(jié)果 樣本的初始濃度為200 cp/mL、500 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通擴(kuò)增試劑和快速擴(kuò)增試劑兩種試劑PCR結(jié)果完全一致，都為陰性、弱陽性或陽性。當(dāng)樣本濃度為1000 cp/mL時候，普通擴(kuò)增試劑PCR結(jié)果的N基因和ORF1ab基因均為陽性；而快速擴(kuò)增試劑PCR結(jié)果的N基因為陽性，ORF1ab基因為弱陽性(見圖1裂解釋放法和圖2裂解釋放法)。兩種方法之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的比較

2.3.1 以核酸提取法提取的核酸及快速擴(kuò)增試劑為基準(zhǔn)，比較普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的擴(kuò)增結(jié)果 樣本的初始濃度為500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器兩種儀器的結(jié)果完全一致，都為陽性。當(dāng)樣本濃度為200 cp/mL時候，普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的PCR結(jié)果的N基因和ORF1ab基因或者陽性或者陰性(見圖2核酸提取法和圖3核酸提取法)。兩種方法之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.2 以直接裂解法的核酸及快速擴(kuò)增試劑為基準(zhǔn)，比較普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的擴(kuò)增結(jié)果 樣本的初始濃度為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器兩種儀器的結(jié)果基本一致，都為陰性、弱陽性或陽性(見圖2裂解釋放法和圖3裂解釋放法)。兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 不同試劑、儀器及提取方法核酸檢測時間的比較 核酸提取法需要18 min，直接裂解法需要15 min。普通擴(kuò)增試劑在普通PCR儀器上擴(kuò)增時間為116 min，快速擴(kuò)增試劑在普通PCR儀器上擴(kuò)增時間為69 min，快速擴(kuò)增試劑在快速PCR儀器上擴(kuò)增時間為41 min。因此，理論上最快的檢測時間為56 min(41 min+15 min)，最慢的檢測時間為134 min(116 min+18 min)。而核酸提取法+快速擴(kuò)增試劑+快速PCR儀器擴(kuò)增時間的理論最快時間為59 min。僅僅比直接裂解法的總時長56 min多出3 min時間。

3 討論

新冠核酸檢測對于及時發(fā)現(xiàn)傳染源、降低疫情擴(kuò)散風(fēng)險具有重要意義[9-11]。國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組要求規(guī)范檢測技術(shù)[12-13]并要求使用高靈敏度的試劑(檢測限≤500 cp/mL)并提高新冠核酸檢測的時效性?？焖貾CR可以在更短時間內(nèi)完成對核酸分子的擴(kuò)增。近年來快速PCR技術(shù)從核酸擴(kuò)增試劑(PCR聚合酶的改進(jìn)、添加劑的開發(fā))和熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造等方面進(jìn)行了大量卓有成效的研究[14-19]。

本研究的新冠核酸快速檢測系統(tǒng)，由直接核酸裂解釋放試劑、快速擴(kuò)增試劑和快速熒光定量PCR儀組成。其快速熒光定量PCR儀(AGS 8830)和快速擴(kuò)增試劑可縮短整個實驗擴(kuò)增時間到41 min；并且樣本的核酸提取直接簡化為裂解釋放提取法。直接裂解法在臨床DNA核酸提取檢測方面有著廣泛的應(yīng)用，如乙型肝炎病毒[20]、結(jié)核分枝桿菌[21-22]、EB病毒[23]等；但同時也發(fā)現(xiàn)，直接裂解釋放提取的RAN很容易降解，不適用于丙型肝炎病毒、新冠等RNA核酸的檢測[24-27]。楊超杰等[25]特意比較了臨床常用的新冠核酸提取方法，發(fā)現(xiàn)直接裂解法(一步法)雖步驟簡單，但漏檢率高，不建議臨床使用。本實驗亦表明，如果使用直接裂解法，配合普通/快速擴(kuò)增試劑和普通/快速熒光PCR儀器，其敏感性均較差，不能滿足臨床最低檢測限≤500 cp/mL的疫情防控要求(醫(yī)療機構(gòu)新冠核酸檢測工作手冊(試行第二版2020.12.30)。而如果使用核酸提取法，配合普通/快速擴(kuò)增試劑和普通/快速熒光PCR儀器，其敏感性均較好，可以滿足檢測限≤500 cp/mL的要求。實驗亦發(fā)現(xiàn)普通擴(kuò)增試劑和快速擴(kuò)增試劑在500 cp/mL濃度的時候，沒有差異；在200 cp/mL時候快速擴(kuò)增試劑敏感性高于普通擴(kuò)增試劑，這可能與此時配套使用的是快速熒光PCR儀器相關(guān)。而普通熒光PCR儀器和快速熒光PCR儀器之間的比較，發(fā)現(xiàn)在檢測敏感性之間沒有顯著差異。以上說明，該快速檢測系統(tǒng)中，快速擴(kuò)增試劑和快速熒光PCR儀器的技術(shù)成熟穩(wěn)定，但是直接裂解法效果不佳。因此，實踐中，應(yīng)該使用核酸提取法配合使用快速擴(kuò)增試劑和快速熒光PCR儀器，這樣其總檢測時間可以從傳統(tǒng)方法的134 min縮短為59 min，且能滿足檢測限≤500 cp/mL的防控要求。

4 結(jié)論

在臨床實踐中，不建議使用直接裂解法提取核酸。但是可以使用某些適配性廣的快速擴(kuò)增試劑和快速熒光定量PCR儀，從而縮短檢測時間，滿足臨床防控要求。