ROCK2在ARC中的表達(dá)及對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的自噬及氧化損傷的影響*

嚴(yán)一杰 魏麗娟 孫建紅 張開(kāi)顏 李雷

(海南省人民醫(yī)院眼科，海南 ?？?570000)

視力障礙是全球性疾病負(fù)擔(dān)，也是致盲的重要原因。隨著我國(guó)人口老齡化的發(fā)展趨勢(shì)，年齡相關(guān)性白內(nèi)障(Age-related cataract，ARC)的發(fā)病率也越來(lái)越高，現(xiàn)已成為可逆性視力障礙和失明的首要原因[1-2]。目前，ARC的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但已知該疾病發(fā)生發(fā)展與紫外線輻射、氧化應(yīng)激、代謝紊亂、藥物和其他毒性因素有關(guān)[3]。對(duì)ARC發(fā)展過(guò)程中的具體分子機(jī)制進(jìn)行深入研究和闡明，尋找該疾病的病因，開(kāi)發(fā)有效的抗白內(nèi)障藥物，預(yù)防、延緩甚至逆轉(zhuǎn)晶狀體混濁，最大限度地保護(hù)患者的視覺(jué)功能[4]，這些對(duì)于減輕ARC患者壓力和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要的理論和社會(huì)意義。

Rho相關(guān)激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protein kinase 2，ROCK2)也稱為Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，是蛋白激酶A、G和C(PKA/PKG/PKC)家族的成員。ROCK有兩個(gè)高度同源的異構(gòu)體，即ROCK1和ROCK2，現(xiàn)已證實(shí)ROCK2參與細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程，例如增殖、凋亡、收縮、粘附和遷移等[4-5]，在病理過(guò)程中，ROCK2的過(guò)度活化會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移也受到ROCK途徑的調(diào)控[6]。此外，ROCK2在包括視網(wǎng)膜在內(nèi)的許多器官中均有表達(dá)，而其過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種眼部疾病的發(fā)生，如糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼[7-8]。但關(guān)于ROCK2在ARC中的相關(guān)作用及機(jī)制報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)ARC晶狀體前囊膜中ROCK2表達(dá)后，利用H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞建立體外ARC模型，觀察下調(diào)ROCK2表達(dá)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞自噬及氧化損傷的影響，探討ROCK2在白內(nèi)障病理過(guò)程中可能的作用及其機(jī)制，同時(shí)為白內(nèi)障靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年6月～2021年4月在我院進(jìn)行超聲乳化白內(nèi)障吸出術(shù)的ARC患者20例，獲取晶狀體前囊膜，男11例，女9例，年齡51～72歲，平均(58.91±5.43)歲，并取眼科標(biāo)本庫(kù)中無(wú)眼科疾病、眼球結(jié)構(gòu)完整且晶狀體透明的前囊膜。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 主要材料 人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；H2O2(美國(guó)Sigma公司)；免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京索萊寶生物公司)；Lipofectamine?RNAiMAX(美國(guó) Invitrogen公司)；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒(日本Takara公司)；免疫熒光染色試劑盒(上海翌圣生物公司)；MTT試劑盒、Bradford蛋白測(cè)定試劑盒、ECL試劑液和DCFH-DA試劑盒(上海碧云天生物研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗人ROCK2單克隆抗體、兔抗人Beclin-1、LC3-II、LC3-Ⅰ、GAPDH多克隆抗體及生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(英國(guó)Abcam公司)；自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3(美國(guó)GeneCopoeia公司)；sh-NC和sh-ROCK2載體均有廣州銳博生物公司合成構(gòu)建，引物序列交由上海生工生物工程公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 將ARC及正常晶狀體前囊膜清洗后，立即置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，組織塊連續(xù)切片，獲得厚度約為4 μm的切片。通過(guò)60℃烤箱烤片，浸入枸櫞酸緩沖液煮沸10 min，進(jìn)行熱抗原修復(fù)，再置于0.3%過(guò)氧化氫中室溫孵育10 min，以10%山羊血清室溫封閉后，采用稀釋的兔抗人ROCK2單克隆抗體(1：200)作為第一抗體，與切片在4℃下共孵育過(guò)夜。PBS沖洗切片后，滴加稀釋的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶1000)，室溫繼續(xù)共孵育1 h。利用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，捕獲圖像，其中黃色至棕色顆粒即為陽(yáng)性表達(dá)，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，Image J軟件分析所選區(qū)域的平均密度。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將凍存的HLE-B3細(xì)胞取出，置于37℃水浴鍋中融化，再以1000 rpm/min離心3 min，棄上清，在沉淀中加入含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，吹打成單細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組與處理具體如下：①對(duì)照組：HLE-B3細(xì)胞正常培養(yǎng)。②H2O2組：100 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細(xì)胞24 h。③sh-NC+H2O2組：轉(zhuǎn)染sh-NC至HLE-B3細(xì)胞，以100 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細(xì)胞24 h。④sh-ROCK2+H2O2組：轉(zhuǎn)染sh-ROCK2至HLE-B3細(xì)胞，以100 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細(xì)胞24 h。利用Lipofectamine?RNAiMAX分別將sh-NC和sh-ROCK2序列轉(zhuǎn)染至HLE-B3細(xì)胞，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染后HLE-B3細(xì)胞總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄操作合成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明檢測(cè)擴(kuò)增，以定量ROCK2 mRNA的表達(dá)水平，選擇β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)系統(tǒng)的程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性3 min，1次循環(huán)；95 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，42次循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ROCK2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：ROCK2上游5′- ATTCAGCAGCTGGAATCTAA-3′，下游5′-GTCTCTTCTCCAGTTCTAC-3′；β-actin上游5′-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCT-A-3′，下游5′- AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3′。

1.3.4 Western blot 在轉(zhuǎn)染后或各處理組的HLE-B3細(xì)胞中加入預(yù)冷RIPA緩沖液，冰上裂解，通過(guò)4000 rpm離心15 min以提取總蛋白，Bradford法定量。制備10%SDS-PAGE凝膠，將提取的各組蛋白樣品等量上樣后，凝膠電泳分離，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入各稀釋的一抗抗體，4℃下共孵育過(guò)夜。棄去原液，TBST洗膜，加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫繼續(xù)孵育1 h，TBST洗膜。利用ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝各個(gè)蛋白條帶，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，Image J軟件分析灰度值，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 MTT法 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HLE-B3細(xì)胞，調(diào)整密度按1×105個(gè)/孔植入96孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)夜后，按照1.3.2分4組進(jìn)行對(duì)應(yīng)處理，結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h，加入50 μL 1×MTT至待測(cè)細(xì)胞孔，混勻，37℃孵育 4 h，洗掉上清，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床振蕩10 min，待結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度值(OD值)。

1.3.6 透射電鏡觀察 收集各處理組HLE-B3細(xì)胞，以2000 rpm離心5 min，利用4%多聚甲醛和4%戊二醛混合液固定細(xì)胞。將細(xì)胞樣品包埋并制備成超薄切片，以3%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。透射電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體，并捕獲細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖像。

1.3.7 細(xì)胞免疫熒光染色 將各處理組HLE-B3細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至貼壁，加入mRFP-GFP-LC3病毒液感染細(xì)胞，MOI為50，繼續(xù)孵育2～6 h后，棄掉原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，封片液封片，共聚焦顯微鏡觀察染色情況，攝取圖片，結(jié)果中兩種熒光融合后出現(xiàn)的黃色斑點(diǎn)代表自噬體，融合后出現(xiàn)的紅色斑點(diǎn)代表自噬溶酶體，通過(guò)對(duì)不同顏色斑點(diǎn)的計(jì)數(shù)來(lái)判斷細(xì)胞內(nèi)自噬流水平，每組隨機(jī)選擇3個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的紅點(diǎn)與黃點(diǎn)數(shù)目來(lái)定量自噬水平。

1.3.8 DCFH-DA法 首先在 DCFH-DA試劑液加入無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋(比例為1∶1000)，收集各處理組HLE-B3細(xì)胞，以2000 rpm離心5 min，棄上清，加入稀釋的DCFH-DA重懸細(xì)胞，調(diào)整密度按2×104個(gè)/孔植入24孔板內(nèi)，37℃下孵育20 min，期間每隔5 min輕晃1次。結(jié)束后，以1000 rpm離心10 min，PBS洗滌細(xì)胞并將沉淀重懸，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析ROS。

1.3.9 氧化反應(yīng)指標(biāo)測(cè)定 采用細(xì)胞裂解液裂解各處理組HLE-B3細(xì)胞，收集上清液，并進(jìn)行蛋白電量。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)處理樣品，酶標(biāo)儀測(cè)定對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下各孔A值，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)含量。

2 結(jié)果

2.1 ROCK2在ARC患者晶狀體囊膜中的表達(dá) 免疫組化染色檢測(cè)ARC晶狀體囊膜中ROCK2表達(dá)，以正常晶狀體囊膜作為對(duì)照，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ARC晶狀體囊膜中染色強(qiáng)度較正常組織明顯增加，ROCK2表達(dá)增強(qiáng)(見(jiàn)圖1A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，與正常組織比較，ARC晶狀體囊膜中ROCK2相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

圖1 年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體囊膜中ROCK2表達(dá)檢測(cè)Figure 1 Detection of ROCK2 expression in the lens capsule of age-related cataract patients注：A.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ROCK2表達(dá)(400×)；B.Western blot檢測(cè)ROCK2蛋白表達(dá)。與正常組織比較，①P<0.05

2.2 HLE-B3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果檢測(cè) HLE-B3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和sh-NC組比較，sh-ROCK2組細(xì)胞中ROCK2的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染sh-ROCK2后成功下調(diào)HLE-B3細(xì)胞中ROCK2表達(dá)水平，見(jiàn)圖2。

圖2 HLE-B3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定Figure 2 Determination of transfection efficiency of HLE-B3 cells注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與sh-NC組比較，②P<0.05

2.3 下調(diào)ROCK2對(duì)H2O2刺激下晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性的影響 MTT法檢測(cè)各處理組HLE-B3細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H2O2組在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，細(xì)胞增殖活性均顯著下降(P<0.05)；而相較于H2O2組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-ROCK2后經(jīng)H2O2處理時(shí)，其增殖活性均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組HLE-B3細(xì)胞增殖活性比較Figure 3 Comparison of the proliferation activity of HLE-B3 cells in each group

2.4 下調(diào)ROCK2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞自噬的影響 通過(guò)透射電鏡觀察各處理組HLE-B3細(xì)胞內(nèi)自噬情況，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)緊密，未見(jiàn)自噬體，H2O2組和sh-NC+H2O2組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)多個(gè)由單層膜或雙層膜的自噬體，數(shù)目明顯多于對(duì)照組，sh-ROCK2+H2O2組細(xì)胞偶有自噬體，數(shù)目較H2O2組明顯減少(見(jiàn)圖4)。通過(guò)免疫熒光染色觀察各組HLE-B3細(xì)胞內(nèi)自噬流，與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞內(nèi)紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，說(shuō)明H2O2明顯激活了自噬溶酶體和自噬體水平(P<0.05)；與H2O2組比較，sh-ROCK2+H2O2組細(xì)胞內(nèi)紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度均明顯減弱，細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬體水平受到抑制(P<0.05)(見(jiàn)圖5)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H2O2組HLE-B3細(xì)胞中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，LC3-II/LC3-Ⅰ比值顯著上調(diào)(P<0.05)；與H2O2組比較，sh-ROCK2+H2O2組細(xì)胞中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，LC3-II/LC3-Ⅰ比值顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖4 各組HLE-B3細(xì)胞內(nèi)自噬體觀察(10000×)Figure 4 Observation of autophagosomes in HLE-B3 cells in each group 注：箭頭所指為自噬體

圖5 各組HLE-B3細(xì)胞內(nèi)自噬流水平(100×)Figure 5 Intracellular levels of autophagy in HLE-B3 cells in each group 注：紅色斑點(diǎn)是自噬溶酶體(mRFP)；黃色斑點(diǎn)是自噬體(mRFP+GFP)

圖6 各組HLE-B3細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 6 Autophagy-related protein expression in HLE-B3 cells in each group注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與H2O2組比較，②P<0.05

2.5 下調(diào)ROCK2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 DCFH-DA法檢測(cè)各處理組HLE-B3細(xì)胞內(nèi)ROS水平，H2O2組細(xì)胞ROS水平較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)；而sh-ROCK2+H2O2組細(xì)胞ROS水平較H2O2組則顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)圖7)。H2O2組HLE-B3細(xì)胞中SOD和GSH-Px的活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而相較于H2O2組，sh-ROCK2+H2O2組細(xì)胞中SOD和GSH-Px的活性均顯著升高，MDA含量則顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖7 各組HLE-B3細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)Figure 7 Detection of ROS levels in HLE-B3 cells in each group注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與H2O2組比較，②P<0.05

表1 各組HLE-B3細(xì)胞SOD和GSH-Px活性及MDA含量比較Table 1 Comparison of SOD and GSH-Px activities and MDA content of HLE-B3 cells in each group

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，由白內(nèi)障引起的失明約占所有失明人數(shù)的50%，而且還在以每年0.4～120萬(wàn)的速度增長(zhǎng)，其中ARC的比例最高[2]。迄今為止，手術(shù)切除仍是ARC唯一有效的治療方法，但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、術(shù)后并發(fā)癥及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等因素均限制該療法[9-10]。因此，開(kāi)發(fā)安全且低成本的方案來(lái)預(yù)防或治療ARC，是當(dāng)前眼科疾病臨床研究的一項(xiàng)重點(diǎn)內(nèi)容。

在Rho家族成員中，RhoA不僅在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞形態(tài)、平滑肌細(xì)胞收縮等細(xì)胞活動(dòng)中起重要作用，而且參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)活動(dòng)，如平滑肌細(xì)胞增殖與細(xì)胞粘附。在細(xì)胞代謝過(guò)程中，Rho蛋白以磷酸鳥(niǎo)嘌呤三核苷酸(GTP)和磷酸鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(GDP)結(jié)合形式存在，通過(guò)GDP磷酸化和GTP去磷酸化之間的相互轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)或終止細(xì)胞級(jí)聯(lián)激活的反應(yīng)[11-12]。ROCK2作為小GTP酶Rho亞家族的下游效應(yīng)子，在與Rho中GTP酶相互作用后被激活，并通過(guò)一系列途徑作用于細(xì)胞骨架及其靶蛋白，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[4,13]。目前，關(guān)于ROCK2在疾病中的研究較為廣泛，且多項(xiàng)研究證明抑制ROCK2可在一些疾病中發(fā)揮積極作用，如Knipe等[14]研究指出ROCK1和ROCK2均有助于博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷后組織纖維化的發(fā)展，而在ROCK1或ROCK2單倍體不足的小鼠中ROCK1或ROCK2的表達(dá)降低能夠減輕其受博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化；Yang等[15]發(fā)現(xiàn)ROCK2抑制劑Ripasudil通過(guò)調(diào)節(jié)ROCK2/eNOS信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。此外，關(guān)于ROCK2在眼科疾病中的研究也已有報(bào)道，Gao等[16]研究表明ROCK2抑制劑Ripasudil通過(guò)上調(diào)miR-136-5p表達(dá)可減輕視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的炎癥損傷，經(jīng)驗(yàn)證還發(fā)現(xiàn)miR-136-5p對(duì)ROCK1和ROCK2均有靶向作用；Hida等[17]研究指出抑制ROCK通路能夠顯著抑制視網(wǎng)膜靜脈阻塞的惡化，減少視網(wǎng)膜水腫與非灌注區(qū)的大小，并改善了視網(wǎng)膜血流量。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)靶向下調(diào)HLE-B3中ROCK2的表達(dá)后能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞增殖活性的下降。這一結(jié)果同樣也提示，抑制ROCK2表達(dá)能夠減輕H2O2誘導(dǎo)下人晶狀體上皮細(xì)胞的損傷，推測(cè)這可能對(duì)于ARC造成的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷起到改善作用。

隨著年齡的增長(zhǎng)，眼部的不同組織會(huì)發(fā)生一系列變化，包括線粒體代謝失調(diào)、葡萄糖和脂質(zhì)利用模式改變、甲基化代謝物積累以及?；撬岽x受損，這些變化都可能歸因于眼病的發(fā)生[18]。同時(shí)，內(nèi)源性抗氧化劑如SOD和GSH-Px的活性明顯降低，而ROS的產(chǎn)生卻增加，ROS的過(guò)量產(chǎn)生對(duì)包括DNA和蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物分子造成了結(jié)構(gòu)性損傷，阻礙眼部相關(guān)受損細(xì)胞核和線粒體DNA的修復(fù)過(guò)程，從而導(dǎo)致細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定、細(xì)胞衰老和年齡相關(guān)疾病的發(fā)生[19-21]。本研究中，在H2O2誘導(dǎo)下HLE-B3細(xì)胞發(fā)生了氧化損傷，而下調(diào)HLE-B3細(xì)胞中ROCK2表達(dá)能夠明顯抑制ROS水平，降低MDA含量，并提高SOD和GSH-Px的活性，對(duì)H2O2誘導(dǎo)下HLE-B3細(xì)胞的氧化損傷起到一定的保護(hù)作用。

自噬是一種進(jìn)化上保守的分解代謝過(guò)程，負(fù)責(zé)依賴溶酶體的降解和再循環(huán)，在維持真核生物的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和活力方面發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞自噬過(guò)程中，可以降解異常物質(zhì)和功能失調(diào)的細(xì)胞器，以滿足和維持細(xì)胞的代謝需要，因此，自噬可由多種應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)，例如饑餓、缺氧、電離輻射、化療藥物以及感染等[22-23]。在一些情況下，自噬可以在細(xì)胞中起到機(jī)制保護(hù)作用，然而，過(guò)度自噬引起過(guò)度降解，從而對(duì)機(jī)體造成不利影響，能夠引起自噬性細(xì)胞死亡。越來(lái)越多的研究報(bào)道指出自噬與多種眼部疾病有關(guān)，如自噬失調(diào)會(huì)損害小梁網(wǎng)房水流出的通路并促進(jìn)青光眼的惡化[24]，晶狀體在氧化應(yīng)激下過(guò)度的自噬反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失從而進(jìn)一步促進(jìn)白內(nèi)障的發(fā)展[25]?，F(xiàn)已知，過(guò)量的ROS會(huì)通過(guò)觸發(fā)線粒體氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)度自噬發(fā)生[26]，本研究檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，經(jīng)H2O2誘導(dǎo)下HLE-B3細(xì)胞ROS水平升高，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體增加，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1相對(duì)表達(dá)量顯著升高，LC3-II/LC3-Ⅰ比值也顯著上調(diào)，細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度自噬現(xiàn)象。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在下調(diào)HLE-B3細(xì)胞中ROCK2表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體均減少，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1相對(duì)表達(dá)量顯著降低，LC3-II/LC3-Ⅰ比值顯著下調(diào)，由此說(shuō)明，下調(diào)HLE-B3細(xì)胞中ROCK2表達(dá)抑制了H2O2誘導(dǎo)下的過(guò)度自噬，從而發(fā)揮了相關(guān)的功能作用。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床上治療白內(nèi)障的方法也在增多，并不斷提高與完善，生物靶向治療現(xiàn)也已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者在ARC方面研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，包括一些抗晶狀體上皮細(xì)胞增生藥物的局部應(yīng)用，或者通過(guò)制備轉(zhuǎn)染抗晶狀體上皮細(xì)胞抗體和免疫毒素的載體以抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增生等[27]。本研究結(jié)果也為ARC的生物靶向治療研究提供了新的思路。隨著生物靶向治療進(jìn)一步臻熟和臨床應(yīng)用，相信ARC將得到有效的防治。但ARC的發(fā)生涉及多種致病因素，需要從多方位著手以探究有效的綜合防治策略。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，ROCK2在ARC晶狀體前囊膜中高表達(dá)，下調(diào)人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3中ROCK2表達(dá)能夠明顯改善H2O2誘導(dǎo)下細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度自噬以及氧化損傷，對(duì)該細(xì)胞達(dá)到較好的保護(hù)作用。