乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕片褐變和活性氧代謝的影響

徐雨晗，包垠秋，易 陽(yáng)，艾有偉，王宏勛，閔 婷*

（1 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢 430023 2 武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 武漢 430023）

蓮藕是營(yíng)養(yǎng)豐富的水生蔬菜，且具有一定藥用價(jià)值。 近些年來(lái)，鮮切蓮藕逐步走向市場(chǎng)，受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。有研究表明，酶促褐變是導(dǎo)致鮮切蓮藕片貨架期質(zhì)量下降的主要因素，其主要反應(yīng)是多酚向醌類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[1]。 也有研究表明，活性氧代謝與褐變密切相關(guān)，提高鮮切蓮藕的抗氧化能力，能延緩褐變的發(fā)生[2]。 目前化學(xué)處理在鮮切蓮藕保鮮中的應(yīng)用最為廣泛，如H2S[2]、草酸[3]、ClO2[4]及表油菜素內(nèi)酯[5]處理均能有效延緩鮮切蓮藕的褐變，然而，化學(xué)試劑的安全性問(wèn)題須引起足夠的重視。

乙醇處理作為一種安全無(wú)毒、 化學(xué)污染小的保鮮技術(shù)，可以調(diào)節(jié)果蔬生理代謝速度[6]，減少果蔬微生物的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，保持高質(zhì)量的果蔬品質(zhì)。 同時(shí)，乙醇處理能夠抑制果蔬的褐變，包括萵苣[7]、鮮切甘蔗[8]、鮮切山藥[9]、雙孢蘑菇[10]等。 此外，乙醇處理能夠提高果蔬的抗氧化能力，在木薯[11]、櫻桃番茄[12]、楊梅[13]、西蘭花[14]的 研究中都得到證實(shí)。目前，關(guān)于乙醇處理鮮切蓮藕的報(bào)道較少。Gao 等[15]研究表明鮮切蓮藕采用乙醇和抗壞血酸溶液?jiǎn)为?dú)處理或聯(lián)合處理，能夠保持鮮切蓮藕的品質(zhì)，延緩褐變，抑制微生物生長(zhǎng)。然而，目前缺乏乙醇處理抑制鮮切蓮藕褐變的機(jī)制研究。 本試驗(yàn)以蓮藕為材料，研究10 ℃貯藏條件下150 μL/L 乙醇熏蒸處理2 h 對(duì)鮮切蓮藕褐變的影響，并以酚類(lèi)代謝和活性氧代謝為切入點(diǎn)，探討外源乙醇處理延緩鮮切蓮藕褐變的作用機(jī)理，以期為鮮切蓮藕的貨架保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘鄂蓮5 號(hào)’蓮藕，武漢市漢口北四季青農(nóng)貿(mào)城。

乙醇 （分析純級(jí)）、 福林酚、 無(wú)水碳酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、沒(méi)食子酸、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、H2O2、PEG 6000、PVPP、95%乙 醇、NaCl、2-硫代巴比妥酸、氯化羥胺、抗壞血酸、草酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；2，6-二氯靛酚鈉鹽，源葉生物科技有限公司；Trition X-100，白鯊生物科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶（PAL）試劑盒、過(guò)氧化氫含量測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定試劑盒、羥基自由基產(chǎn)生速率測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其它所用試劑均為分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

JZ-300 通用色差計(jì)，深圳市金淮儀器設(shè)備有限公司；MIR-154 型低溫貯藏箱，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；EOS 550D 相機(jī)，佳能（中國(guó)）有限公司；塑料薄膜封口機(jī)，溫州市興業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司；切菜機(jī)CHD-40，濟(jì)南宏泰食品機(jī)械有限公司；XZ-10DTD 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；V-1100D 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乙醇熏蒸最佳時(shí)間和濃度的篩選試驗(yàn) 將‘鄂蓮5 號(hào)’蓮藕在4 ℃的冰箱中預(yù)冷24 h，剔除有病害蟲(chóng)害和機(jī)械損傷嚴(yán)重的蓮藕；選擇短、粗、大小均一，色澤一致的蓮藕作為試驗(yàn)材料。用清水洗去蓮藕表面污泥，去皮后，將其切成約4 mm 厚度的藕片。將切好的藕片置于清水中，在水中通臭氧5 min，以進(jìn)行減菌處理。 將減菌處理后的蓮藕片分成乙醇熏蒸組和對(duì)照組（CK）。 乙醇熏蒸組：將藕片從清水中撈出，甩干表面水分，平鋪在塑料貨架（370 mm×350 mm×60 mm）上，將鋪好藕片的貨架放入熏蒸裝置上層（裝置體積為56 L）。 在裝置下層放置一塊滴有一定濃度酒精的紗布，打開(kāi)裝置內(nèi)的電風(fēng)扇后，在裝置表面覆上3 層保鮮膜，將蓋好蓋子的熏蒸裝置在10 ℃冰箱放置2 h。 熏蒸完成后，將鮮切蓮藕用PE 包裝袋包裝，于10℃冰箱中貯藏14 d。 對(duì)照組：熏蒸裝置中不滴入酒精，不開(kāi)啟電扇，其它操作與乙醇熏蒸組相同。

在乙醇熏蒸濃度篩選預(yù)試驗(yàn)中，分別選用了100，150，200，250，300 μL/L 的乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕片2 h，發(fā)現(xiàn)150 μL/L 的乙醇熏蒸處理，蓮藕的褐變程度最輕，L*值最高，因此150 μL/L 為最佳熏蒸濃度。在乙醇熏蒸時(shí)間篩選的預(yù)試驗(yàn)中，使150 μL/L 乙醇熏蒸處理藕片的時(shí)間分別為0.5，1，2，3，4 h，根據(jù)外觀品質(zhì)和L*值的變化，150 μL/L 乙醇熏蒸處理2 h 的鮮切蓮藕片有最佳的外觀和最高的L*值，因此選用150 μL/L 乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕2 h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，對(duì)照組和乙醇熏蒸處理組各項(xiàng)指標(biāo)分別在0，2，4，6，8，10，12 d 測(cè)定。

1.3.2 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕褐變的影響試驗(yàn)感官品質(zhì)采用佳能EOS 550D 相機(jī)在小型攝影棚中拍攝。表面色差的變化采用JZ-300 通用色差計(jì)測(cè)量，記錄L*值，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 褐變度測(cè)定方法參照Min 等[1]方法。 取3.0 g 蓮藕組織樣品于30 mL 蒸餾水中，在冰浴條件下勻漿，在4 ℃下以10 000 r/min 離心10 min，取上清液在25 ℃下保溫5 min，在410 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，褐變度表示為OD410nm×10，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕酚類(lèi)代謝的影響試驗(yàn) 總酚含量根據(jù)Folin-Ciocalteu 方法測(cè)定[1]，結(jié)果表示為沒(méi)食子酸當(dāng)量mg/kg FW。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 總醌含量測(cè)定參考Yan 等[7]的方法，將5.0 g 鮮切蓮藕組織于50 mL 離心管中，加入20 mL 甲醇，以10 000 r/min 勻漿1.2 min，勻漿完畢后以10 000 r/min 在4 ℃離心10 min，取上清液在437 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，可溶性醌表示為OD437nm。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

使用苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine enzyme，PAL）測(cè)試盒測(cè)定鮮切蓮藕中PAL 活力。一個(gè)PAL活力單位定義為每g 組織在每mL 反應(yīng)體系中使290 nm 波長(zhǎng)處吸光度值變化0.1 所需的酶量。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。使用Min 等[1]的方法測(cè)定多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性。 一個(gè)PPO 酶活力單位定義為每min 引起吸光度改變0.001 所需酶量。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.4 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕ROS 代謝的影響試驗(yàn) 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率使用鹽酸羥胺法[16]測(cè)定。 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率定義為每min 每g 果蔬組織產(chǎn)生的超氧陰離子的物質(zhì)的量，表示為nmol/（min·g），每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 羥自由基生成速率和過(guò)氧化氫含量分別使用羥基自由基測(cè)定試劑盒和過(guò)氧化氫含量測(cè)定試劑盒測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

分別使用總超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）測(cè)定試劑盒測(cè)定鮮切蓮藕中SOD 和CAT 酶活力。 一個(gè)SOD 活力單位定義為在1 mL 反應(yīng)溶液中每g 組織的SOD 抑制率達(dá)到50%，一個(gè)CAT活力單位定義為每g 組織每s 分解1 μmol 過(guò)氧化氫。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 使用Min 等[1]方法測(cè)定過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性。 一個(gè)POD 酶活力單位定義為每min 引起吸光度變化0.01 所需的酶量。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

抗壞血酸含量的測(cè)定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[16]，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-Diphenyl -2 -trinitrophenylhydrazine，DPPH） 自由基清除率的測(cè)定參考Yi 等[17]的方法，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕褐變的影響

鮮切果蔬的褐變程度會(huì)影響消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲望，乙醇熏蒸處理后鮮切蓮藕的褐變程度變輕。由圖1a 可知，在貯藏處理前期，鮮切蓮藕的外表顏色為亮白色，經(jīng)過(guò)12 d 貯藏，對(duì)照組的鮮切蓮藕表面呈棕褐色，處理組的鮮切蓮藕呈淺棕色。 如圖1b～1c 所示，在貯藏過(guò)程中，鮮切蓮藕的褐變度不斷上升，L*值不斷下降，乙醇處理顯著延緩了鮮切蓮藕褐變度的上升和L*值的下降（P<0.05）。 經(jīng)過(guò)12 d 貯藏，處理組的褐變度比對(duì)照組低6%，L*值比對(duì)照組高19%。

圖1 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕片褐變的影響Fig.1 Effects of ethanol vapor treatment on browning of fresh-cut lotus root slices

2.2 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕酚類(lèi)代謝的影響

2.2.1 對(duì)總酚和總醌含量的影響 酚類(lèi)物質(zhì)向醌類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換是果蔬酶促褐變的重要反應(yīng)，總酚含量的降低有利于延緩褐變的發(fā)生[18]。如圖2a～2b所示，鮮切蓮藕在貯藏12 d 內(nèi)，乙醇處理顯著抑制了鮮切蓮藕中總酚和總醌含量的上升 （P<0.05），貯藏至第12 天時(shí)，對(duì)照組的總酚和總醌含量分別是對(duì)照的1.24 和1.18 倍。

圖2 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕片總酚和可溶性醌含量的影響Fig.2 Effects of ethanol vapor treatment on the contents of total phenol （a） and soluble quinone （b）of fresh-cut lotus root slices

2.2.2 對(duì)PAL 和PPO 活力的影響 PAL 酶是酚類(lèi)物質(zhì)合成途徑——苯丙烷代謝的限速酶[7]，在有氧環(huán)境下PPO 能促進(jìn)多酚向醌的轉(zhuǎn)化。 如圖3a～3b 所示，在整個(gè)貯藏期間，乙醇熏蒸處理顯著抑制了鮮切蓮藕PAL 和PPO 活力的上升（P<0.05），第12 天時(shí)，處理組PAL 和PPO 酶活力分別比對(duì)照組低約10%和30%。

圖3 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕片PAL 和PPO 活力的影響Fig.3 Effects of ethanol vapor treatment on the activities of PAL （a） and PPO （b） of fresh-cut lotus root slices

2.3 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕活性氧代謝的影響

2.3.1 對(duì)ROS 生成的影響 通過(guò)呼吸作用進(jìn)入生物體內(nèi)的氧分子，接受1 個(gè)電子后變成O2-·，O2-·能衍生成H2O2、·OH 和1O2等自由基；·OH 和H2O2的積累可引發(fā)細(xì)胞質(zhì)膜上不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧自由基，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害，從而導(dǎo)致果蔬品質(zhì)下降[16]。 由圖4a 可知，貯藏期間鮮切蓮藕的O2-·生成速率先略下降，然后在第4 天上升至峰值，最后持續(xù)降低，乙醇處理顯著抑制了低溫貯藏期間鮮切蓮藕的O2-·生成速率（P<0.05）。 由圖4b～4c 可知，貯藏期間鮮切蓮藕的·OH 產(chǎn)生速率和H2O2均呈先上升后下降的趨勢(shì)，乙醇處理顯著抑制了H2O2的積累（P<0.05），同時(shí)降低了·OH 產(chǎn)生速率，然而與對(duì)照之間差異不顯著（P>0.05）。

圖4 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕片ROS 積累的影響Fig.4 Effects of ethanol vapor treatment on the ROS accumulation of fresh-cut lotus root slices

2.3.2 對(duì)抗氧化酶活力的影響 SOD 能通過(guò)歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基（O2-·），并與CAT、POD 等酶共同抵御活性氧或其它過(guò)氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害[16]。 如圖5a 所示，在貯藏期間，處理組和對(duì)照組的SOD 活力較第0 天都有所提高，且處理組的SOD 活力高于對(duì)照組，在貯藏12 d 時(shí)，處理組的SOD 活力是對(duì)照組的1.02 倍。由圖5b 可知，在貯藏過(guò)程中，CAT 活力呈先上升后降低的趨勢(shì)，處理組的CAT 活力顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。 如圖5c 所示，在2～8 d，處理組的POD 活力顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。 在貯藏末期，乙醇熏蒸對(duì)POD 酶活力的提高作用消失，甚至對(duì)照組酶活力高于處理組。

圖5 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕片SOD、CAT和POD 活力的影響Fig.5 Effects of ethanol vapor treatment on the activities of SOD （a），CAT （b），and POD activity （c）of fresh-cut lotus root slices

2.3.3 對(duì)非酶促抗氧化能力的影響 抗壞血酸含量和DPPH 自由基清除能力是評(píng)價(jià)果蔬貯藏品質(zhì)非酶促抗氧化能力的重要指標(biāo)[18]，由圖6a 可知，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，鮮切蓮藕的抗壞血酸含量持續(xù)下降，乙醇熏蒸處理顯著抑制了抗壞血酸的損失（P<0.05），貯藏至12 d，CK 組的抗壞血酸含量下降約41%，乙醇熏蒸組下降約34%。 由圖6b 可知，DPPH 自由基清除率先上升后下降，貯藏期間處理組中DPPH 自由基清除率較對(duì)照組有所提高，而兩者之間差異不顯著（P>0.05）。 兩組鮮切蓮藕片的DPPH 自由基清除率均在第4 天左右出現(xiàn)峰值，在該天處理組的DPPH 自由基清除率是對(duì)照組的1.08 倍。

圖6 乙醇熏蒸處理對(duì)鮮切蓮藕片抗壞血酸含量和DPPH 自由基清除率的影響Fig.6 Effects of ethanol vapor treatment on the ascorbic acid contents and DPPH free radical scavenging capacity of fresh-cut lotus root slices

3 結(jié)論與討論

鮮切蓮藕加工過(guò)程中要經(jīng)過(guò)去皮、 切分和包裝等一系列加工程序，這些工序加快了鮮切蓮藕的褐變。本研究采用乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕，發(fā)現(xiàn)150 μL/L 乙醇熏蒸處理能有效維持鮮切蓮藕的外觀品質(zhì)和L*值，顯著降低表面褐變程度。 在其它果蔬中也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，200 μL/L 乙醇熏蒸處理鮮切山藥[9]，400 μL/L 乙醇熏蒸處理雙孢蘑菇[10]和200 mL/L 乙醇浸泡處理鮮切萵苣[7]能降低果蔬表面褐變程度，然而不同品種的果蔬乙醇處理濃度和處理方式存在差異。

大量研究證實(shí)，鮮切蓮藕褐變主要是由酶促褐變引起，酚類(lèi)代謝是酶促褐變的重要途徑。 PAL酶是酚類(lèi)物質(zhì)形成的關(guān)鍵酶，乙醇熏蒸處理顯著抑制了鮮切蓮藕PAL 酶活力。 PAL 酶活力的降低有助于延緩褐變[19]，Yan 等[7]在鮮切生菜的研究中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，且該研究認(rèn)為乙醇處理對(duì)PAL 酶活力的抑制作用與PAL 相關(guān)酶基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。 與PAL 酶活力降低相對(duì)應(yīng)，乙醇熏蒸處理后鮮切蓮藕中總酚含量顯著降低，與前人在鮮切萵苣[7]和雙孢蘑菇[20]中的報(bào)道結(jié)果一致。 PPO 能夠催化酚類(lèi)物氧化形成醌類(lèi)物質(zhì)，乙醇處理顯著降低了鮮切蓮藕中的PPO 活力。彭益強(qiáng)等[21]提出，乙醇分子中羥基和鄰苯二酚等酚類(lèi)化合物化學(xué)性質(zhì)較為相似，其可通過(guò)與PPO 的底物競(jìng)爭(zhēng)酶活性中心基團(tuán)的方式抑制PPO 酶活力。 鮮切蓮藕貯藏過(guò)程中，醌類(lèi)物質(zhì)的大量積累導(dǎo)致黑色素的形成，乙醇熏蒸能夠抑制醌類(lèi)物質(zhì)的積累，從而減輕褐變。這不僅與外觀上深褐色變淺相對(duì)應(yīng)，還與總酚含量降低和PAL 和PPO 酶活力的降低相對(duì)應(yīng)。 因此，乙醇處理能夠通過(guò)抑制鮮切蓮藕在貯藏過(guò)程中的酚類(lèi)代謝，從而減輕褐變。

ROS 有多種形式，超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）和過(guò)氧化氫（H2O2）等均為常見(jiàn)的ROS[22]。 本研究中，乙醇處理能夠減少細(xì)胞內(nèi)H2O2含量的積累，降低O2-·產(chǎn)生速率及·OH 生成能力，通過(guò)降低活性氧代謝產(chǎn)物的生成速率，減輕活性氧對(duì)細(xì)胞造成的傷害。 Liu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇處理可有效降低木薯的H2O2含量及O2-·生成速率，與本研究結(jié)果一致。抗氧化酶在褐變抑制中起著關(guān)鍵作用，SOD、CAT 和POD 等作為酶促防御系統(tǒng)中主要的代謝酶，能清除自由基，減輕膜的過(guò)氧化，維持膜的穩(wěn)定性[23]。 在本研究中，乙醇熏蒸處理后的鮮切蓮藕片中有SOD、CAT 和POD 同步激活的現(xiàn)象，這與乙醇處理后鮮切蓮藕具有更好的外觀相一致。這些結(jié)果表明，乙醇誘導(dǎo)的抗氧化酶活力提升可能是蓮藕片褐變抑制的關(guān)鍵條件。在乙醇熏蒸處理鮮切西蘭花[24]和鮮切草莓[25]中也發(fā)現(xiàn)了乙醇處理對(duì)植物酶促抗氧化系統(tǒng)的促進(jìn)作用。 Han 等[24]研究發(fā)現(xiàn)乙醇熏蒸能提高鮮切西藍(lán)花的SOD、CAT 和POD 酶活力以延緩其衰老，Li 等[25]的研究表明乙醇熏蒸通過(guò)上調(diào)抗氧化酶基因來(lái)誘導(dǎo)酶活力的提升。此外，乙醇熏蒸也能提高鮮切蓮藕的非酶促抗氧化能力，主要體現(xiàn)在顯著抑制抗壞血酸含量的損失和顯著提升DPPH 自由基清除能力兩個(gè)方面，與前人在櫻桃番茄[12]、楊梅[13]和西蘭花[14]中獲得的結(jié)果相似。

綜上所述，150 μL/L 乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕2 h 能有效延緩貯藏期間鮮切蓮藕褐變的發(fā)生，其不僅能夠維持鮮切蓮藕的感官品質(zhì)，還能顯著延緩鮮切蓮藕的褐變度的上升和L*值的下降。 進(jìn)一步研究表明，乙醇熏蒸處理抑制了鮮切蓮藕的酚類(lèi)代謝，表現(xiàn)為顯著降低總酚和可溶性醌含量，顯著抑制PAL 和PPO 酶活力。 同時(shí)，乙醇熏蒸處理提高了鮮切蓮藕的抗氧化水平，其不僅顯著降低了O2-·生成速率和H2O2含量，還能顯著提高CAT、POD 活力和抗壞血酸含量。 此外，乙醇處理對(duì)抑制·OH 的生成速率，提高SOD 活力和DPPH自由基清除率有一定積極作用，然而與對(duì)照之間差異不顯著。以上結(jié)果表明，乙醇熏蒸處理能夠通過(guò)抑制鮮切蓮藕的酚類(lèi)代謝，提高抗氧化水平，有效減輕鮮切蓮藕褐變。