金納米片/膠帶SERS柔性基底的制備及對(duì)敵百蟲的檢測(cè)

謝 潔，馬小媛*，王周平

（1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無(wú)錫 214122）

敵百蟲（TCF）是一種常見的有機(jī)磷農(nóng)藥，常用于水稻、馬鈴薯、玉米、小麥等農(nóng)作物，起到殺蟲、殺菌、除草等作用。然而，農(nóng)藥的實(shí)際利用率約為15%，大部分農(nóng)藥會(huì)殘留在環(huán)境中，對(duì)土壤、海洋、大氣和作物造成污染，最終影響人類健康[1-3]。目前對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)多采用色譜檢測(cè)法[4-6]以及基于生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)，包括酶抑制法[7]、免疫分析法[8]、傳感器法[9]等，它們的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，然而，通常成本較高，操作過程較為復(fù)雜，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）是一種利用粗糙的金屬表面對(duì)待測(cè)分子的拉曼信號(hào)進(jìn)行增強(qiáng)的光散射現(xiàn)象。近年來(lái)，隨著各種納米制造技術(shù)日益成熟，以及SERS 技術(shù)獨(dú)特的指紋識(shí)別特性和高靈敏性，使其在化學(xué)分析、生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域得到迅速發(fā)展[10-12]。 制備高質(zhì)量的基底是SERS技術(shù)應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的重要前提，常見的基底有金屬溶膠和固態(tài)基底兩大類。 剛性固態(tài)基底不易彎曲，且容易斷裂，當(dāng)目標(biāo)分子在不規(guī)則樣品表面時(shí)，不能與樣品完全接觸，使得它們難以有效地收集目標(biāo)分子。為克服這些缺點(diǎn)，柔性固態(tài)襯底成為新興的研究對(duì)象。

膠帶在日常生活中很常見，用途廣泛，在科學(xué)研究領(lǐng)域也有巨大的應(yīng)用潛力。 本文設(shè)計(jì)了一種膠帶襯底與金納米片（AuNTs）結(jié)合的柔性SERS基底，膠帶不僅具有彎曲易貼合的特點(diǎn)，同時(shí)其黏性可使其作為目標(biāo)分析物的提取工具，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)對(duì)實(shí)際樣品表面的農(nóng)藥進(jìn)行提取，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，而AuNTs 具有的銳利尖端，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的拉曼增強(qiáng)信號(hào)。 AuNTs/膠帶SERS 基底可以在沒有任何有機(jī)溶液的情況下實(shí)現(xiàn)完整的提取和檢測(cè)步驟，可用于食品安全中實(shí)際樣品分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（HAuCl4·3H2O）、 抗壞血酸（Ascorbic acid，AA）、碘化鉀（KI）、氫氧化鈉（NaOH），中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司（上海）；尼羅蘭A（Nile Blue A，NBA）、敵百蟲（Trichlorfon，TCF），阿拉丁化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)）；十六烷基三甲基氯化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium chloride，CTAC），Sigma-Aldrich 公司（美國(guó)）；單面膠帶（得力品牌），當(dāng)?shù)爻?；超純水?8.2 mΩ）由美國(guó)Millipore 凈水系統(tǒng)（Direct-Q3）制備生成。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-2100（200 kV）透射電子顯微鏡，日本電子公司（JEOL Ltd，日本）；UV-1800 紫外-可見光（UV-vis）分光光度計(jì)，日本島津公司；SU8100 冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)；LabRAM HR 800 共聚焦顯微拉曼光譜儀，法國(guó)HORIBA 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 AuNTs 的合成 根據(jù)Chen 等[13]的方法制備AuNTs，先在單口圓底燒瓶中加入8 mL 超純水和1.6 mL 0.1 mol/L CTAC，隨后依次加入75 μL 10 mmol/L KI，80 μL 25.4 mmol/L HAuCl4和20.3 μL 0.1 mol/L NaOH，溶液變成淺黃色。再加入80 μL 0.064 mol/L AA 溶液，溶液變成無(wú)色后，快速注入10 μL 0.1 mol/L NaOH，攪拌，溶液由無(wú)色變成紅色，紫色，藍(lán)色。 10 min 內(nèi)完成生長(zhǎng)過程。

1.3.2 AuNTs 滴加濃度的優(yōu)化 將合成的AuNTs溶液在8 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，去除上清，重懸。滴加3 μL 濃度為10-5mol/L 的NBA 于透明膠帶黏性面上，室溫干燥后滴加3 μL 不同濃縮倍數(shù)（2，4，6，8，10 倍）的AuNTs 溶液，室溫干燥，將膠帶黏性面朝下與包裹錫紙的載玻片貼合，并進(jìn)行拉曼測(cè)試。

共聚焦顯微拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，掃描范圍200～2 000 cm-1，物鏡放大倍數(shù)50×，掃描時(shí)間5 s，循環(huán)次數(shù)3 次，每個(gè)樣品上隨機(jī)選取10 個(gè)測(cè)試點(diǎn)。 通過重復(fù)試驗(yàn)3 次，獲取平均SERS 光譜。

1.3.3 AuNTs/膠帶SERS 基底的重現(xiàn)性和靈敏性表征 AuNTs/膠帶SERS 基底重現(xiàn)性評(píng)估： 將3 μL 濃度為10-5mol/L 的NBA 溶液滴到膠帶的黏性面上，室溫干燥，再滴加3 μL 濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，隨機(jī)選取10 個(gè)點(diǎn)，進(jìn)行拉曼測(cè)試。 重復(fù)3 次。

AuNTs/膠帶SERS 基底靈敏性評(píng)估： 將3 μL不同濃度（2×10-7，4×10-7，6×10-7，8×10-7，1×10-6，2×10-6，4×10-6，6×10-6，8×10-6，1×10-5mol/L） 的NBA溶液滴到膠帶黏性面上，室溫干燥，在斑點(diǎn)上滴加3 μL 濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，進(jìn)行拉曼測(cè)試。 重復(fù)3 次。

拉曼參數(shù)設(shè)定與1.3.2 節(jié)的方法相同。

1.3.4 對(duì)TCF 標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS 檢測(cè) 將10 μL不同 質(zhì)量 濃度（1，2，4，6，8，10，50，100，250，500，750 μg/mL） 的TCF 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴到膠帶黏性面上，干燥后，在斑點(diǎn)上滴加10 μL 質(zhì)量濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，進(jìn)行拉曼測(cè)試。 不滴加TCF的基底為空白樣品。

共聚焦顯微拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，掃描范圍300～1 600 cm-1，物鏡放大倍數(shù)50×，掃描時(shí)間20 s，循環(huán)次數(shù)1 次，每個(gè)樣品上隨機(jī)選取10 個(gè)測(cè)試點(diǎn)。 通過重復(fù)試驗(yàn)3 次，獲取平均SERS 光譜。

1.3.5 蘋果樣品表面TCF 的提取和檢測(cè) 將蘋果清洗干凈后削皮，把蘋果皮切成1×1 cm2的正方形，滴加10 μL 不同質(zhì)量濃度（1，2，4，6，8，10，50，100，250，500，750 μg/mL） 的TCF 溶液到果皮表面，干燥后，將膠帶粘貼到果皮上，按壓15 s 后輕輕剝離，在斑點(diǎn)上滴加10 μL 質(zhì)量濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，進(jìn)行拉曼測(cè)試。 與TCF直接滴到膠帶黏性面上得到的拉曼強(qiáng)度進(jìn)行比較，計(jì)算膠帶在水果表面對(duì)農(nóng)殘的提取效率。

拉曼參數(shù)設(shè)定與1.3.4 節(jié)相同。通過重復(fù)試驗(yàn)3 次，獲取平均SERS 光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)原理

圖1 是使用AuNTs/膠帶SERS 基底檢測(cè)實(shí)際樣品表面農(nóng)殘的流程示意圖。先通過粘貼的方式，用透明膠帶黏性面收集蘋果表面的目標(biāo)分析物后，再滴加AuNTs 到膠帶上用于增強(qiáng)拉曼信號(hào)，然后將膠帶黏性面朝下固定在包裹錫紙的玻璃片上，拉曼激光照射，收集拉曼信號(hào)對(duì)其進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)殘的定量檢測(cè)。

圖1 AuNTs/膠帶SERS 基底檢測(cè)TCF 的示意圖Fig.1 Schematic illustration of AuNTs/tape substrates for detecting TCF

2.2 AuNTs 的表征及滴加到膠帶基底上的濃度優(yōu)化

圖2 為AuNTs 的紫外-可見光譜圖和TEM圖，從圖2a 中可以看到，AuNTs 在641 nm 左右波長(zhǎng)處有一個(gè)特征峰。 圖2b 顯示AuNTs 呈大小均勻的三角形片狀，尺寸約為60 nm 左右，形貌規(guī)則，分散性良好。

圖2 AuNTs 的紫外-可見光譜圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig.2 The UV-vis spectrum （a） and the TEM image （b） of AuNTs

在膠帶黏性面上先滴加10-5mol/L 的NBA 溶液，室溫干燥后，再滴加不同濃縮倍數(shù)的AuNTs，將膠帶黏性面粘貼在包裹錫紙的載玻片上，拉曼激光從膠帶非黏性面進(jìn)入，到達(dá)金屬納米結(jié)構(gòu)。這種激光從膠帶非黏性面進(jìn)入的測(cè)試方法不會(huì)對(duì)基底上的金屬溶膠和目標(biāo)分析物造成破壞，而且入射和散射光很容易透過膠帶且不會(huì)消散，保證了基底的高靈敏度[14-15]。 圖3a 是NBA 在不同濃縮倍數(shù)的AuNTs 下的SERS 光譜圖，可以看到NBA 在600 cm-1處有一個(gè)明顯的特征峰，這是由NBA 中帶正電的氮原子產(chǎn)生的[16]。以AuNTs 的濃度（即濃縮倍數(shù)）作為橫坐標(biāo)，NBA 在600 cm-1處的峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，作折線圖，得到圖3b，隨著AuNTs 濃度的增大，NBA 在600 cm-1處的峰強(qiáng)度先持續(xù)增強(qiáng)，當(dāng)濃縮倍數(shù)達(dá)到8 倍后開始保持不變。 這是由于隨著納米顆粒數(shù)量逐漸增加，顆粒之間間距減小，“熱點(diǎn)”數(shù)量逐漸增加，拉曼信號(hào)增強(qiáng)，然而當(dāng)納米顆粒數(shù)量達(dá)到一定量時(shí)，“熱點(diǎn)”數(shù)量達(dá)到飽和，拉曼信號(hào)便不會(huì)再增加，因此使用AuNTs 濃縮8 倍時(shí)的濃度作為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 膠帶基底上不同濃度的AuNTs 對(duì)NBA 增強(qiáng)的SERS 圖譜（a）； NBA 在600 cm-1 處峰強(qiáng)度隨AuNTs濃度的變化（b）；空白膠帶的SEM 電鏡圖（c）；滴加了AuNTs 的膠帶的SEM 電鏡圖（d）Fig.3 SERS spectra of NBA with different concentration of AuNTs （a）； the relationship between the SERS intensity at 600 cm-1 of NBA and concentration of AuNTs （b）； SEM image of blank tape （c）； SEM image of tape with AuNTs （d）

膠帶黏性面的主要化學(xué)組成是丙烯酸酯粘合劑，當(dāng)AuNTs 溶液滴加到黏性面時(shí)，由于水的存在，丙烯酸酯粘合劑變得可溶脹，水分蒸發(fā)后導(dǎo)致丙烯酸酯粘合劑消溶脹。 這種溶脹和消溶脹作用使得納米材料半嵌入聚集在膠帶上[17]，通過圖3c和圖3d 可以看到，空白膠帶表面光滑平整，而滴加了AuNTs 后的膠帶表面形成了粗糙的“丘陵地形”結(jié)構(gòu)，表明AuNTs 已經(jīng)嵌入到膠帶黏性層中，這一性質(zhì)使得納米材料在檢測(cè)過程中不會(huì)發(fā)生損失，并且目標(biāo)分析物在被膠帶粘貼提取之后，能與納米材料直接接觸，使得SERS 信號(hào)增強(qiáng)。

2.3 AuNTs/膠帶SERS 基底的性能研究

重現(xiàn)性、 穩(wěn)定性和靈敏性是考察SERS 基底活性的基本指標(biāo)，由于AuNTs/膠帶SERS 基底應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)時(shí)，是用膠帶現(xiàn)場(chǎng)采樣后立即進(jìn)行拉曼測(cè)試，故而不考察基底的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

為了評(píng)價(jià)AuNTs/膠帶SERS 基底的重現(xiàn)性，制備了3 條不同的膠帶基底，并在每條膠帶基底上隨機(jī)選取10 個(gè)點(diǎn)，共30 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行拉曼測(cè)試，如圖4a 所示，30 個(gè)來(lái)自不同膠帶基底上NBA 的光譜圖特征峰一致，隨后對(duì)NBA 在600 cm-1處的特征峰強(qiáng)度進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)，得到圖4b，RSD 值為9.39%，表面膠帶基底的拉曼增強(qiáng)信號(hào)具有良好的重現(xiàn)性。

圖4 3 條不同批次AuNTs/膠帶基底上任意30 個(gè)點(diǎn)NBA 的SERS 圖譜（a）及其在600 cm-1 處強(qiáng)度的分布圖（b）Fig.4 SERS spectra of NBA acquired from 30 sites of three batches of AuNTs/tape substrates （a）and the corresponding intensity distribution at 600 cm-1 of NBA （b）

為了評(píng)價(jià)AuNTs/膠帶SERS 基底的靈敏性，將不同濃度的NBA 溶液直接滴在膠帶上進(jìn)行拉曼測(cè)試。 圖5a 為濃度在2×10-7～1×10-5mol/L 范圍內(nèi)的NBA 的拉曼光譜圖，隨著NBA 濃度升高，它在600 cm-1處的特征峰強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，當(dāng)NBA濃度低至2×10-7mol/L 時(shí)，仍可以觀察到明顯的特征峰。 以NBA 濃度為橫坐標(biāo)，NBA 在600 cm-1處的特征峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)進(jìn)行擬合，在整個(gè)濃度范圍內(nèi)呈吸附-飽和的非線性關(guān)系（圖5b），當(dāng)NBA濃度在2×10-7～1×10-6mol/L 范圍內(nèi)，NBA 在600 cm-1處的特征峰強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系（圖5c），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是：y=2.673×1010x-4772.665，R2=0.9824。 結(jié)果表明AuNTs/膠帶SERS 基底具有較好的靈敏性。

圖5 AuNTs/膠帶基底上不同濃度NBA 的SERS 光譜圖（a）； NBA 濃度與其在600 cm-1 處SERS 強(qiáng)度的關(guān)系（b）；NBA 在低濃度時(shí)與其在600 cm-1 處SERS 強(qiáng)度之間的線性關(guān)系（c）Fig.5 SERS spectra of NBA with different concentrations on AuNTs/tape substrates （a）； relationship between concentration and SERS intensity at 600 cm-1 of NBA （b）； linear relationship between low concentration and SERS intensity at 600 cm-1 of NBA （c）

2.4 AuNTs/膠帶基底對(duì)TCF 的SERS 檢測(cè)

將AuNTs/膠帶SERS 基底用于實(shí)際農(nóng)藥TCF的檢測(cè)，相較于信標(biāo)分子NBA，共聚焦拉曼光譜儀對(duì)TCF 的積分時(shí)間增加到了20 s，目的是增強(qiáng)TCF 的信號(hào)強(qiáng)度。 用膠帶黏性面覆蓋滴有農(nóng)殘的實(shí)際樣品表面，在一定壓力下按壓15 s，揭起后在農(nóng)殘斑點(diǎn)上滴加AuNTs，隨后將膠帶基底黏性面與包裹錫紙的載玻片貼合，拉曼激光從膠帶非黏性面進(jìn)入。

膠帶的柔軟性在SERS 檢測(cè)中具有極大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，它可以作為采樣工具用于提取樣品表面的待測(cè)物質(zhì)，省去了一系列復(fù)雜的樣品前處理過程，因此膠帶的提取效率至關(guān)重要。 將TCF 滴涂在蘋果表面再用膠帶粘貼后測(cè)得的拉曼信號(hào)（757 cm-1） 與TCF 直接滴涂在膠帶上測(cè)得的拉曼信號(hào)（757 cm-1）進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)膠帶對(duì)實(shí)際樣品表面不同質(zhì)量濃度TCF 的提取效率，得到表1，平均提取效率為50.9%，與之前報(bào)道過的膠帶在果皮表面的提取率相似[18]。

表1 膠帶在實(shí)際樣品（蘋果）表面的提取效率Table 1 Extraction efficiency of tape on actual sample （apple）

圖6a 是TCF 直接滴在膠帶上的光譜圖，圖6d 是TCF 滴在蘋果皮表面上用膠帶粘貼提取后進(jìn)行測(cè)試的拉曼光譜圖，可以看到TCF 在434，757，1 262，1 443 cm-1處均有明顯的特征峰，434 cm-1對(duì)應(yīng)C-Cl 的拉伸模式和P=O-C 的彎曲模式，757 cm-1對(duì)應(yīng)C-Cl 的拉伸模式和C-C-P 的彎曲模式，1 262 cm-1對(duì)應(yīng)CH 和OH 的彎曲模式，1 443 cm-1對(duì)應(yīng)CH3的彎曲模式[19-20]。 以TCF 質(zhì)量濃度（1～750 μg/mL）為橫坐標(biāo)，TCF 在757 cm-1處的特征峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，分別對(duì)兩種情況進(jìn)行擬合，進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖6b，6c，6e，6f 所示，在低質(zhì)量濃度（1～10 μg/mL）范圍內(nèi)，TCF 在757 cm-1處的特征峰強(qiáng)度與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系（圖6c），直接滴到膠帶上的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=226.370x+193.861，R2=0.9960。

圖6 TCF 直接滴在膠帶上時(shí)SERS 光譜圖（a）；TCF 質(zhì)量濃度與其在757 cm-1 處峰強(qiáng)度之間的關(guān)系（b）；低質(zhì)量濃度（1～10 μg/mL）時(shí)與其在757 cm-1 處峰強(qiáng)度的線性關(guān)系（c）；用膠帶從樣品表面進(jìn)行粘貼提取時(shí)SERS 光譜圖（d）；TCF 質(zhì)量濃度與其在757 cm-1 處峰強(qiáng)度之間的關(guān)系（e）；低質(zhì)量濃度（1～10 μg/mL）時(shí)與其在757 cm-1 處峰強(qiáng)度的線性關(guān)系（f）Fig.6 SERS spectra （a）； relationship between concentration and SERS intensity at 757 cm-1 （b）； linear relationship between low mass concentration （1～10 μg/mL） and SERS intensity at 757 cm-1 of TCF with dropping directly on the tape（c）； SERS spectra （d）； relationship between mass concentration and SERS intensity at 757 cm-1（e）； linear relationship between low mass concentration （1～10μg/mL） and SERS intensity at 757 cm-1 of TCF after extracting from actual sample （f）

根據(jù)公式計(jì)算LOD 為0.781 μg/mL （假設(shè)一個(gè)蘋果的體積大約是200 g，面積為180 cm2，根據(jù)滴加到膠帶上TCF 的體積10 μL 和形成圓形斑點(diǎn)的直徑5 mm，換算成國(guó)標(biāo)單位即為0.0358 mg/kg），這一值低于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)水果中TCF 最大殘留限量的規(guī)定 （0.2 mg/kg，GB 2763-2016），并與已報(bào)道的方法相比較[21-26]（表2），該方法有較好的檢測(cè)性能，并能夠?qū)崿F(xiàn)快速定量檢測(cè)。用膠帶粘貼后的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為（圖6f）：y=115.273x+88.654，R2=0.9940。以上結(jié)果表明，該AuNTs/膠帶SERS 基底可以作為一種原位取樣和快速檢測(cè)的材料，在農(nóng)殘現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用潛力。

表2 不同方法檢測(cè)TCF 的匯總Table 2 Summary of different methods for detecting TCF

3 結(jié)論

本研究使用膠帶作為襯底，通過將AuNTs 滴加到膠帶上來(lái)制備一種柔性AuNTs/膠帶SERS 基底，由于膠帶具有黏性，它不僅可以作為基底的襯底，還可以作為有效提取目標(biāo)分析物的工具。 以NBA 作為拉曼信號(hào)分子對(duì)AuNTs/膠帶SERS 基底的重現(xiàn)性和靈敏性進(jìn)行表征，對(duì)NBA 的檢測(cè)濃度低至2×10-7mol/L。 使用AuNTs/膠帶SERS 基底對(duì)TCF 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試，在1～10 μg/mL 范圍內(nèi)，TCF 質(zhì)量濃度與其特征峰強(qiáng)度呈線性關(guān)系，LOD 可達(dá)0.781 μg/mL。使用該基底對(duì)實(shí)際樣品表面TCF 進(jìn)行提取測(cè)定，提取效率為50.9%。整個(gè)分析過程簡(jiǎn)單、 無(wú)損，樣品易于制備并且響應(yīng)速度快。