基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學探究西黃丸治療肝癌作用機制

馮文敏，吳鎧悅，黃月萍，劉亞茹，趙洪波，刁勇，朱亞玲

1.華僑大學醫(yī)學院，福建 泉州 362021；2.昆明醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程研究中心，云南 昆明 650500

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增趨勢，嚴重威脅人類生命健康。肝癌發(fā)病隱匿，早期診斷率低，多數(shù)患者確診時已為中晚期，錯過了最佳治療時機，導致患者預后較差[1]。因此，迫切需要可有效延長肝癌患者生存期的治療手段和藥物。

西黃丸是中醫(yī)抗癌名方，由牛黃、麝香、乳香和沒藥4味中藥組成，有清熱解毒、消腫散結(jié)功效，用于熱毒壅結(jié)所致癰疽疔毒、瘰疬、癌腫等疾病[2]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，西黃丸對肝癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥有一定療效，具有誘導癌細胞凋亡、抑制細胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境等作用[3-5]，但其治療肝癌的分子機制尚不完全明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，從整體角度探索藥物-生物系統(tǒng)-疾病之間復雜作用關(guān)系，形成藥物分子設(shè)計新模式，是發(fā)展創(chuàng)新藥物的重要途徑[6]。近年來，雖然已經(jīng)利用基因芯片及高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些與肝癌相關(guān)的重要基因，但其在肝癌發(fā)生發(fā)展及治療中的作用仍需深入研究。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學、生物信息學及分子對接方法，對西黃丸治療肝癌的潛在活性成分及預后相關(guān)靶點進行分析，為闡明西黃丸治療肝癌的作用機制及開發(fā)治療肝癌的新型藥物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 西黃丸活性成分篩選

利用TCMSP（https://tcmsp-e.com/）[7]、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫（www.organchem.csdb.cn）[8]檢索西黃丸中牛黃、麝香、乳香、沒藥4味中藥的化學成分，通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[9]數(shù)據(jù)庫獲取化合物的SMILES分子結(jié)構(gòu)，將分子結(jié)構(gòu)導入SwissADME（http://www.swissadme.ch）[10]數(shù)據(jù)庫預測化合物的吸收度和類藥性，篩選胃腸（GI）吸收為“High”、5 個類藥性參數(shù)（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）預測結(jié)果中有3個及以上為“Yes”的化合物，作為活性成分。

1.2 活性成分靶點預測

將活性成分導入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）[11]數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，依據(jù)反向藥效團匹配方法預測活性成分的作用靶點，收集靶點蛋白信息。隨后利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）[12]對靶點蛋白名稱進行統(tǒng)一校正，并獲取靶點蛋白對應(yīng)的靶點基因。

1.3 差異表達靶點基因篩選

利用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）[13]數(shù)據(jù)庫分析靶點基因在肝癌組織和正常組織的表達水平，Matched Normal data 設(shè) 為“Match TCGA normal data”，其余為默認。將在肝癌組織和正常組織表達有顯著差異，即|log2FC|＞1，P＜0.01的靶點基因作為差異表達靶點基因。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

將差異表達靶點基因?qū)隓AVID（https://david.ncifcrf.gov）[14]數(shù)據(jù)庫，以FDR＜0.05為顯著富集標準，進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.3”項下差異表達靶點基因?qū)?yīng)的蛋白導入STRING（https://cn.string-db.org/）[15]數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，置信度為0.4，構(gòu)建靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，將PPI 網(wǎng)絡(luò)用Cytoscape3.9.0 軟件[16]進行可視化，節(jié)點顏色代表靶點差異表達水平。借助NetworkAnalyzer插件進行拓撲分析，篩選接近中心性（CC）、中介中心性（BC）和度值（degree）均大于平均值的靶點作為關(guān)鍵靶點。將關(guān)鍵靶點基因與KEGG顯著富集通路中對應(yīng)的靶點基因取交集，得到核心靶點基因。

1.6 核心靶點基因生存分析

Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）[17]可評估基因表達對多種腫瘤預后的影響，用于發(fā)現(xiàn)和驗證與腫瘤預后相關(guān)的生物標志物。根據(jù)核心靶點基因表達中位數(shù)，將數(shù)據(jù)庫中364例肝癌患者分為高表達組和低表達組，計算危險比（hazard radio，HR）及95%置信區(qū)間（CI），差異比較用logrankP檢驗，logrankP＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，分析核心靶點基因與肝癌患者預后的相關(guān)性，得到預后相關(guān)核心靶點。

1.7 中藥-活性成分-預后相關(guān)核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Excel2013中構(gòu)建“中藥-活性成分”“活性成分-預后相關(guān)核心靶點”“預后相關(guān)核心靶點-信號通路”的對應(yīng)關(guān)系，并將其導入Cytoscape3.9.0軟件，構(gòu)建并分析西黃丸治療肝癌的中藥-活性成分-預后相關(guān)核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中不同顏色節(jié)點表示中藥、活性成分、預后相關(guān)核心靶點和通路，節(jié)點間連線表示關(guān)聯(lián)關(guān)系。

1.8 分子對接

從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取西黃丸活性成分3D結(jié)構(gòu)作為對接配體。從RCSB PDB（http://www.rcsb.org）[18]數(shù)據(jù)庫下載預后相關(guān)核心靶點3D結(jié)構(gòu)，作為對接受體。將對接配體和對接受體文件上傳至CB-Dock（http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/）[19]分子對接工具，受體設(shè)為剛性分子，配體設(shè)為柔性分子，通過MGLTools工具對受體進行移除小分子、水分子和加氫等操作，對配體進行加氫、加電子等操作使其能量最小化，將其轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式文件，應(yīng)用AutoDock Vina1.1.2進行分子對接，以結(jié)合能大小判斷受體與配體結(jié)合力強弱。

2 結(jié)果

2.1 西黃丸活性成分及作用靶點獲取

通過TCMSP和化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫共檢索到西黃丸中化學成分385個，根據(jù)吸收度和類藥性等參數(shù)篩選出活性成分194個，其中牛黃18個、麝香36個、乳香72個、沒藥79個。經(jīng)SwissTargetPrediction預測活性成分作用靶點，去除重復后，共得到873個作用靶點。靶點數(shù)量排名前10位的活性成分見表1。

表1 西黃丸活性成分信息（靶點數(shù)量前10位）

2.2 差異表達靶點基因獲取

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析873個靶點基因在肝癌組織和正常組織的表達水平，共得到有顯著差異的靶點基因147個，其中89個上調(diào)靶點基因、58個下調(diào)靶點基因。

2.3 GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果

GO功能富集分析得到生物過程（BP）19個、細胞組分（CC）13個、分子功能（MF）16個，上調(diào)靶點和下調(diào)靶點的富集結(jié)果中排名前5位條目見圖1。上調(diào)靶點主要富集于蛋白質(zhì)磷酸化、細胞分裂、G2/M有絲分裂細胞周期轉(zhuǎn)變、凋亡過程的負調(diào)控等生物過程，分布于胞液、核質(zhì)、細胞膜等細胞組分，涉及蛋白激酶活性、ATP結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子功能；下調(diào)靶點主要富集于藥物代謝過程、環(huán)氧化酶P450通路、類固醇代謝過程、氧化還原過程等生物過程，分布于細胞器膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、外泌體等細胞組分，涉及氧結(jié)合、氧化還原酶活性、類固醇羥化酶活性等分子功能。

圖1 西黃丸治療肝癌靶點GO功能富集分析

KEGG通路富集分析得到9條信號通路，其中上調(diào)靶點參與調(diào)控細胞周期、孕酮介導的卵母細胞成熟、卵母細胞減數(shù)分裂3條信號通路；下調(diào)靶點主要參與細胞色素P450對外源性藥物代謝、化學致癌作用、視黃醇代謝、代謝途徑等6條信號通路。見圖2。

圖2 西黃丸治療肝癌靶點KEGG通路富集分析

2.4 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點獲取

通過STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape3.9.0軟件構(gòu)建靶點PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3），網(wǎng)絡(luò)中包含144個節(jié)點和833條邊，degree值越大，節(jié)點越大。拓撲分析得到BC、CC和degree均大于平均值即0.407、0.011和12的節(jié)點26個，將其作為關(guān)鍵靶點。關(guān)鍵靶點信息見表2。

表2 西黃丸治療肝癌關(guān)鍵靶點信息

圖3 西黃丸治療肝癌靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的26個關(guān)鍵靶點基因與9條KEGG顯著性富集通路中對應(yīng)的靶點基因取交集，得到14個核心靶點基因，包括MAPK3、CDK1、PLK1、CCNA2等10 個表達上調(diào)靶點基因及UGT2B7、CYP2B6、CYP1A1、CYP2C19共4個表達下調(diào)靶點基因。

2.5 預后相關(guān)核心靶點獲取

利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫評估14個核心靶點基因在肝癌患者中的預后價值，總生存期分析結(jié)果顯示，MAPK3、CDK1、PLK1、CCNA2、CCNB1、CDK4、PRKDC 7個基因高表達與肝癌患者較差的總生存期相關(guān)（logrankP＜0.05）；CYP2C19基因高表達與肝癌患者較長的總生存期相關(guān)（logrankP＜0.05），表明上述8個基因與肝癌患者預后密切相關(guān)。見圖4。

圖4 西黃丸治療肝癌核心靶點基因生存分析

2.6 中藥-活性成分-預后相關(guān)核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape3.9.0軟件構(gòu)建中藥-活性成分-預后相關(guān)核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)，見圖5。該網(wǎng)絡(luò)包含86個節(jié)點（4個中藥、68個活性成分、8個預后相關(guān)核心靶點、6條信號通路）和201條邊，68個活性成分中27個來自乳香、34個來自沒藥、4個來自麝香、4個來自牛黃，其中erlangerin B、[(5R,5Ar,8aS)-6-氧代-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氫-[2]苯并呋喃[6,5-f][1,3]苯并二氧醇-5a-基]醋酸鹽（CID11004967）、洋椿苦素（cedrelone）、桑色素（morin）、辛酸丁酯（butyl octanoate）分別作用于7、5、4、3、3個預后相關(guān)核心靶點。MAPK3、CYP2C19、CDK1等靶點對應(yīng)活性成分數(shù)量較多，分別為36、27、23個。

圖5 西黃丸治療肝癌中藥-活性成分-預后相關(guān)核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對接結(jié)果

結(jié)合能＜0 kJ/mol表明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，一般認為，配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，結(jié)合力越強[20-21]。將中藥-活性成分-預后相關(guān)核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中靶點數(shù)排名前5位的活性成分與8個預后相關(guān)核心靶點進行分子對接，以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol為篩選標準，結(jié)果顯示，對接結(jié)合能＞-5.0 kJ/mol的有1個，＜-5.0 kJ/mol有39個，表明活性成分與預后相關(guān)核心靶點間均具有較強的結(jié)合力，見圖6。其中cedrelone 與CYP2C19 的結(jié)合能最低，cedrelone可結(jié)合到CYP2C19蛋白的活性位點，并與氨基酸殘基A297 形成氫鍵作用，與殘基L366、F476、F114等形成疏水作用，見圖7。

圖6 主要活性成分與預后相關(guān)核心靶點分子對接熱圖

圖7 cedrelone與CYP2C19分子對接模式

3 討論

西黃丸中牛黃清心退熱、化痰通竅、散結(jié)消腫，為君藥；臣以麝香通經(jīng)絡(luò)、散結(jié)滯、辟惡毒、除穢濁；佐以乳香、沒藥活血祛瘀。諸藥配伍有清熱解毒、活血祛瘀、消堅腫、散痰結(jié)等功效[22]，在肝癌治療中應(yīng)用廣泛。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學方法篩選得到194個西黃丸活性成分及873個作用靶點，其中147個靶點基因在肝癌組織與正常組織表達有顯著差異。經(jīng)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生存分析得到MAPK3、CDK1、PLK1、CCNA2、CCNB1、CDK4、PRKDC、CYP2C19共8個與肝癌患者預后密切相關(guān)的核心靶點。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是MAPK/ERK信號通路中的關(guān)鍵蛋白，該通路及下游轉(zhuǎn)錄因子參與細胞增殖、凋亡、周期調(diào)控、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等生物過程[23]。MAPK3磷酸化后可調(diào)控細胞增殖和凋亡相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-Jun等，促進肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，且MAPK3磷酸化水平高的肝癌患者復發(fā)率明顯增加，預后較差[24]。周期蛋白依賴性激酶（CDK）1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271-5p可通過靶向抑制CDK1表達，從而阻滯細胞周期，抑制肝癌細胞增殖，增強肝癌細胞對放療的敏感性，發(fā)揮治療肝癌的輔助作用[25]。Polo 樣激酶（PLK）1是細胞有絲分裂的重要調(diào)節(jié)因子，其過表達可使多聚二磷酸腺苷酸核糖聚合酶（PARP）10磷酸化，破壞PARP10對NEMO信號泛素化的抑制，從而增強核因子-κB對多個靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進肝癌進展[26]。CCNA2 和CCNB1 是細胞周期蛋白家族成員，可通過激活CDK激酶調(diào)控細胞周期，從而調(diào)控細胞增殖、生長和凋亡。有研究表明，CCNA2和CCNB1高表達與肝癌患者總生存期和無病生存期降低相關(guān)[27]。CDK4/cyclin D 復合物可調(diào)控細胞周期G1/S 的轉(zhuǎn)換，SOCS1可通過降低肝癌細胞核CDK4/cyclin D復合物的穩(wěn)定性，從而抑制細胞周期進展到S期[28]。PRKDC基因編碼的DNA依賴蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）是DNA雙鏈斷裂修復和重組的關(guān)鍵組成部分，在維持基因組穩(wěn)定方面發(fā)揮作用[29]。CYP2C19是重要的藥物代謝酶，在許多藥物、內(nèi)源性生物分子和環(huán)境毒物的激活或消除中發(fā)揮關(guān)鍵作用，CYP2C19異常表達與臨床藥物療效差或治療失敗有關(guān)[30]。

GO功能及KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，西黃丸治療肝癌的上調(diào)靶點主要通過參與蛋白質(zhì)磷酸化、細胞分裂、G2/M有絲分裂細胞周期轉(zhuǎn)變等生物過程，調(diào)控細胞周期及細胞凋亡等信號通路，發(fā)揮治療肝癌的作用。研究表明，細胞周期失調(diào)可介導細胞轉(zhuǎn)化和細胞生長失控，從而導致腫瘤細胞無限增殖[31]。因此，靶向作用于細胞周期調(diào)控因子可作為治療肝癌的潛在策略。下調(diào)靶點涉及藥物代謝過程、環(huán)氧化酶P450通路、類固醇代謝過程等生物過程，與細胞色素P450對外源性藥物代謝、化學致癌作用、視黃醇代謝等信號通路相關(guān)。肝臟是參與蛋白質(zhì)合成、脂肪代謝、糖代謝、藥物和毒物代謝，發(fā)揮吞噬和免疫功能的重要器官，肝臟代謝異常是肝癌發(fā)病的基礎(chǔ)。肝癌細胞可通過改變脂質(zhì)代謝、增強糖酵解和脂肪酸β-氧化等途徑增加能量供應(yīng)，從而促進肝癌細胞增殖或減少肝癌細胞凋亡[32]。因此，探索西黃丸調(diào)節(jié)肝臟異常代謝的機制具有重要的臨床意義。

中藥-活性成分-預后相關(guān)核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)及分子對接分析發(fā)現(xiàn)，erlangerin B、CID11004967、洋椿苦素、桑色素等活性成分與肝癌預后相關(guān)核心靶點具有較強的結(jié)合力，說明活性成分在西黃丸治療肝癌過程中可能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，erlangerin B對巨噬細胞具有一定的細胞毒性，且能抑制多種腫瘤細胞增殖[33]。洋椿苦素可通過上調(diào)肝癌患者體內(nèi)吩嗪合成類結(jié)構(gòu)域蛋白水平，介導Ras/Rap1信號通路，表現(xiàn)出顯著的抗肝癌作用[34]。桑色素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗腫瘤、抗高血壓、抗菌、降尿酸和神經(jīng)保護作用[35]。有研究報道，桑色素對肝癌、宮頸癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等多種癌癥具有藥理作用[36]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學、生物信息學及分子對接方法，探討西黃丸治療肝癌的藥理作用機制， 發(fā)現(xiàn)西黃丸中活性成分erlangerin B、CID11004967、洋椿苦素、桑色素等通過作用于MAPK3、CDK1、PLK1等肝癌預后相關(guān)靶點調(diào)節(jié)多條信號通路，從而發(fā)揮治療肝癌及延長肝癌患者生存期的作用，可為后續(xù)研究提供新的思路。