酸響應(yīng)性槲皮素聚合物前藥的制備與表征*

張 韞，周蓉蓉，王致雅，李 婷

（西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021）

1975年Helmut Ringsdorf教授提出了聚合物前藥（Polymeric Prodrugs）[1]，即通過(guò)可刺激響應(yīng)性化學(xué)鍵將藥物分子進(jìn)行分散、鍵合或吸附制成納米材料。通過(guò)引入可逆性化學(xué)鍵，在pH值、溫度、還原性物質(zhì)等因素的刺激下，聚合物前藥可對(duì)腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境或外界刺激產(chǎn)生響應(yīng)[2]。相較于傳統(tǒng)的小分子藥物，其具有如下優(yōu)勢(shì)[1]：降低藥物毒副作用，改善藥物溶解性，增加生物利用度，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，通過(guò)腫瘤的高通透性和滯留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向等。目前，聚合物前藥的功能化設(shè)計(jì)與合成已成為藥劑學(xué)、高分子化學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)課題。

槲皮素（Quercetin）是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等多種藥理活性[3]，對(duì)多種惡性腫瘤具有明顯抑制作用[4]。但由于槲皮素含有酚羥基而具有弱酸性[5]，難溶于水，光熱穩(wěn)定性和生物利用度欠佳。槲皮素半衰期短，腸道首過(guò)效應(yīng)（First Pass Effect）顯著，以原藥入血液循環(huán)的比例小于5%[6]，臨床應(yīng)用受到極大限制。研究表明，槲皮素納米制劑對(duì)改善槲皮素水溶性、提高生物利用度等起到積極的作用。孫麗等[7]利用陰離子乳液制備以聚氰基丙烯酸正丁酯為載體的槲皮素納米粒子，楊小云等[8]以三嵌段兩親共聚物為載體制備的槲皮素納米膠束，均可延長(zhǎng)藥物體內(nèi)作用時(shí)效，增加溶解度，提升藥物療效。

點(diǎn)擊反應(yīng)作為藥物遞送和生物醫(yī)用材料合成中最有效的合成方法之一，具有簡(jiǎn)單、高效、快速、產(chǎn)物易分離等優(yōu)勢(shì)。Ni Peihong等[9]制備了一種酸響應(yīng)聚合物前藥，該物質(zhì)是一種炔基封端小分子，通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)將其鍵合到聚乙二醇側(cè)鏈，并與阿霉素反應(yīng)形成含pH敏感基團(tuán)的聚合物前藥。在酸性條件下發(fā)生pH響應(yīng)性化學(xué)鍵斷裂，實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤細(xì)胞的高效遞送。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成具有雙官能團(tuán)的丁烷-1，4二丙炔酸二酯，并將其與槲皮素直接發(fā)生聚合反應(yīng)，制備具有主鏈結(jié)構(gòu)的聚合物前藥納米遞送系統(tǒng)。通過(guò)引入pH刺激響應(yīng)性化學(xué)鍵實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的控制釋放，并采用紫外光譜和熒光光譜、粒徑分布和透射電鏡對(duì)納米材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)及形貌表征，獲得聚合物前藥的可控性制備工藝。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)提升常規(guī)藥物療效，促進(jìn)納米遞藥系統(tǒng)的深入研究和應(yīng)用提供了新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；F-4500型熒光分光光度計(jì)（日本日立株式會(huì)社）；JEM-F200型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；ZS90型納米粒度電位儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；400 Plus型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司），VION IMSQTOF型高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世科技有限公司）；BSA224-CW型電子天平（德國(guó)賽多利斯有限公司）；SB-5200DT/200W型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

槲皮素（95%）、1，4-丁二醇（98%）、丙炔酸（95%）、氘代氯仿（99.8%）、對(duì)甲苯磺酸（98%），上海阿拉丁試劑有限公司；乙腈、乙醇、NaHCO3、三氯甲烷、乙酸乙酯，均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水MgSO4、NaCl、NH4HCO3等，均為分析純，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2MΩ·cm）。

1.2 聚合物前藥的制備

1.2.1 丁烷-1,4-二丙炔酸二酯的合成與表征 精密稱取1,4-丁二醇4.3g和丙炔酸13.5g，對(duì)甲苯磺酸（TsOH）18.2g溶于100mL三氯甲烷（CHCl3）中，于圓底燒瓶中加熱回流約18h。冷卻后用飽和NaHCO3溶液、水、飽和NaCl溶液分別洗滌3次，并用無(wú)水MgSO4干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗產(chǎn)物用正己烷/乙酸乙酯重結(jié)晶，得到淡黃色的晶狀固體產(chǎn)物[10]。合成的反應(yīng)式見(jiàn)圖1。取適量產(chǎn)物于核磁管中，用氘代氯仿（CDCl3）溶解，采用核磁共振波譜儀測(cè)定該物質(zhì)中氫原子的化學(xué)位移。采用高分辨質(zhì)譜儀（ESIMS）精確測(cè)定其分子量。

圖1 丁烷-1,4-二丙炔酸二酯的合成反應(yīng)式Fig.1 Resynthesis of butane-1,4-diyl dipropiolate diester

1.2.2 丁烷-1，4-二丙炔酸二酯-槲皮素聚合物前藥的制備 精密稱取2.8mg丁烷-1,4-二丙炔酸二酯溶于0.2mL無(wú)水乙醇，2.9mg槲皮素溶于0.4mL無(wú)水乙醇，15.0mg NaHCO3溶于4.0mL超純水。取20mL 30%乙醇溶液（v/v）于100mL錐形瓶中，緩慢滴加丁烷-1,4-二丙炔酸二酯溶液，超聲約3min后滴加槲皮素溶液，反應(yīng)約30min（超聲功率為200W，水浴溫度為40～45℃），靜置約72h至反應(yīng)體系渾濁后離心，棄上清液，所得產(chǎn)物用無(wú)水乙醇和超純水分別洗滌，最后將所制材料均勻分散在超純水中，即得產(chǎn)物聚合物前藥（BQ）的納米混懸劑，避光保存。

1.3 聚合物前藥的結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 紫外光譜表征 使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)樣品的紫外吸收進(jìn)行定性測(cè)試分析。聚合物前藥（BQ）的納米混懸劑超聲分散均勻，于200～700nm進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2 熒光光譜 采用熒光分光光度計(jì)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬分別為10nm和20nm，掃速速率1200nm·min-1，掃描聚合物前藥（BQ）的納米混懸劑在450～700nm的熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度（F）的變化。

1.4 聚合物前藥的形貌表征

1.4.1 粒徑分布 取BQ的納米混懸劑少許加超純水稀釋至適宜濃度，超聲使其分散均勻，采用激光粒度儀，在25°C條件下以水為分散介質(zhì)測(cè)定粒徑分布和多分散系數(shù)（PDI）。

1.4.2 透射電鏡 取BQ的納米混懸劑少許，超聲將樣品分散均勻后滴于200目普通碳支持膜，待自然干燥后在透射電鏡下觀察形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁烷-1，4-二丙炔酸二酯的表征

核磁共振氫譜表征1H NMR（CDCl3;δ（ppm））：1.81（m,4H）,2.92（s,2H）,4.25（m,4H）。4.25ppm為靠近氧的4個(gè)氫的信號(hào)峰，2.92ppm為兩個(gè)炔基氫的信號(hào)峰，1.81ppm為中間4個(gè)氫的信號(hào)峰。

高分辨質(zhì)譜表征 丁烷-1,4-二丙炔酸二酯的相對(duì)分子質(zhì)量理論值為194.18600，高分辨質(zhì)譜（ESI-MS）的（M+H）模式檢測(cè)m/z為195.06456，證明該化合物為丁烷-1,4-二丙炔酸二酯。

2.2 聚合物前藥的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紫外光譜表征 聚合物前藥（BQ）和槲皮素（QUE）的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，見(jiàn)圖2。

圖2 聚合物前藥的紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectra of the polymeric prodrug

由圖2可見(jiàn)，槲皮素的最大吸收峰出現(xiàn)在260nm和381nm左右，由于丁烷-1,4-二丙炔酸二酯自身沒(méi)有紫外吸收，與槲皮素鍵合生成BQ后槲皮素的特征吸收峰藍(lán)移約10nm。故推斷丁烷-1,4-二丙炔酸二酯與槲皮素發(fā)生了聚合反應(yīng)。

2.2.2 熒光光譜表征（圖3）

圖3 聚合物前藥的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of the polymeric prodrug

由圖3可見(jiàn)，槲皮素（QUE）的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)為536nm，聚合物前藥（BQ）熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)為496nm，較槲皮素藍(lán)移約40nm且峰頂平緩，峰形也有所變化。這可能是因?yàn)殚纹に嘏c丙炔酸酯結(jié)合后結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，酚羥基變少導(dǎo)致特征峰移動(dòng)。故推斷丁烷-1,4-二丙炔酸二酯已與槲皮素發(fā)生了聚合反應(yīng)。

2.3 聚合物前藥的形貌表征

圖4 聚合物前藥的粒徑分布圖Fig.4 Particle size distribution of the polymeric prodrug

2.3.1 粒徑分布（圖4）由圖4可知，在動(dòng)態(tài)光散射下由激光粒度儀測(cè)得聚合物前藥BQ的平均水合直徑為274.7nm；多分散指數(shù)PDI為0.242，當(dāng)PDI＜0.3時(shí)，說(shuō)明納米粒子分散度較好。

2.3.2 透射電鏡表征（圖5）

圖5 聚合物前藥納米粒子的透射電鏡圖Fig.5 TEM image of the polymeric prodrug

由圖5可見(jiàn)，BQ是粒徑為100～200nm的球形納米粒子，輪廓清晰，分散均勻，這與納米粒子較低的多分散系數(shù)具有相關(guān)性，聚合物前藥粒徑大小符合EPR效應(yīng)要求，具備進(jìn)入實(shí)體腫瘤細(xì)胞的條件。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于點(diǎn)擊反應(yīng)，將合成的雙官能團(tuán)丁烷-1,4-二丙炔酸二酯與槲皮素分子共聚，生成具有主鏈結(jié)構(gòu)的新型納米遞送藥系統(tǒng)；引入腫瘤微環(huán)境pH響應(yīng)性化學(xué)鍵，可實(shí)現(xiàn)藥物的智能化控制釋放。采用紫外和熒光光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，激光粒度儀和透射電鏡進(jìn)行形貌表征，得到聚合物前藥的可控性制備工藝。結(jié)果表明，基于點(diǎn)擊反應(yīng)獲得的聚合物前藥納米粒子符合EPR效應(yīng)，可增加納米粒子在腫瘤部位的被動(dòng)靶向聚集，以期獲得良好的抗腫瘤效果。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究化學(xué)鍵、官能團(tuán)對(duì)前藥理化性質(zhì)影響及聚合物前藥中刺激響應(yīng)性化學(xué)鍵的設(shè)計(jì)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。