超聲提取-高效液相色譜法測(cè)定生活用紙中11種熒光增白劑*

潘春燕，周雯迪，陸 陽(yáng)，姚譽(yù)陽(yáng)，朱鵬飛

（1.無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心 江蘇省食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(有機(jī)污染物領(lǐng)域)，江蘇 無(wú)錫 214023；2.江蘇省血吸蟲病防治研究所 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)寄生蟲預(yù)防與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省寄生蟲與媒介控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214064）

熒光增白劑（fluorescent whitening agents,FWAs）是一種白色熒光染料，因其能吸收波長(zhǎng)為300～400nm的紫外光，再激發(fā)出波長(zhǎng)為420～480nm的藍(lán)色或藍(lán)紫色熒光，在視覺(jué)上達(dá)到增白或增亮的效果，因此，被廣泛用于造紙行業(yè)[1]。其中，雙三嗪氨基二苯乙烯類熒光增白劑是我國(guó)應(yīng)用最多的一類熒光增白劑[2]。大量醫(yī)學(xué)研究表明，熒光增白劑被人體吸收后，很難被分解或排出體外，會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)，并且會(huì)和傷口處蛋白質(zhì)結(jié)合，阻礙傷口愈合。長(zhǎng)期接觸熒光增白劑，會(huì)對(duì)細(xì)胞的正常發(fā)育和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，成為潛在的致癌因素[3,4]。

目前，熒光增白劑的測(cè)定方法主要有熒光分光光度法[5-7]、高效液相色譜法[1-4]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8,9]。其中，熒光分光光度法只能實(shí)現(xiàn)熒光增白劑總量的測(cè)定，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器昂貴，不易普及。而高效液相色譜法因分離效果好，檢測(cè)成本低，與熒光檢測(cè)器聯(lián)用，靈敏度高，因此，被廣泛應(yīng)用于熒光增白劑的檢測(cè)。生活用紙中熒光增白劑的檢測(cè)報(bào)道較少，且被測(cè)物種類有限[5-7,10]，鑒于此，本文系統(tǒng)化地研究了多種生活用紙中常見的11種雙三嗪氨基二苯乙烯熒光增白劑同時(shí)測(cè)定的方法，以期為相關(guān)的監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器（FLD）（美國(guó)安捷倫公司）；KS-600D型超聲儀(寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司)；KDC-16H型高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

11種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：FWA 5bm（CAS：4193-55-9）、C.I 85（CAS：12224-06-5）、C.I 113（CAS：12768-92-2）、C.I 71（CAS：43056-63-9）、C.I 90（CAS：3426-43-5）、C.I 24（CAS：12224-02-1）、C.I 210（CAS：28950-61-0）、C.I 220（CAS：12768-91-1）、C.I 264（CAS：76482-78-5）、C.I 357（CAS：41098-56-0）、C.I 353（CAS：55585-28-9），濃度均為100μg·mL-1，福州綠川生物科技有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，德國(guó)默克公司；HCl、三乙胺、四丁基溴化銨（TBA），均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 將紙樣品剪成5mm×5mm以下碎片，混合均勻，稱取0.5g（精確至0.001g）置于50mL聚丙烯塑料離心管中，加入25mL 40%乙腈水溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為11.5），超聲提取10min，以10000r·min-1速率離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管中。再分兩次向紙屑中加入12.5mL 40%乙腈水溶液，按上述方法重復(fù)提取兩次。合并3次提取液，用HCl∶H2O=1∶1（V/V）溶液將提取液調(diào)至中性。加入40%乙腈水溶液定容至50mL，混勻，再以10000r·min-1速率離心5min，吸取上清液置于棕色進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。實(shí)驗(yàn)在避光條件下進(jìn)行（照度小于20Lux）。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液的配制 分別吸取11種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度均為100μg·mL-1）各100μL，置于10mL棕色容量瓶中，用40%乙腈水溶液稀釋至刻度，制得1μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 分別吸取125、750、1375、2000、2500μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液于5mL棕色容量瓶中，用40%乙腈水溶液稀釋至刻度，制得25、150、275、400、500ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250mm×4.6μm，5μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：10μL；流速：1.0mL·min-1；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇（2∶3，V/V），流動(dòng)相B：含25mmol·L-1TBA的甲醇-水（5∶95，V/V）（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為8.0）。梯度洗脫程序見表1。檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)350nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Mobile phase gradient elution procedure

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取溶劑 11種熒光增白劑均為陰離子型熒光增白劑，且含有多個(gè)非水溶性的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，故選擇有機(jī)溶劑與水混合作為提取溶劑。試驗(yàn)了不同濃度的乙腈水溶液對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著乙腈含量的提高，熒光增白劑的回收率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，8種熒光增白劑的回收率達(dá)到最大，但是，C.I 264、C.I 357和C.I 353的回收率始終極低，分別為7.3%、5.2%和3.1%，推測(cè)是溶液pH值對(duì)熒光增白劑分子結(jié)構(gòu)有影響。該類熒光增白劑含有氨基，在堿性條件下更易被溶劑提取，故采用三乙胺調(diào)節(jié)提取液pH值，考察pH值為8.0～12.5對(duì)回收率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，當(dāng)pH值為11.5時(shí)，11種熒光增白劑的回收率達(dá)到最大。故方法采用40%乙腈水溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為11.5）作為提取溶劑。同時(shí)考慮到后續(xù)的色譜分離，提取完成后用HCl∶H2O=1∶1（V/V）溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。

圖1 pH值對(duì)回收率的影響Fig.1 Effect of pH on the recovery

2.1.2 提取液體積和提取次數(shù) 試驗(yàn)了多種提取方案，回收率如下：25mL一次（82.3%～87.5%）；25mL兩次（92.2%～97.6%）；25mL+12.5mL+12.5mL（95.2%～101.6%）；50mL一次（86.3%～94.8%）。結(jié)果表明，分3次提取，各物質(zhì)的回收率最大，均達(dá)到95%以上。推測(cè)是由于紙制品易吸收液體，造成提取液轉(zhuǎn)移不完全，故分次提取效果更好。同時(shí)考慮到提取液體積過(guò)大會(huì)降低靈敏度，增加有機(jī)溶劑的消耗量，故提取液總體積為50mL，采用25mL+12.5mL+12.5mL分3次提取。

2.1.3 提取時(shí)間和溫度 試驗(yàn)了提取時(shí)間為5～20min，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)10min以后，提取效率基本無(wú)變化，為節(jié)約時(shí)間，提取時(shí)間選擇10min。

試驗(yàn)了水浴超聲溫度為室溫、30、40、50、60℃，發(fā)現(xiàn)提取效率幾乎不隨溫度發(fā)生變化，為節(jié)約能源，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，水浴溫度采用室溫。

2.1.4 過(guò)濾膜 將400ng·mL-1的熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)幾種常見的微孔濾膜后上機(jī)測(cè)定，回收率結(jié)果如下：尼龍濾膜（0%～75.3%）、聚醚砜濾膜（60.3%～98.4%）、PTFE濾膜（18.5%～71.3%）和PVDF濾膜（41.3%～65.6%）。結(jié)果表明，采用任意一款濾膜，均有物質(zhì)損失較大?？紤]到提取液澄清透明，采用以10000r·min-1速率離心后未觀察到明顯的懸浮顆粒，同時(shí)色譜柱在進(jìn)樣過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)壓力增大，故提取液選擇不通過(guò)過(guò)濾膜直接上機(jī)。

2.2 色譜條件的選擇

色譜柱采用Agilent Eclipse XDB-C18柱，規(guī)格250mm×4.6μm,5μm；柱溫35℃；進(jìn)樣體積10μL；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)350nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm。調(diào)節(jié)流動(dòng)相使11種物質(zhì)完全分離成為本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

高效液相色譜最常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈和水。嘗試使用甲醇-水、乙腈-水體系，11種熒光增白劑均無(wú)法達(dá)到基線分離，且采用乙腈-水體系時(shí)，色譜峰拖尾嚴(yán)重。采用甲醇-乙腈-水體系分離，拖尾現(xiàn)象有所改善，當(dāng)A相采用乙腈-甲醇（2∶3，V/V）時(shí)，B相采用甲醇-水（5∶95，V/V）時(shí)，峰型對(duì)稱性較好，但11種物質(zhì)色仍無(wú)法完全分離，可能是由于11種熒光增白劑均含有多個(gè)磺酸基團(tuán)，致使極性較強(qiáng)，在C18柱中保留較弱。嘗試在B相中加入正離子對(duì)試劑四丁基溴化銨（TBA）與磺酸基團(tuán)結(jié)合以減小極性。同時(shí)，磺酸基團(tuán)需在堿性條件下才能充分離子化，確保與離子對(duì)試劑相結(jié)合，故同時(shí)加入三乙胺調(diào)節(jié)pH值?？疾炝薚BA的濃度為5～30mmol·L-1，pH值為7.5～10.0時(shí)對(duì)分離的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增大，分離度逐漸增大，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，分離度最好，當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，色譜峰出現(xiàn)明顯拖尾，故選擇最佳pH值為8.0。調(diào)節(jié)TBA的加入量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)TBA濃度為10mmol·L-1時(shí)，除C.I 264和C.I 353未能完全分離外，其他物質(zhì)均分離較好；當(dāng)TBA濃度為25mmol·L-1時(shí)，11種物質(zhì)均實(shí)現(xiàn)完全分離；繼續(xù)增加TBA濃度，分離情況無(wú)明顯改善，考慮到TBA為固體物質(zhì)，含量過(guò)高會(huì)造成色譜柱壓力增大，甚至析出，造成色譜柱損壞，故濃度采用25mmol·L-1，并用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為8.0。為兼顧分離度和分離時(shí)間，流動(dòng)相采用梯度洗脫方式，最終優(yōu)化得到表1中梯度洗脫程序。

圖2a、b分別為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和加標(biāo)樣品的色譜圖。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和加標(biāo)樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard materials and spiked sample

由圖2可見，11種物質(zhì)在18min內(nèi)得到較好的分離，回復(fù)初始流動(dòng)相平衡至25min，進(jìn)樣重復(fù)性較好。色譜條件滿足分析要求。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系及檢出限、定量限 配制11種熒光增白劑的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度為25、150、275、400、500ng·mL-1。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限。相關(guān)結(jié)果見表2。

由表2可見，11種熒光增白劑在25～500ng·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系良好。檢出限為0.12～0.24mg·kg-1，定量限為0.40～0.80mg·kg-1，滿足分析要求。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab.2 Regression equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantification

2.3.2 回收率和精密度 選取3種具有代表性的生活用紙進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，這3種生活用紙與口腔或食品直接接觸，人體暴露風(fēng)險(xiǎn)較大。分別進(jìn)行低（4mg·kg-1）、中（15mg·kg-1）、高（40mg·kg-1）3個(gè)水平的加標(biāo)，每個(gè)水平平行進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。所有加標(biāo)回收樣品均不含11種熒光增白劑。

表3 回收率和精密度（n=6，%）Tab.3 Results of recovery and precision（n=6，%）

由表3可知，各物質(zhì)的平均回收率在95.0%～102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.16%～5.07%，滿足檢測(cè)要求。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

從本市市場(chǎng)上采集餐巾紙、濕巾紙、衛(wèi)生紙、抽紙、食品包裝用紙共30件，其中一件食品包裝用紙檢出熒光增白劑C.I 353，含量為10.82mg·kg-1，陽(yáng)性樣品色譜圖見圖3。故本方法適合實(shí)際樣品的測(cè)定。

圖3 陽(yáng)性樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of positive sample

3 結(jié)論

本文建立了以40%乙腈水溶液為提取溶劑，高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定生活用紙中11種雙三嗪氨基二苯乙烯類熒光增白劑的分析方法。該方法前處理快速簡(jiǎn)便，回收率和重現(xiàn)性較好，檢出限低，分析速度快，干擾少，適合于生活用紙中11種熒光增白劑的測(cè)定。