L-精氨酸-D-核糖的美拉德產(chǎn)物對花生油抗氧化活性的影響

章銀良，黃天琪，郭浩彬，趙宇，程夢夢，張麗，黃圓圓

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

美拉德反應(yīng)(Maillard reaction，MR)是指在一定條件下含羰基的碳水化合物與含氨基的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)之間的兩種基團發(fā)生縮合反應(yīng)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products,MRPs)是指羰基化合物和氨基化合物形成的復(fù)雜的棕黑色聚合物[1-2]。MRPs中因為具有還原酮、呋喃、類黑精等物質(zhì)而具有較強的抗氧化活性[3-5]。食品加工過程中合理利用MRPs中抗氧化活性物質(zhì)的生成能夠很好地提高食品的貨架期、抑菌性等性能[6-7]。美拉德反應(yīng)在食品熱加工過程中經(jīng)常發(fā)生，且MRPs能和BHA、BHT等人工合成的抗氧化劑相媲美，因此,MRPs 也被稱為天然抗氧化劑[8]。多數(shù)研究表明MRPs對脂質(zhì)氧化具有較好的抑制作用[9]。阮雁春等[10]將花生蛋白水解物和半乳糖反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs應(yīng)用于豬肉脯中，發(fā)現(xiàn)MRPs能夠很好地抑制豬肉脯中蛋白和脂質(zhì)的氧化，起到護色和抗氧化的作用。葛偉等[11]研究表明超聲處理的酪蛋白-葡萄糖的MRPs具有很好的抗脂質(zhì)體氧化能力。章銀良等[12]應(yīng)用L-賴氨酸和D-阿拉伯糖反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs與人工合成的BHA對肉餡進行抗氧化活性比較，發(fā)現(xiàn)6% MRPs的處理組與添加0.02%BHA的肉餡抗氧化程度相近。

脂質(zhì)的氧化是造成食品變質(zhì)的重要原因之一[13]，油脂的氧化主要分為4種，分別是自動氧化、光氧化、酶促氧化和熱氧化[14]。其中自動氧化占比最大，自動氧化過程主要分為誘導(dǎo)過程、自由基鏈式反應(yīng)過程和二級氧化產(chǎn)物生成過程[15]。油脂氧化自由基鏈式反應(yīng)過程中會產(chǎn)生大量自由基(R·、RO·、ROO·)，由于自由基存在時間較短，因此很難被捕捉到，電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance，ESR)能利用自由基的順磁性直接以譜圖的形式反映出自由基的含量以及種類，能夠很好地借助其闡述油脂氧化的過程[16-17]。本文旨在利用ESR技術(shù)測定氧化前期的自由基總量和自由基種類，以及過氧化值(POV)、茴香胺值(AV)、2-硫代巴比妥酸值(TBA)，從不同階段類比研究L-精氨酸-D-核糖的MRPs與常見的抗氧化劑(BHA、TBHQ、茶多酚)對花生油的抗氧化效果，為完善天然抗氧化劑的檢測方法和深入研究MRPs提供了參考依據(jù)。

1 材料、設(shè)備與方法

1.1 試劑與材料

花生油(未添加抗氧化劑)：鄭州市紫竹路農(nóng)貿(mào)市場；D-核糖(AR)、L-精氨酸(AR)：北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸(AR)：天津市富宇精細化工有限公司；正丁醇(AR)、氫氧化鈉(AR)、可溶性淀粉、無水乙醇(AR)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷(AR)、鹽酸(AR)：煙臺市雙雙化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) (AR，進口試劑)；丁基羥基茴香醚(BHA)(AR)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)(AR)、異辛烷(AR)、N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)(97%)、P-茴香胺(AR)、硫代硫酸鈉(AR)、碘化鉀(AR)、2-硫代巴比妥酸(AR)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)(AR)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；電子順磁共振波譜儀 美國布魯克科技(北京)有限公司；FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-S水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；DH-400A電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

在前期的優(yōu)化試驗中，我們通過均勻試驗得出L-精氨酸-D-核糖的最優(yōu)條件為精氨酸∶核糖為1∶1、pH 12、反應(yīng)時間200 min、反應(yīng)溫度160 ℃，其生產(chǎn)的MRPs對DPPH·的清除率為64.34%。DPPH自由基清除率測定方法：MRPs稀釋50倍，取500 μL與2 mL的0.5 mmol/L DPPH混合，暗反應(yīng)20 min后，立即放入電子順磁共振波譜儀的諧振腔中，待儀器自動調(diào)諧完畢后開始測量。ESR測定條件：頻率9.792 069 GHz，功率5.00 mW，中心磁場3 487 G，掃描寬度100 G，調(diào)制幅度2.27 G，調(diào)制頻率86.00 kHz，時間常數(shù)40.96，掃描時間83.88 s(20.97 s×4次)，橫坐標點數(shù)512，接收機增益3.17×103。

1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)的制備

準確稱量1.25 g D-核糖和1.25 g L-精氨酸，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至12.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，置于160 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)200 min。反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進行相關(guān)測定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗氧化劑待測樣品的配制

取花生油置于錐形瓶中，按照GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中的規(guī)定加入0.02%的BHA、TBHQ、茶多酚以及MRPs(質(zhì)量分數(shù)為2%、4%、6%)，超聲5 min后備用。

1.3.3 自由基總量的測定

溫度組：在1 mL花生油樣品中加入10 mg PBN捕獲劑(對照組加入6% MRPs)并超聲5 min，溶解后，用10 mL的注射器將其注射進核磁管中，甩至底部。將其分別置于60，80，100，120，140 ℃的油浴鍋中，加熱2 min后迅速取出，置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測定ESR強度(用二重積分表示)。

時間組：在1 mL花生油樣品及抗氧化劑待測樣品中加入10 mg PBN捕獲劑，并超聲5 min溶解后，用10 mL的注射器將其注射進核磁管中，甩至底部。將其置于100 ℃的油浴鍋中，每隔2 min迅速取出，置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測定ESR強度(用二重積分表示)。

1.3.4 花生油氧化不同自由基含量的測定

在1 mL加入不同抗氧化劑的花生油油樣及未加入抗氧化劑的花生油油樣中加入50 μL DMPO后超聲5 min，溶解后，用10 mL的注射器將其注射進核磁管中甩至底部。將其置于120 ℃的油浴鍋中，每隔1 min迅速取出，置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測定ESR強度(用二重積分表示)。

儀器測定條件：中心磁場3 487 G；掃描寬度100 G；微波頻率9.831 712 GHz；微波功率5 mW；調(diào)制幅度2.27 G；調(diào)制頻率100 kHz；保留時間40.96 s；掃描次數(shù)4次。

1.3.5 花生油主要品質(zhì)指標的檢測

采用Schaal烘箱加速氧化試驗研究花生油的氧化穩(wěn)定性[18-19]，取100 g油樣于錐形瓶中。將抗氧化劑待測油樣和花生油油樣置于(60±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光保存，每隔 1 d 取樣一次測定油樣的過氧化值(POV)、茴香胺值(AV)和2-硫代巴比妥酸值(TBA)。茴香胺值的測定參照 GB/T 24304—2009《動植物油脂 茴香胺值的測定》;2-硫代巴比妥酸值的測定參照GB/T 35252—2017《動植物油脂2-硫代巴比妥酸值的測定 直接法》；過氧化值的測定參照 GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中的滴定法。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗均做3次平行，采用WinEPR-Processing、Simfonia、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關(guān)方法進行處理，并用SPSS軟件進行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同抗氧化劑對花生油自由基總量的影響

PBN捕獲的花生油ESR譜圖及擬合曲線見圖1。

圖1 PBN捕獲的花生油ESR譜圖及擬合曲線Fig.1 ESR spectrogram and fitting curve of peanut oil captured by PBN

PBN捕獲的花生油的ESR譜圖常用于表示油脂氧化生成的自由基的相對定量研究[20]，其譜圖的二重積分可表示為氧化前期自由基生成的總量，PBN捕獲的油脂自由基由1個N核和1個H核構(gòu)成，第三峰和擬合曲線不一致是因為花生油具有較大的黏性，導(dǎo)致實際信號和擬合信號不一致。

不同溫度花生油自由基總量的影響曲線圖見圖2。

圖2 不同溫度花生油自由基總量的影響曲線圖Fig.2 Effect curves of the total amount of peanut oil radicals at different temperatures

隨著溫度的升高，花生油氧化產(chǎn)生的自由基越多，且高溫會導(dǎo)致自由基產(chǎn)生的速率增快，結(jié)果與李培等的研究一致。加入MRPs能夠延緩油脂的氧化。在溫度低于80 ℃時加入MRPs與空白組自由基總量十分接近，這說明花生油中也有一定的抗氧化活性物質(zhì)，例如VE等，能夠在前期對油脂氧化進行保護，而隨著溫度進一步升高，MRPs對油脂自由基生成的抑制作用顯著提高。

不同抗氧化劑對花生油自由基總量的抑制情況見圖3。

圖3 不同抗氧化劑對花生油自由基總量的抑制曲線圖Fig.3 Inhibition curves of different antioxidants on total amount of free radicals in peanut oil

由圖3可知，隨著加熱時間的延長，花生油的氧化程度不斷加深。根據(jù)自由基生成總量對上述抗氧化劑的抗氧化效果進行排序，即自由基清除能力大小依次為4% MRPs>6% MRPs>2% MRPs>TBHQ>BHA>茶多酚。隨著MRPs濃度不斷增加，其抗氧化效果也不斷增強。加入茶多酚后，理論上能夠提高花生油的抗氧化活性[21]，高溫下反而比空白花生油樣產(chǎn)生更多的自由基，這一原因需要進一步研究。

2.2 不同抗氧化劑對花生油自由基總量的影響

不同加熱時間的花生油ESR譜圖見圖4。

圖4 不同加熱時間的花生油ESR譜圖Fig.4 ESR spectrograms of peanut oil heated for different time

由圖4中B可知，未加熱時DMPO捕獲到的自由基為ROO·，而未捕獲到R·，這可能是由于油樣放置時間過長或注射器注射時混入過多的氧氣，導(dǎo)致烷基自由基氧化，而隨著加熱時間的延長逐漸捕獲到烷基自由基和DMPO-X自由基(見圖4中C和D)，而未捕獲到RO·，RO·一旦產(chǎn)生則很快參與自由基鏈式反應(yīng)而生成其他中間產(chǎn)物，導(dǎo)致其含量低，達不到儀器檢測限[22]。而烷基自由基的生成說明溫度的升高能夠加速油脂自由基的生成，這和前期的試驗結(jié)果一致，且花生油的氧化過程符合油脂氧化自由基鏈式反應(yīng)[15]。加熱3 min時的花生油ESR譜圖見圖4中C，其中1，2，3分別表示烷基自由基、烷過氧自由基、DMPO-X自由基。由圖4中A可知，隨著加熱時間的延長，DMPO捕獲到的花生油的ESR譜圖的峰高和峰數(shù)在不斷變化，且加熱能夠催化烷基自由基和烷過氧自由基的生成，當(dāng)加熱到4 min時，DMPO已經(jīng)過度出現(xiàn)開環(huán)現(xiàn)象。

選取烷基自由基的第一條峰高和烷過氧自由基的第一條峰高繪制不同抗氧化劑對花生油氧化前期自由基的影響曲線圖，見圖5和圖6。

圖5 烷過氧自由基隨時間變化曲線圖Fig.5 Changing curves of alkyl-peroxy radicals with time

圖6 烷基自由基隨時間變化曲線圖Fig.6 Changing of curves alkyl radicals with time

由圖5可知，隨著加熱時間的延長，烷過氧自由基的信號強度呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，升高的原因在于加熱加速油脂氧化，導(dǎo)致烷過氧自由基迅速積累，因此信號強度不斷增大，而進一步加熱，核磁管中的氧氣有限，新生成的烷過氧自由基會減少，且大量的烷過氧自由基會轉(zhuǎn)變?yōu)槎壯趸a(chǎn)物[15]，因此造成烷過氧自由基信號強度不斷降低。此外由圖5可知，添加抗氧化劑可以抑制烷過氧自由基的生成，抑制效果由強到弱依次為2% MRPs>4% MRPs>茶多酚>TBHQ>6% MRPs>BHA。此外，加入抗氧化劑的花生油樣品比空白樣品的烷過氧自由基的下降時間有所提前，這極有可能是抗氧化劑消耗核磁管中的氧氣所致，因而對花生油具有保護作用。

由圖6可知，烷基自由基隨著加熱時間的延長而逐漸積累，而茶多酚和TBHQ的烷基自由基含量要高于空白油樣組，綜上所述，由烷過氧自由基與空白油樣對比可推測，茶多酚和TBHQ的作用效果極有可能是阻止油脂鏈式自由基中從烷基自由基向烷氧自由基和烷過氧自由基生成這一過程。隨著MRPs添加量的不斷增大，烷基自由基的生成量不斷減少，說明烷基自由基的生成量和MRPs的添加量相關(guān)，烷基自由基量大小為：2% MRPs>4% MRPs>6% MRPs，而上述烷過氧自由基和自由基總量MRPs低于空白油樣，因此MRPs也極有可能和TBHQ的作用機制一致。添加BHA的樣品生成的烷基自由基的信號強度明顯弱于空白組，因此BHA可抑制烷基自由基的生成且可能能夠作用于鏈式自由基反應(yīng)前期誘導(dǎo)作用這一過程。

2.3 不同抗氧化劑對花生油品質(zhì)的影響

不同抗氧化劑對花生油品質(zhì)的影響見圖7～圖9。

圖7 不同抗氧化劑對花生油過氧化值的影響曲線圖Fig.7 Effect curves of different antioxidants on the peroxide value of peanut oil

由圖7可知，添加抗氧化劑和MRPs能夠很好地抑制油脂的過氧化物以及醛類、酮類物質(zhì)的生成。隨著加速氧化的進行，空白組和對照組的過氧化值隨時間的延長而增大，對于花生油的氧化保護作用由強到弱依次為TBHQ>4% MRPs>6% MRPs>2% MRPs>茶多酚>BHA，在加速氧化前3 d可以觀察到MRPs對花生油的抑制效果隨其濃度的增大而增大，而后4% MRPs抑制過氧化物的能力>6% MRPs的抑制能力，這可能是用于MRPs本身的抗氧化作用能夠抑制油脂氧化，而MRPs的加入也意味著會加入水，而水的加入會促進油脂氧化，因此POV(4% MRPs)

圖8 不同抗氧化劑對花生油TBA值的影響曲線圖Fig.8 Effect curves of different antioxidants on the TBA value of peanut oil

由圖8可知，隨著加速氧化的不斷進行，花生油不斷氧化產(chǎn)生丙二醛，上述抗氧化劑對于丙二醛的生成均具有較好的抑制效果。不同抗氧化劑抑制丙二醛的能力強弱依次為TBHQ>6% MRPs>茶多酚>4% MRPs>2% MRPs>BHA，因此MRPs的添加量越大，對于花生油氧化生成的丙二醛的抑制效果越好。因此合理添加MRPs有利于抑制花生油的氧化，提高花生油的品質(zhì)。

圖9 不同抗氧化劑對花生油AV值的影響曲線圖Fig.9 Effect curves of different antioxidants on the AV value of peanut oil

由圖9可知，隨著加速氧化時間的延長，花生油的茴香胺值不斷增大，添加的各種抗氧化劑對于AV值的抑制強弱約為TBHQ>BHA>茶多酚>4% MRPs>6% MRPs>2% MRPs，幾種抗氧化劑對于花生油氧化產(chǎn)生的游離脂肪酸的效果較為接近。

3 結(jié)論

運用ESR探究不同抗氧化劑對花生油自由基總量和種類可以得出：花生油隨著加熱溫度的升高和時間的延長，其自由基總量不斷增大。茶多酚和TBHQ會使花生的烷基自由基增大，但是會抑制烷基自由基向烷過氧自由基轉(zhuǎn)化這一過程，MRPs和BHA能夠抑制花生油生成烷基自由基和烷過氧自由基，且MRPs的抑制效果與其添加量呈正相關(guān)。通過測定花生油的POV值、AV值、TBA值可以得出：上述抗氧化劑均能很好地抑制花生油的氧化，其中抑制效果最好的抗氧化劑是TBHQ。MRPs的添加量能夠影響花生油氧化的二級產(chǎn)物的生成。綜上所述，運用ESR分析脂質(zhì)的自由基鏈式反應(yīng)，能更細致地了解油脂氧化的機制，MRPs能抑制花生油的氧化。