傳統(tǒng)豆醬微生物群落演替及風(fēng)味物質(zhì)變化的研究進(jìn)展

鄧威，韓篷慧,王美淇，高子茵，聶一博，張先，李范洙,*

(1.延邊大學(xué) 融合學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

豆醬又稱黃醬、大醬，是以大豆為原料，通過微生物發(fā)酵釀造的一種調(diào)味品，是東亞人民不可或缺的餐桌美食。通過發(fā)酵技術(shù)可以去除大豆的豆腥味，降解蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等大分子化合物，提高營養(yǎng)素的利用程度，改善豆醬的風(fēng)味、口感和質(zhì)地[1-2]。根據(jù)制作工藝的不同，豆醬可以分為傳統(tǒng)豆醬和工廠化生產(chǎn)豆醬兩種。豆醬對健康有很多益處，如抗癌、抗糖尿病、預(yù)防肥胖和治療便秘等[3]，最近一項(xiàng)研究表明富含發(fā)酵食品的飲食有增強(qiáng)腸道菌群多樣性以及減少炎癥標(biāo)志物的潛力[4]，其品質(zhì)和功能性越來越受到重視。

傳統(tǒng)豆醬是一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，微生物產(chǎn)生的胞外酶能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)、糖類、脂肪等大分子物質(zhì)分解為小分子代謝物，如多肽、氨基酸、糖苷和有機(jī)酸等，多種降解產(chǎn)物之間會發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，從而賦予其豐富的營養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味。豆醬風(fēng)味的變化是各種微生物代謝產(chǎn)生的多種化合物相互作用的結(jié)果，不同的發(fā)酵體系可能含有相同的微生物群落，而相同的風(fēng)味也可能由不同微生物代謝產(chǎn)生[5]。研究傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，解析豆醬風(fēng)味形成機(jī)理，探明微生物群落與風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性，對改善傳統(tǒng)豆醬風(fēng)味，保證豆醬的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)具有重要的意義。

1 傳統(tǒng)豆醬的生產(chǎn)工藝

傳統(tǒng)豆醬經(jīng)過三個階段發(fā)酵：第一階段需要將大豆蒸熟搗碎、造型(長方體或橢圓體)、吊掛自然發(fā)酵而得到醬醅，叫作固態(tài)發(fā)酵；第二階段是將醬醅掰碎加入一定比例鹽水浸泡進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵；第三階段是將醬鹵分離后，將醬渣調(diào)節(jié)鹽度和水分進(jìn)行后發(fā)酵的過程，最終得到很濃稠的干態(tài)醬。而工廠化生產(chǎn)豆醬經(jīng)過兩個階段發(fā)酵：第一階段是將種菌接種到蒸熟的大豆中發(fā)酵而得醬曲，也叫固態(tài)發(fā)酵；第二階段是將醬曲加入到一定濃度的鹽水中浸泡、打碎后經(jīng)過一段時間的發(fā)酵得到豆醬，這個階段屬于液態(tài)發(fā)酵?？梢妭鹘y(tǒng)豆醬和工廠化生產(chǎn)豆醬的制作工藝和發(fā)酵方式有一些不同。

傳統(tǒng)豆醬的生產(chǎn)需要制作醬醅進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在發(fā)酵過程中醬醅外部的低水分活度環(huán)境更有利于霉菌的生長繁殖，而內(nèi)部的水分活度較高，利于酵母菌和部分細(xì)菌如乳酸菌的生長。液態(tài)發(fā)酵階段需要刷掉發(fā)酵成熟的醬醅表面的霉菌，加入鹽水制成醬醪發(fā)酵。醬醪中能夠在較高鹽濃度[6]下生長的部分細(xì)菌和酵母菌成為了優(yōu)勢菌群[7]。傳統(tǒng)豆醬的工藝屬于開放式發(fā)酵，其微生物群落結(jié)構(gòu)受制于環(huán)境因素，發(fā)酵時間較長，一般需要半年的時間才能發(fā)酵成熟，多種微生物參與發(fā)酵使其風(fēng)味濃厚，具有獨(dú)特的豆醬風(fēng)味。王葳[8]通過氣相色譜-質(zhì)譜法和靜態(tài)頂空-氣相色譜法研究了傳統(tǒng)豆醬和工廠化豆醬中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)豆醬的滋味更加鮮美，發(fā)酵程度也更高。還有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味物質(zhì)和果味酯含量較多[9]，口感較好，但是更容易受到黃曲霉毒素的污染[10]。

工廠化豆醬在固態(tài)發(fā)酵階段需要人工接種發(fā)酵微生物，大多采用曲霉屬真菌純種發(fā)酵制曲[11]。雖然人工接種制曲能減少雜菌的污染，保證豆醬的安全性和質(zhì)量穩(wěn)定，但是微生物群落組成上比較單一，從而導(dǎo)致其風(fēng)味比較單調(diào)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)豆醬。

2 傳統(tǒng)豆醬微生物多樣性及影響因素

2.1 傳統(tǒng)豆醬中微生物的多樣性

傳統(tǒng)豆醬是固態(tài)發(fā)酵的醬醅轉(zhuǎn)化成醬醪，進(jìn)一步經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵而得到的，其中微生物種類繁多，主要來自醬醅自然發(fā)酵時所附著的自然界微生物，包括真菌中的霉菌和酵母菌、細(xì)菌中的芽孢桿菌和乳酸菌等。其中霉菌主要有青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)和地霉屬(Geotrichum)。酵母菌主要有耐高滲透壓的結(jié)合酵母屬(Zygosaccharomyces)。芽孢桿菌主要有梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。乳酸菌主要有明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)，其他研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌種還有腸桿菌屬(Enterobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)等[12-14]。特殊的發(fā)酵體系、多變的發(fā)酵環(huán)境、獨(dú)特的發(fā)酵工藝導(dǎo)致傳統(tǒng)豆醬微生物復(fù)雜多樣，主要的種屬信息見表1。

表1 傳統(tǒng)豆醬中的優(yōu)勢菌群 Table 1 The dominant flora in traditional soybean paste

目前人們廣泛認(rèn)為霉菌、酵母菌、芽孢桿菌屬和乳酸菌是傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵的共同關(guān)鍵作用者。Sun等[16]研究了遼寧省19份傳統(tǒng)豆醬的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢細(xì)菌有芽孢桿菌屬、明串珠菌屬和葡萄球菌屬，這幾種細(xì)菌是發(fā)酵食品中常見的微生物[17-18]，青霉屬、毛霉屬和德巴利酵母屬(Debaryomyces)為傳統(tǒng)豆醬的優(yōu)勢真菌屬。葛菁萍等[19]還發(fā)現(xiàn)米曲霉(A.oryzae)、傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)和一種不可培養(yǎng)的真菌是傳統(tǒng)豆醬中一直占優(yōu)勢的微生物。安飛宇等[20]利用NGS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢細(xì)菌為乳桿菌屬和四聯(lián)球菌屬，異常威克漢姆酵母菌(Wickerhamomycesanomalus)也是優(yōu)勢真菌，腸球菌屬(Enterococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、魏斯氏菌屬和不動桿菌屬(Acinetobacter)也存在于醬醅和傳統(tǒng)豆醬中，并隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)生動態(tài)變化。不同的發(fā)酵體系導(dǎo)致醬醅和醬醪中的優(yōu)勢菌屬存在差別，沈弘洋等[21]使用Illumina MiSeq方法對細(xì)菌和真菌基因序列分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)上，醬醅中優(yōu)勢菌屬主要為芽孢桿菌屬，鹽水發(fā)酵階段四聯(lián)球菌屬為主要優(yōu)勢細(xì)菌屬。在真菌的群落結(jié)構(gòu)上，發(fā)酵1 d時毛霉屬為主要優(yōu)勢菌屬，從醬醅發(fā)酵的中間節(jié)點(diǎn)第30天開始，曲霉屬為主要優(yōu)勢菌屬。

2.2 影響傳統(tǒng)豆醬微生物演替的因素

傳統(tǒng)豆醬是一個多菌混合發(fā)酵體系，其品質(zhì)取決于發(fā)酵過程中微生物的演替及優(yōu)勢微生物的種類和數(shù)量，而其微生物群落結(jié)構(gòu)又受到鹽的濃度和種類、大豆品種和環(huán)境等諸多因素的影響。想要加快傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵效率，改善豆醬品質(zhì)，必須控制影響因素，優(yōu)化發(fā)酵工藝，促進(jìn)關(guān)鍵功能微生物的作用。

鹽的濃度和微生物相互作用共同驅(qū)動了傳統(tǒng)豆醬微生物群落的動態(tài)變化[22]。Chun等[23]研究發(fā)現(xiàn)低鹽濃度(9%和12%)發(fā)酵的豆醬在發(fā)酵初期有較高的微生物活性，15%和18%鹽濃度發(fā)酵的豆醬微生物豐度顯著低于低鹽豆醬，乳酸菌受鹽濃度的影響較大，在低鹽豆醬中乳酸菌的生長繁殖較快。但是過低的鹽濃度會導(dǎo)致致病菌的產(chǎn)生，從而影響豆醬的安全性[24]。鹽的種類也會影響豆醬的微生物數(shù)量，還會對其優(yōu)勢微生物群落產(chǎn)生影響。Shim等[25]研究發(fā)現(xiàn)日曬鹽和竹鹽發(fā)酵的豆醬相比精鹽發(fā)酵的豆醬含有更多的桿菌數(shù)，但是酵母菌數(shù)卻較少，加入精鹽發(fā)酵的豆醬中漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)占優(yōu)勢，而在日曬鹽和竹鹽發(fā)酵的豆醬中季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermondii)和畢赤酵母(Pichiasorbitophila)占優(yōu)勢。

大豆是豆醬的主要原材料，不同品種的大豆?fàn)I養(yǎng)成分比例各不相同，不同的微生物生長基質(zhì)會影響微生物的演替，從而給傳統(tǒng)豆醬的品質(zhì)帶來影響。已有研究發(fā)現(xiàn)大豆的蛋白質(zhì)含量與豆醬的蛋白質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)，大豆的蛋白質(zhì)含量越高，豆醬的鮮味越明顯[26]。以蛋白質(zhì)含量較高的黑豆為原料制作豆醬，共鑒定出91種風(fēng)味化合物，而相同工藝生產(chǎn)的黃豆醬中只鑒定出了80種風(fēng)味化合物，黑豆醬中的游離氨基酸含量也高于黃豆醬[27]。輔料的種類和添加量也對豆醬微生物群落有不同程度的影響，Mannaa等[28]研究了添加薄荷、藿香和香菜為輔料發(fā)酵的豆醬中微生物群落的組成，發(fā)現(xiàn)添加了薄荷發(fā)酵的豆醬中四聯(lián)球菌豐度相對較高，在添加了薄荷和藿香發(fā)酵的豆醬中，有害微生物的豐度顯著降低，例如鞘氨醇桿菌屬和泛菌屬(Pantoea)等微生物，3種輔料的加入均會導(dǎo)致豆醬微生物組成發(fā)生顯著變化。

環(huán)境因素對豆醬發(fā)酵的影響也是不可忽視的，溫度、濕度、土壤和地域的變化都會直接影響微生物的生長。為了保證傳統(tǒng)豆醬良好的發(fā)酵環(huán)境，在東北的大部分農(nóng)村地區(qū)，常在冬至或者翌年正月開始制曲發(fā)酵，而農(nóng)歷三月三日以及之后的1個月內(nèi)，氣溫逐漸回升時制作醬醪，自然發(fā)酵60 d左右成熟。發(fā)酵溫度對傳統(tǒng)豆醬中的微生物活性有較大影響，適宜的發(fā)酵溫度能加快微生物的生長代謝活動。Hyeon等[29]研究了4，25，55 ℃下米曲霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆醬的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在55 ℃時米曲霉和枯草芽孢桿菌的代謝變化最明顯，米曲霉發(fā)酵提高了大多數(shù)有機(jī)酸、γ-氨基丁酸和谷氨酰胺的含量，這歸因于適宜的溫度促進(jìn)了碳水化合物代謝和谷氨酸的合成，枯草芽孢桿菌發(fā)酵增加了大多數(shù)氨基酸和異黃酮的水平，說明適宜的溫度條件提高了蛋白酶和β-葡萄糖苷酶的活性。發(fā)酵溫度還會影響豆醬微生物的種類。Hong等[30]對醬醅中的結(jié)合菌群多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)低溫發(fā)酵醬醅中的結(jié)合菌主要為卷枝毛霉(M.circinelloides)和總狀毛霉(M.racemosus)，而高溫發(fā)酵醬醅中主要是總狀橫梗霉(Lichtheimiaramosa)和根毛霉屬(Rhizomucor)。溫度的變化也會影響豆醬微生物群落的結(jié)構(gòu)變化，Ding等[31]研究了密閉40 ℃恒溫發(fā)酵豆醬的微生物多樣性，與常溫自然發(fā)酵豆醬相比，恒溫發(fā)酵豆醬降低了真菌群落的豐富度和多樣性，顯著影響了真菌群落的演替。土壤環(huán)境也會對傳統(tǒng)豆醬微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，研究表明，土壤環(huán)境擴(kuò)散到豆醬中的細(xì)菌主要為考克氏菌屬(Kocuria)，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，豆醬的微生物群落結(jié)構(gòu)趨于相對穩(wěn)定，同時土壤環(huán)境與豆醬接觸的機(jī)會減少，從而使這種影響逐漸減弱，并維持在一定水平。

3 傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味物質(zhì)研究

傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味物質(zhì)包括揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是由原料中米曲霉酶系及耐鹽酵母菌、耐鹽乳酸菌等微生物的發(fā)酵作用和化學(xué)反應(yīng)生成的[32]，主要包括酯類、醇類、醛酮類、酚類、有機(jī)酸類和含硫化合物等。非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括氨基酸、多肽、非揮發(fā)性有機(jī)酸、游離糖、大豆異黃酮和大豆皂苷等。傳統(tǒng)豆醬中的主要風(fēng)味物質(zhì)見表2。

表2 傳統(tǒng)豆醬的主要風(fēng)味成分Table 2 Main flavor components of traditional soybean paste

續(xù) 表

續(xù) 表

3.1 豆醬風(fēng)味的研究方法

近年來，國內(nèi)外對豆醬的風(fēng)味物質(zhì)分析取得了一定的進(jìn)展，其中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS)技術(shù)是豆醬風(fēng)味化學(xué)研究中常用的檢測分析手段，也是代謝組學(xué)分析中使用最廣泛的方法之一。質(zhì)譜技術(shù)在對未知化合物的鑒別方面有著不可比擬的優(yōu)勢，擁有較好的專屬性和較低的檢測限，同時分離能力較強(qiáng)。除了GC-MS技術(shù)之外，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、氣相色譜-嗅聞法(gas chromatography-olfactometry，GC-O)、香氣提取物稀釋分析法(aroma extract dilution analysis，AEDA)等也廣泛用于豆醬風(fēng)味的解析，GC-MS主要適用于初級代謝產(chǎn)物的分析，LC-MS多用于次級代謝產(chǎn)物的分離檢測，不同的光譜平臺聯(lián)用可以檢測更廣泛的豆醬代謝產(chǎn)物。GC-MS和GC-O聯(lián)用可用于檢測和鑒定揮發(fā)性香氣活性化合物，結(jié)合AEDA可以分析候選風(fēng)味物質(zhì)的閾值。感官評價是通過視覺、嗅覺、味覺和聽覺來感知食品及其他物質(zhì)的特征性質(zhì)的一種科學(xué)檢驗(yàn)方法，人工進(jìn)行感官評價存在重復(fù)性偏差、主觀因素影響等弊端，現(xiàn)階段一般借助電子鼻和電子舌輔助進(jìn)行感官評價。目前，宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)在豆醬研究中應(yīng)用廣泛，但是單獨(dú)的分析檢測方法無法全面解析復(fù)雜的豆醬風(fēng)味體系，想要構(gòu)建完整的豆醬風(fēng)味代謝圖譜，必須借助多技術(shù)、多組學(xué)聯(lián)用的研究方法。

3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

3.2.1 酯類

酯類物質(zhì)是傳統(tǒng)豆醬香氣的主體成分，大部分酯類的香氣閾值低，對風(fēng)味的作用很大。酯類物質(zhì)可以賦予豆醬獨(dú)特的花香和果香味，提高其香氣的復(fù)雜程度。酯類經(jīng)水解后能生成脂肪酸和甘油，其中短鏈脂肪酸是許多芳香族化合物的前體，酯酶能催化甘油和醇類直接合成風(fēng)味活性酯[44]。Kum等[45]研究發(fā)現(xiàn)酯類化合物的形成與蛋白酶和酯酶的活性密切相關(guān)，并且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酯類化合物含量逐漸增加，脂肪酶的活性極大地影響了乙酯的形成。大豆等豆類食品在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生高級脂肪酸酯，如油酸乙酯、亞油酸乙酯等物質(zhì)。

3.2.2 醇類

傳統(tǒng)豆醬中的醇類物質(zhì)占有相當(dāng)大的比重，其中由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇含量最多，傳統(tǒng)豆醬在制作過程中通常產(chǎn)生0.1%～0.6%的乙醇[46]。醇類物質(zhì)會顯著影響豆醬的香氣和口感，同時它們也可以作為前體物質(zhì)參與酯化反應(yīng)，如乙醇、異戊醇、苯乙醇等。酵母菌代謝還會產(chǎn)生酪醇，低含量的酪醇會產(chǎn)生柔和的香氣，但會帶來重而長的苦味[47]。

3.2.3 醛酮類

傳統(tǒng)豆醬中的醛酮類物質(zhì)多由氨基酸及酯類降解產(chǎn)生，是發(fā)酵產(chǎn)品中重要的香氣成分，為豆醬提供花香及焦香等特征風(fēng)味。氨基化合物與羰基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)能形成己醛、壬醛和庚醛，而且α-氨基酸還會發(fā)生Strecker降解生成醛類或酮類。低分子量揮發(fā)醛閾值較低，如苯甲醛、苯乙醛等，對傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。酮類化合物如 3-羥基-2-丁酮，能賦予豆醬奶油香氣，也是乳制品的重要香氣成分。

3.2.4 酚類

4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚是傳統(tǒng)豆醬中最主要的酚類物質(zhì)，被認(rèn)為是重要的香氣組成部分。大部分酚類化合物具有香氣特征明顯、活性強(qiáng)的特征，可以賦予豆醬煙熏、木頭和烘焙的氣味。傳統(tǒng)豆醬中的酚類物質(zhì)是以配糖體、木質(zhì)素等物質(zhì)為前體物質(zhì)，經(jīng)過曲霉屬、球擬酵母屬(Torulopsis)的發(fā)酵作用產(chǎn)生的，雖然含量極微，但作為香氣成分作用十分明顯。

3.2.5 含硫化合物

含硫化合物主要來源于含硫氨基酸的分解，如甲硫醇是由蛋氨酸經(jīng)酵母發(fā)酵生成的，還有乙硫醇、甲硫基丁醇、縮硫醛等，是傳統(tǒng)豆醬中不良?xì)馕兜闹鲗?dǎo)體。

3.3 非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

大豆中含有高達(dá)30%～40%的蛋白質(zhì)，在微生物及其酶的作用下，蛋白質(zhì)會降解為多肽、氨基酸等小分子物質(zhì)。氨基酸是傳統(tǒng)豆醬中重要的營養(yǎng)成分和風(fēng)味前體物質(zhì)。谷氨酸和天冬氨酸為豆醬帶來鮮味，芳香族氨基酸如苯丙氨酸和酪氨酸是酚類化合物的前體物質(zhì)，豆醬苦味與苯丙氨酸和酪氨酸密切相關(guān)[48]，甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸是豆醬甜味的主要來源[49]。微生物可通過不同代謝途徑來合成多種氨基酸，為傳統(tǒng)豆醬帶來復(fù)雜濃郁的風(fēng)味。已有研究發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬、畢赤酵母屬和曲霉屬對豆醬游離氨基酸含量的影響較大。Sun等[50]將自制豆醬中分離的光孢青霉菌GQ1-3和米曲霉HGPA20進(jìn)行接種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在接種GQ1-3的豆醬中α-酮戊二酸衍生類型的氨基酸合成占主導(dǎo)地位，而在接種HGPA20的傳統(tǒng)豆醬中草酰乙酸衍生類型的氨基酸合成占主導(dǎo)地位，可見不同微生物所產(chǎn)生的氨基酸不同，從而導(dǎo)致傳統(tǒng)豆醬中營養(yǎng)和味覺物質(zhì)的差異。

肽類為傳統(tǒng)豆醬帶來了豐富的口感和滋味。對于分子量在1 000 Da以上的大豆多肽，由于其疏水基團(tuán)被包圍在分子內(nèi)部，人的味覺很難感受到苦味，而分子量在500～1 000 Da的大豆多肽苦味最強(qiáng)，且隨著分子量的減小，苦味逐漸減弱[51]。大多數(shù)苦味肽的肽鏈末端帶有疏水性氨基酸，而帶有親水性氨基酸的小分子肽多具有濃厚感，如谷胱甘肽、谷纈甘肽等典型的濃厚味肽，已廣泛應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)。此外，還有一些多肽會對豆醬的鮮味產(chǎn)生影響，Rhyu等[52]對豆醬水提物的呈味特征研究表明，豆醬鮮味主要來源于低分子量含谷氨酸和天冬氨酸片段的酸性肽。

非揮發(fā)性有機(jī)酸是傳統(tǒng)豆醬酸味的主要來源。檸檬酸和乳酸是傳統(tǒng)豆醬中最主要的非揮發(fā)性有機(jī)酸[53]，草酸、蘋果酸、琥珀酸和富馬酸也存在于傳統(tǒng)豆醬中，但是檢出含量都較少，對傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味貢獻(xiàn)很小。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，在傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵早期，乳酸菌的有氧呼吸和丙酮酸代謝會產(chǎn)生檸檬酸，發(fā)酵后期檸檬酸在乳酸菌的作用下降解生產(chǎn)乳酸、醋酸等風(fēng)味物質(zhì)。檸檬酸酸味溫和清爽，乳酸的酸味較為柔和，草酸略帶澀味，蘋果酸的酸味圓潤，呈味緩慢持久，琥珀酸和富馬酸的味感復(fù)雜。

大豆中碳水化合物含量約為30%，在糖化酶的作用下，原料中的淀粉類物質(zhì)會被分解為小分子的葡萄糖和果糖，對傳統(tǒng)豆醬風(fēng)味和質(zhì)地的形成具有顯著作用。糖是微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌能通過發(fā)酵葡萄糖、蔗糖等糖類產(chǎn)生乳酸，提供風(fēng)味的同時改變發(fā)酵體系的環(huán)境以促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程。酵母菌可以利用豆醬中的還原糖生成醇類物質(zhì)，賦予傳統(tǒng)豆醬醇和的酒香氣。糖類還能通過美拉德反應(yīng)形成蛋白黑素和香氣物質(zhì)影響傳統(tǒng)豆醬的感官品質(zhì)。

大豆異黃酮和大豆皂苷是傳統(tǒng)豆醬苦澀味的來源，但因其具有抗氧化、抗腫瘤等功能，目前多將其作為大豆保健因子進(jìn)行研究。大豆異黃酮的12種組分均具有強(qiáng)烈的苦澀味。大豆皂苷也呈苦澀味，但隨著傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵的進(jìn)行，在多種微生物和風(fēng)味物質(zhì)的作用下，會改善或遮蓋其苦澀味。

4 傳統(tǒng)豆醬中微生物演替對風(fēng)味形成的影響

傳統(tǒng)豆醬風(fēng)味物質(zhì)的形成與微生物群落息息相關(guān)。菌系、酶系、物系的互作推動了傳統(tǒng)豆醬的發(fā)酵進(jìn)程，發(fā)酵過程中發(fā)生的生化轉(zhuǎn)化來自不同生態(tài)位微生物的代謝活動[54]。以發(fā)酵優(yōu)勢菌霉菌、酵母菌和乳酸菌為例，從傳統(tǒng)豆醬的兩個發(fā)酵階段出發(fā)，分析優(yōu)勢菌群對傳統(tǒng)豆醬風(fēng)味的影響。

傳統(tǒng)豆醬制曲階段，霉菌能利用醬醅中的碳水化合物和蛋白質(zhì)作為能量和原料大量生長，分泌復(fù)雜的酶系，主要包括蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等，降解的小分子物質(zhì)之間會發(fā)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，為醬醪的發(fā)酵提供能量的同時還為傳統(tǒng)豆醬帶來了一定的風(fēng)味。任何種類的真菌都可能同時釋放出數(shù)十種不同的揮發(fā)物，包括醇類、酮類、酯類、烯烴類、硫醇類、單萜類和倍半萜類等[55]。有研究發(fā)現(xiàn)毛霉和青霉會產(chǎn)生霉臭味[56]，從而影響傳統(tǒng)豆醬的整體風(fēng)味。

在醬醪發(fā)酵階段，需要洗刷掉發(fā)酵好的醬醅表面的霉菌以減少其帶來的霉臭味，之后加入鹽水浸泡，進(jìn)入液態(tài)發(fā)酵階段。霉菌僅在發(fā)酵初期有一定豐度，細(xì)菌在醬醪中起主導(dǎo)作用。鹽水減緩了大部分微生物的生長速度，此時耐鹽微生物開始大量繁殖，即耐鹽酵母菌和乳酸菌開始發(fā)揮作用。酵母菌、乳酸菌的生長繁殖會導(dǎo)致pH值下降，一方面抑制了霉菌的生長，另一方面也導(dǎo)致酶系的作用效果降低，傳統(tǒng)豆醬的成熟時間延長。在醬醪發(fā)酵初期，大豆結(jié)合酵母(Z.sojae)可以發(fā)酵葡萄糖生成大量的甘油、甘露醇、乙醇和4-乙基愈創(chuàng)木酚，與發(fā)酵過程中的乳酸菌產(chǎn)物和一些原料分解產(chǎn)物結(jié)合，產(chǎn)生傳統(tǒng)豆醬特有的香味。酵母通過磷酸戊糖途徑生成4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)等呋喃酮類化合物，產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵并生成酯類物質(zhì)，添加酵母菌發(fā)酵能明顯增加傳統(tǒng)豆醬中揮發(fā)性成分的種類[57]。乳酸菌在傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中發(fā)酵糖類、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，使其分解產(chǎn)生醛類、酮類、酯類等一系列小分子物質(zhì)，從而增加傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味[58]。乳酸菌能與酵母菌產(chǎn)生協(xié)同作用，乳酸和乙醇生成乳酸乙酯，和魯氏酵母(Z.rouxii)生成糠醇，從而產(chǎn)生獨(dú)特的醬香氣。同時乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸使得體系pH值降低，有利于酵母菌的增殖，而酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的大量乙醇卻會制約乳酸菌的繁殖，乳酸菌和酵母菌在傳統(tǒng)豆醬相互作用下推動發(fā)酵進(jìn)程。趙建新將植物乳桿菌630-MO-115、魯氏酵母625-YO-125接種到醬醅中后，發(fā)現(xiàn)鮮味氨基酸含量和關(guān)鍵風(fēng)味化合物含量都有了明顯提高。Luan等[59]使用乳酸菌和釀酒酵母兩步發(fā)酵生產(chǎn)辣根醬，與未發(fā)酵樣品相比，醬中醇類、酯類和酸類的含量增加，具有更好的感官品質(zhì)。醬醅中存在60多種乳酸菌，可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸與有機(jī)酸，進(jìn)而影響酵母菌的發(fā)酵能力[60]，研究發(fā)現(xiàn)在醬醅發(fā)酵后期人工接種乳酸菌和酵母菌，其對于促進(jìn)傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵、增加風(fēng)味、改善品質(zhì)是有利的。

在傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵末期，由于乳酸菌生長繁殖快，利用多種糖產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致發(fā)酵體系pH快速下降，從而抑制了其他菌的生長，pH下降到5以下時乳酸菌自身的生長也會變緩，這時pH的改變促進(jìn)了耐鹽酵母的生長，魯氏酵母主要參與醬醪的后熟發(fā)酵，生成乙醇和少量的甘油，在高鹽度下，能大量生成甘油和醇類物質(zhì)，進(jìn)行酒精發(fā)酵和產(chǎn)生酯類物質(zhì)，有利于提高傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味。嗜鹽四聯(lián)球菌在代謝過程中能產(chǎn)生葡聚糖和檸檬酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙酸異戊酯和戊醇等風(fēng)味物質(zhì)[61]。嗜鹽四聯(lián)球菌與植物乳桿菌(L.plantarum)共同發(fā)酵可產(chǎn)生優(yōu)良的風(fēng)味[62]，在傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中起著重要的作用。傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵原料主要影響初級代謝物，而發(fā)酵時間對次級代謝物的影響最大，傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵末期各種風(fēng)味變化趨于平衡。鄧維琴等[63]研究發(fā)現(xiàn)長時間發(fā)酵的傳統(tǒng)豆醬(54，96個月)營養(yǎng)價值和風(fēng)味更佳，但是其安全性還需要進(jìn)一步研究。

霉菌、酵母菌和乳酸菌的動態(tài)變化為傳統(tǒng)豆醬提供了多樣的風(fēng)味物質(zhì)，傳統(tǒng)豆醬中其他微生物的演替也會影響傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味。安飛宇等研究發(fā)現(xiàn)醬醅中還存在大量的葡萄球菌屬，能夠增強(qiáng)傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味。通過轉(zhuǎn)錄組和代謝產(chǎn)物的聯(lián)合分析，確定了以蛋白原酶乳桿菌(L.rennini)、嗜鹽四聯(lián)球菌、酸魚乳桿菌(L.acidipiscis)、糞腸球菌(E.faecalis)、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和黃曲霉(A.flavus)為特征風(fēng)味微生物。解淀粉芽孢桿菌被發(fā)現(xiàn)主要有助于酸類、含硫化合物和吡嗪的積累，與耐鹽酵母菌共同作用可以獲得更廣泛的香氣特征，特別是豐富的醬香和果香[64]。

5 結(jié)語

傳統(tǒng)豆醬的微生物群落復(fù)雜多樣，主要有霉菌、酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌等。在發(fā)酵初期，多由米曲霉、黑曲霉等霉菌來啟動發(fā)酵，發(fā)酵中期，由耐鹽酵母菌和耐鹽乳酸菌來主導(dǎo)發(fā)酵，多種微生物在發(fā)酵過程中相互影響，產(chǎn)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，進(jìn)而影響風(fēng)味物質(zhì)的形成。發(fā)酵后期，各種微生物作用減弱，風(fēng)味體系逐漸平衡，形成特殊的發(fā)酵風(fēng)味。而工廠化豆醬發(fā)酵初期微生物比較單一，雖然霉菌生長旺盛，各種分解酶活性較高而有利于淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子化合物分解，但是從自然環(huán)境中得到的芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌有限，所以其風(fēng)味形成受到了很大的限制。

為了改善傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味，同時保證傳統(tǒng)豆醬的質(zhì)量與安全性，解析傳統(tǒng)豆醬關(guān)鍵發(fā)酵微生物和風(fēng)味物質(zhì)的變化及相關(guān)性，研究復(fù)合菌株發(fā)酵對豆醬的風(fēng)味及品質(zhì)的影響就變得十分重要。多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用能全面地解析發(fā)酵食品的微生物群落和功能，精確定義其香氣和風(fēng)味物質(zhì)。將多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用應(yīng)用于傳統(tǒng)豆醬的研究，將有助于解析傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵機(jī)理及其風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)制，推動傳統(tǒng)豆醬的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。