鑒別牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

趙鐘毅，閉璟珊，尹德瑋，呂蕎，吳健皓，韋正吉，鄒聯(lián)斌，蘇姣秀，汪偉，辛佳亮，彭久青，李文靜，鄭敏，胡傳活

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530000；3.溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所，浙江溫州 325035；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130）

牛結(jié)節(jié)性皮膚?。╨umpy skin disease，LSD）是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起牛的一種急性熱性傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、皮膚水腫及局部有堅(jiān)硬結(jié)節(jié)塊或潰瘍[1-2]。LSDV 同綿羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV）、山羊 痘病 毒（goatpox virus，GTPV）共同組成痘病毒科羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）。LSD暴發(fā)流行可造成養(yǎng)牛業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，因此被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）列為須報(bào)告動(dòng)物疫病，被我國(guó)劃定為二類動(dòng)物疫病。2019年8 月，LSD 疫情在我國(guó)新疆首次暴發(fā)，隨后蔓延到其他多個(gè)地區(qū)[3]。

接種疫苗和精準(zhǔn)診斷是有效防控LSD 的重要措施[4]。目前，我國(guó)主要通過(guò)接種GTPV 弱毒活疫苗預(yù)防LSD。由于LSDV、GTPV 和SPPV 的基因組和編碼蛋白質(zhì)高度相似，在血清學(xué)上尚無(wú)法有效鑒別，因此臨床上有必要建立一種能同時(shí)檢測(cè)并有效鑒別LSDV 和CaPV 其他成員的快速檢測(cè)方法。熒光PCR 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速高效、操作便捷等特點(diǎn)，已成為實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的診斷技術(shù)。本研究針對(duì)LSDV010基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan 探針，與文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)的CaPV068基因通用引物及探針組合，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)并鑒別LSDV 和CaPV 其他成員的雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法，以期為優(yōu)化LSDV 臨床診斷和日常監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒與疫苗

GTPV 疫苗（AV41 株）、痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）天壇株，由軍事獸醫(yī)研究所病毒學(xué)及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；水牛匈奴病毒（buffalo hunnivirus，BufHuV）、牛腸道病毒（bovine enteroviruses，BEV），由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防與傳染病實(shí)驗(yàn)室黃偉堅(jiān)課題組惠贈(zèng)；口蹄疫（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）O 型、A 型二價(jià)滅活疫苗（OHM/02 株+AKT-Ⅲ株），購(gòu)自內(nèi)蒙古必威安泰生物科技有限公司（批號(hào)：HAC220715）；小反芻獸疫（peste des petits ruminants virus，PPRV）活疫苗（Clone9 株），購(gòu)自天康生物制藥有限公司（批號(hào)：2022004-1）；禽痘病毒（fowlpox virus，F(xiàn)WPV）疫苗（282E4株）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）、LSDV 陽(yáng)性樣品核酸、GTPV 陽(yáng)性樣品核酸、542 份臨床樣品，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

TIANamp Virus DNA/RNA Kit（批 號(hào)：MLLTU8428），購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)：AL61653A）、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0（批 號(hào)：AK1801）、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0（批號(hào)：AL61448A）、E.coliDH5α Competent Cells（批 號(hào)：AK71028A）、T-Vector pMDTM19（Simple）（批 號(hào)：AIF1958A）、PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye）（批 號(hào)：AI81195A）、Premix ExTaqTM（Probe qPCR）（批 號(hào)：AL20582A）、dNTP Mixture（批 號(hào)：AM10727A），均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物和探針

下載GenBank 中NI-2490（AF325528.1）、Russia/Saratov/2017（MH646674.1）、China/GD01/2020（MW355944.1）、HongKong/2020（MW732649.1）等流行毒株和疫苗毒株Neethling/OBP（KX764645.1）等38 個(gè)LSDV 毒株及15 個(gè)SPPV、GTPV 毒株的全基因組序列。利用Mega 軟件進(jìn)行序列分析比對(duì)，Oligo7 軟件針對(duì)LSDV010保守區(qū)域設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物及TaqMan 熒光探針。根據(jù)文獻(xiàn)[5]，合成CaPV 通用型引物和MGB 探針（表1）。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病毒核酸提取

根據(jù)TIANamp Virus DNA/RNA Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提樣品中病毒總核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)將抽提的BVDV、BufHuV、BEV、FMDV 和PPRV 的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以抽提的LSDV 基因組為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，建立25.0 μL PCR 反應(yīng)體系：PremixTaqTM12.5 μL、上游引物（10 pmol/μL）1.0 μL、下游引物（10 pmol/μL）1.0 μL、DNA 模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。LSDV010-F/R 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。CaPV068-F/R反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。分別回收純化PCR 產(chǎn)物，與T-Vector pMDTM19（Simple）載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將PCR 鑒定和測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pLSDV-010、pCaPV-068 作為標(biāo)準(zhǔn)品，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用NanoDrop 分光光度儀（Thermo Fisher，USA）測(cè)定重組質(zhì)粒的D260 nm/D280 nm比值和濃度，選擇比值范圍在1.8～2.0的重組質(zhì)粒。根據(jù)公式將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度換算成拷貝數(shù)，質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度×10-9× 6.02×1023/（660×質(zhì)粒長(zhǎng)度）[6]。

1.6 反應(yīng)條件優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

1.6.1 反應(yīng)條件優(yōu)化 將2 對(duì)引物和探針在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增。采用方陣試驗(yàn)分別對(duì)引物終濃度（0.10～0.25 pmol/μL）、dNTP 終濃度、探針終濃度（0.10～0.25 pmol/μL）及退火溫度（56～61 ℃）進(jìn)行篩選優(yōu)化。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 通過(guò)拷貝數(shù)計(jì)算公式，將2 種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pLSDV-010 和pCaPV-068 的拷貝數(shù)濃度均調(diào)整為1.50×1010copies/μL，并以1:1 的比例混合在一起，之后進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇1.50×109～1.50×101copies/μL 9 個(gè)稀 釋梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，利用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)體系繪制擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn)

以FWPV、IBRV、VACV、ORFV 的基因組DNA，BVDV、BufHuV、BEV、FMDV 和PPRV的cDNA 為模板，以LSDV、GTPV 基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O 為陰性對(duì)照，應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法進(jìn)行檢測(cè)，分析其特異性。

1.8 靈敏性試驗(yàn)

以1.50×109～1.50×100copies/μL 10 個(gè)梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)其靈敏性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

以拷貝數(shù)濃度 為1.50×108、1.50×106、1.50×104copies/μL 的混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法擴(kuò)增，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；用同樣方法在不同時(shí)間對(duì)同批次提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行組間重復(fù)性試驗(yàn)。通過(guò)評(píng)估組內(nèi)與組間的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性水平。

1.10 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用本試驗(yàn)建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法對(duì)2017年10 月至2022年11 月在廣西各地區(qū)采集的542 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。以特異性結(jié)果為判定依據(jù)，若檢測(cè)樣品僅有FAM 通道出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線且Ct ≤35，則判定為CaPV 成員病毒核酸陽(yáng)性；若檢測(cè)樣品在FAM 和VIC 通道均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線且Ct ≤35，判定為L(zhǎng)SDV 核酸陽(yáng)性。同時(shí)采用《牛結(jié)節(jié)性皮膚病診斷技術(shù)》（GB/T 39602—2020）[7]及WOAH 推薦[8-9]方法對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定。比較本研究所建方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和WOAH 推薦方法的符合率。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)臨床樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性比較。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定

分別利用LSDV010-F/R 和CaPV068-F/R 對(duì)構(gòu)建的重組陽(yáng)性質(zhì)粒pLSDV-010 和pCaPV-068 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果（圖1～2）顯示，目的DNA 片段分別約為96 bp 和64 bp，與預(yù)期大小相符。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI 公布的CaPV 序列進(jìn)行比對(duì)分析，確認(rèn)為含有目的基因片段的重組陽(yáng)性質(zhì)粒，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pLSDV-010 PCR 鑒定結(jié)果

圖2 pCaPV-068 PCR 鑒定結(jié)果

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)條件優(yōu)化

在優(yōu)化退火溫度、引物和探針濃度后，確定了雙重?zé)晒舛縋CR 方法的最佳反應(yīng)體系（表2）。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。

表2 雙重?zé)晒舛縋CR 最佳反應(yīng)體系

2.3 雙重?zé)晒舛縋CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以1.50×109～1.50×101copies/μL 等9 個(gè)稀釋梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增，得到擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果（圖3）顯示，2 種標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct 值和稀釋滴度對(duì)數(shù)值在1.50×109～1.50×101copies/μL拷貝數(shù)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且陰性對(duì)照未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。相應(yīng)的方程斜率、相關(guān)系數(shù)（R2）和擴(kuò)增效率：pLSDV-010 分別為-3.259，0.998 和102.7%；pCaPV-068 分別為-3.201，0.998 和105.3%。

圖3 雙重?zé)晒舛縋CR 的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn)

以FWPV、IBRV、VACV、ORFV 的基因組DNA，BVDV、BufHuV、BEV、FMDV 和PPRV的cDNA 為模板，以LSDV、GTPV 基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O 為陰性對(duì)照，采用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。結(jié)果（圖4）顯示：只有LSDV 在FAM、VIC 這2 個(gè)熒光通道產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，分別對(duì)應(yīng)CaPV068基因和LSDV010基因；GTPV 僅有FAM 熒光通道產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，對(duì)應(yīng)CaPV068基因；而其他病毒沒(méi)有產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。結(jié)果說(shuō)明，建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法可以特異性鑒別出LSDV，并與CaPV 的其他成員做區(qū)分。

圖4 雙重?zé)晒舛縋CR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 靈敏性試驗(yàn)

以1.50×109～1.5×100copies/μL 等10 個(gè)稀釋梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用于確定雙重?zé)晒舛縋CR 的最低檢出限。結(jié)果（圖5）顯示，pLSDV-010 與pCaPV-068 的最低檢出限均為15 copies/μL，表明該方法靈敏性良好。

圖5 雙重?zé)晒舛縋CR 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

選取3 個(gè)拷貝數(shù)濃度的混合質(zhì)粒（1.50×108、1.50×106、1.50×104copies/μL）評(píng)估建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的重復(fù)性。結(jié)果（表3）顯示，2 種陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的組內(nèi)CV 為0.10%～1.34%，組間CV 為0.30%～1.75%，表明建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法具有良好的重復(fù)性。

表3 雙重?zé)晒舛縋CR 重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)2017年10 月至2022年11 月在廣西各地區(qū)采集的542 份牛羊皮膚結(jié)節(jié)、鼻腔拭子、血清等臨床樣品，應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縋CR 方法進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)利用《牛結(jié)節(jié)性皮膚病診斷技術(shù)》（GB/T 39602—2020）和WOAH 推薦方法對(duì)樣品進(jìn)行同步檢測(cè)。結(jié)果顯示：LSDV 在皮膚結(jié)節(jié)樣品中的檢出率最高，其次是環(huán)境拭子、鼻咽拭子，而血樣品的檢出率較低（表4）；本試驗(yàn)所建方法與參考的檢測(cè)方法所檢出的CaPV 樣品符合率為98.52%，LSDV 為99.63%（表5）。結(jié)果表明本試驗(yàn)所建的檢測(cè)方法結(jié)果可靠，可以用于臨床樣品檢測(cè)。

表4 臨床樣品種類及其陽(yáng)性率

表5 2 種檢測(cè)方法一致性結(jié)果

3 討論

LSD 自1929年在贊比亞被首次發(fā)現(xiàn)后，隨著國(guó)際貿(mào)易往來(lái)已陸續(xù)傳播至非洲南部、歐洲以及亞洲等多個(gè)地區(qū)[10-11]。2019年LSDV首次擴(kuò)散到我國(guó)，2020—2021年我國(guó)多個(gè)省份以及香港和臺(tái)灣等地區(qū)已有報(bào)道[12-14]。越南、泰國(guó)等東南亞國(guó)家也陸續(xù)出現(xiàn)LSD 疫情[15-16]。目前，基于熒光PCR 技術(shù)建立LSDV 鑒別診斷方法成為各國(guó)研究熱點(diǎn)[17-20]。例如，Wang[20]等針對(duì)RPO30基因，建立了能鑒別LSDV、GTPV 和SPPV 的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，可檢測(cè)到102copies/μL 的病毒DNA。

2019年起，我國(guó)批準(zhǔn)在LSD 流行地區(qū)使用GTPV 弱毒疫苗進(jìn)行免疫。本課題組在開(kāi)展臨床監(jiān)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分免疫動(dòng)物樣本可檢出GTPV 核酸，但若使用CaPV 通用型引物和探針檢測(cè)，則可能造成誤診。因此，有必要研制一種能同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分LSDV 和CaPV 其他成員的鑒別診斷方法。通過(guò)基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，LSDV010編碼區(qū)極為保守，并與SPPV、GTPV 的相同區(qū)域存在較大差異；而LSDV068基因與CaPV 其他成員的核苷酸同源性大于99.0%[5]?；谏鲜鼋Y(jié)果，本試驗(yàn)選擇LSDV010基因設(shè)計(jì)LSDV 特異性引物和TaqMan 探針，并結(jié)合CaPV068基因的通用型引物和MGB 探針，經(jīng)過(guò)優(yōu)化各種反應(yīng)條件，建立了雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法。該方法最低檢出限為15 copies/μL，優(yōu)于Wang[20]等建立的方法。應(yīng)用本試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)542 份臨床樣品，共檢出LSDV 陽(yáng)性樣品23 份（4.24%）、CaPV 陽(yáng)性樣品30 份（5.54%），與LSDV 和CaPV 參照方法的符合率分別為99.63%和98.52%。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LSDV 在皮膚結(jié)節(jié)樣品中的檢出率最高，其次是環(huán)境拭子、鼻咽拭子，而血樣品的檢出率較低。這是因?yàn)長(zhǎng)SD 對(duì)于皮膚組織的嗜性強(qiáng)以及可以持續(xù)在皮膚中維持高濃度，與El-Mandrawy等[21]研究結(jié)果一致。另外，在環(huán)境樣品中檢出LSDV，說(shuō)明無(wú)論是對(duì)于個(gè)體養(yǎng)殖戶還是規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)，環(huán)境清潔與消毒是有效防控LSD傳播的重要手段。

4 結(jié)論

本研究建立了一種可同時(shí)檢測(cè)并鑒別LSDV和CaPV 其他成員的雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法。該方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，為開(kāi)展LSDV、CaPV 鑒別篩查，LSDV 精準(zhǔn)防控及相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查提供了快捷有效的技術(shù)手段。