炭疽桿菌雙毒力因子熒光PCR 檢測方法的建立及應用

熊煒，孫思揚，韓偉，李深偉，薛蓓蕾，田楨干

（1.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135；2.南昌海關技術中心，江西南昌 330038；3.上海國際旅行衛(wèi)生保健中心，上海 200335）

由炭疽桿菌（Bacillus anthracis）引起的炭疽（anthrax）是嚴重危害人類和家畜健康的一種古老疫病，以急性、熱性、敗血性感染為主要特征。炭疽在世界各國均有發(fā)生，呈地方性流行或散發(fā)，各種家畜、野生動物和人類都有不同程度的易感性[1]。炭疽芽胞有很強的抵抗力，在干燥的土壤中可存活數(shù)十年之久。依據(jù)侵染途徑不同，炭疽可分為3 種類型：皮膚性炭疽、吸入性炭疽和胃腸道炭疽[2]。近年來，我國不時有炭疽感染的報道。2017—2019年，我國共報道951 例炭疽病例，其中938 例是皮膚炭疽，占98.63%[3]；2010—2019年，云南省共報告94 例人間炭疽病例[4]；寧夏是我國炭疽的高發(fā)地區(qū)，2019—2022年分離的毒株均為強毒株[5]；2021年山東出現(xiàn)人間炭疽病例[6]；2022年陜西省延長縣發(fā)生22 頭豬感染炭疽桿菌死亡事件[7]。

炭疽致死的主要原因是炭疽桿菌在血液中大量增殖并產(chǎn)生毒素。炭疽毒素由3 種毒力因子組成，分別為保護性抗原（protective antigen，PA）、致死因子（lethal factor，LF）和水腫因子（edema factor，EF），均由pOX1 質(zhì)粒所編碼。這些毒力因子相互協(xié)同入侵機體，引起嚴重的病理性損害[8-9]。pOX2 質(zhì)粒負責編碼莢膜蛋白，可抵御炭疽桿菌繁殖體被機體吞噬。pOX1 和pOX2 質(zhì)粒任缺其一，都將大大降低炭疽桿菌的致病力[10]。

炭疽桿菌常用的檢測方法有細菌培養(yǎng)、Ascoli沉淀試驗、莢膜免疫熒光檢測、抗體ELISA 檢測、PCR、熒光量子點免疫標記法、RPA 等溫擴增、上轉磷光免疫層析技術等[11-15]。其中，熒光PCR 方法具有特異性強、靈敏度高、準確性好等優(yōu)點。為了提高我國出入境口岸對不明粉未快件樣品的查驗效率，防范郵遞樣品的炭疽攻擊，本研究使用TaqMan 探針技術，建立了針對炭疽桿菌兩種毒力質(zhì)粒pOX1 和pOX2 的雙重熒光PCR 檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性進行了試驗，以期為炭疽的精準防控提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

細菌DNA 提取試劑盒（HiPure Bacterial DNA kit），購自廣州美基生物科技有限公司；熒光PCR 通用試劑（Premix ExTaq），購自寶生物工程（大連）有限公司。熒光PCR 儀（QuantStudio 7 Flex），購自美國ABI 公司。

1.2 質(zhì)粒和細菌

含炭疽桿菌pOX1 和pOX2 保守序列的質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌、銅綠假單胞菌、螺桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、化膿棒狀桿菌、肺炎克雷伯菌、支氣管鮑特桿菌、無乳鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌，由上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心微生物室保存；產(chǎn)氣莢膜梭菌、布魯氏菌、豬丹毒桿菌、副豬噬血桿菌，由南昌海關技術中心提供。

1.3 細菌核酸提取

取500 μL 細菌培養(yǎng)液，按照細菌DNA 提取試劑盒要求進行核酸抽提，最后將DNA 用50 μL水溶解作為模板，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物和探針

使用Vector NTI Suite 軟件分析GenBank 上公布的炭疽桿菌毒力質(zhì)粒pOX1 和pOX2 的基因序列，選擇保守區(qū)域，使用Primer Express 軟件設計引物和TaqMan 探針（表1）。

表1 引物和探針序列

1.5 檢測體系和反應條件

雙重熒光PCR 檢測體系：2×Premix ExTaq緩沖液10.0 μL、pOX1 和pOX2 質(zhì)粒正反向引物（30 μmol/L）各0.4 μL、pOX1 和pOX2 質(zhì)粒探針（30 μmol/L）各0.3 μL、待檢核酸模板3.0 μL，加水補足總體積至20.0 μL。單重熒光PCR 檢測體系：2×Premix ExTaq緩沖液10.0 μL、pOX1 或pOX2 質(zhì)粒正反向引物（15 μmol/L）各0.8 μL、pOX1 或pOX2 質(zhì)粒探針（15 μmol/L）0.6 μL、待檢核酸模板3.0 μL，加水補足總體積至20.0 μL。雙重和單重熒光PCR 反應條件均為95℃ 3 min；95℃ 10 s、60℃ 30 s（收集熒光信號），共45 個循環(huán)。

1.6 特異性試驗

采用建立的雙重熒光PCR 方法分別檢測炭疽桿菌pOX1 和pOX2 質(zhì)粒以及金黃色葡萄球菌等19 種對照病原菌，驗證該方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗

將炭疽桿菌pOX1 和pOX2 質(zhì)粒依次10倍比稀釋至拷貝數(shù)濃度為1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL，采用建立的雙重熒光PCR 方法和單重熒光PCR 方法同時進行檢測，以水為陰性對照，驗證該方法的靈敏性。

1.8 穩(wěn)定性試驗

配制雙重熒光PCR 反應體系，均分為4 份后凍存。每間隔2 個月取出1 份，用于pOX1 和pOX2 質(zhì)粒及48 份陰性組織樣本檢測，驗證該方法的穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品檢測

采用建立的雙重熒光PCR 方法分別對口岸入境的200 份豬肉樣本、200 份牛肉樣本和200 份羊肉樣本進行炭疽桿菌核酸檢測。

2 結果

2.1 特異性試驗

采用建立的雙重熒光PCR 方法，同時用于炭疽桿菌毒力質(zhì)粒pOX1 和pOX2 和其他對照病原菌的檢測。結果（圖1）顯示，僅pOX1 和pOX2 質(zhì)粒出現(xiàn)陽性擴增曲線，其余對照菌均未出現(xiàn)擴增曲線。

圖1 特異性試驗結果

2.2 靈敏性試驗

將炭疽桿菌毒力質(zhì)粒pOX1 和pOX2 分別進行10 倍比稀釋，同時用建立的雙重熒光PCR和單重熒光PCR 方法進行檢測。結果（圖2）顯示，雙重熒光PCR 和單重熒光PCR 方法對pOX1 和pOX2 質(zhì)粒的最低檢測限均為1×101copies/μL。

圖2 靈敏性試驗結果

2.3 穩(wěn)定性試驗

結果顯示，4 個保存反應體系擴增陽性質(zhì)粒的Ct 值和峰值幾乎一致，而所有陰性樣品均未出現(xiàn)擴增曲線。

2.4 臨床樣品檢測

結果顯示，僅陽性對照出現(xiàn)典型“S”形擴增曲線，600 份豬牛羊肉組織樣本中均未檢出炭疽桿菌陽性核酸。

3 討論

炭疽桿菌可以形成抵抗力強且長期存活的芽孢，因而被芽孢污染的溪谷、灘地、凹地和草場等環(huán)境可能會成為炭疽的自然疫源地。炭疽的流行有明顯的季節(jié)性，常流行于夏季，特別是在大降雨之后，雨水容易將環(huán)境中的炭疽芽孢沖刷出來，使得放牧牲畜接觸炭疽芽胞的概率增加，從而造成炭疽暴發(fā)或流行。炭疽桿菌是嚴重威脅公眾健康的致病菌之一，因此建立一種快速準確的檢測方法，是迅速發(fā)現(xiàn)并控制病原擴散的有效手段。針對我國出入境郵件包裹中不明來源的粉未開展炭疽桿菌快速檢測，既保證了正常郵件快速通關，又可防范通過郵件引發(fā)的惡意恐怖事件。

基于此，本研究建立了針對炭疽桿菌毒力質(zhì)粒pOX1 和pOX2 的雙重熒光PCR 檢測方法。同時檢測2 種炭疽桿菌靶基因，既保證了檢測結果的可靠性，又能對炭疽桿菌的毒力進行預判，為后繼的處置提供更多參考。雙重熒光PCR 方法可能存在2 套檢測體系在同一反應管內(nèi)相互干擾的情況，本研究分別比較了雙重和單重體系檢測同一份樣品的靈敏性，發(fā)現(xiàn)雙重檢測體系與單重檢測體系的最低檢測限一致。另外，如果檢測過程中出現(xiàn)單一通道陽性的情況，那么首先應當考慮復檢。復檢時應重新提取核酸，并盡可能增加樣本提取量及模板添加量（減少水的補充），以確認疑似樣品是否為單一質(zhì)粒陽性。如果確認為單一質(zhì)粒陽性，可以初步判定為低致病性炭疽桿菌[10]。為了保證檢測結果的可靠性，本研究還驗證了該方法的特異性和穩(wěn)定性。結果顯示：19 種對照病原菌均未出現(xiàn)擴增曲線，說明特異性較強；低溫保存2、4、6、8個月的反應體系擴增陽性質(zhì)粒的Ct 值和峰值幾乎一致，說明穩(wěn)定性良好。

綜上所述，本研究建立的炭疽桿菌雙重熒光PCR 檢測方法特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可滿足國境口岸對動物源性產(chǎn)品和國際郵件樣品中炭疽桿菌檢疫排查的需求。