豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫保護(hù)機(jī)制及疫苗研究進(jìn)展

翟崇凱，毛福超，張賀偉

（河南省動物疫病與公共衛(wèi)生工程研究中心，洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品學(xué)院，河南洛陽 471003）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染所致的一種豬急性高度接觸性傳染病。PRRSV 主要在豬肺泡和淋巴器官巨噬細(xì)胞中復(fù)制，引起母豬繁殖障礙、仔豬與育肥豬呼吸系統(tǒng)疾病，是我國優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的動物疫病之一[1]。近年來，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS）頻發(fā)、死亡率高，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展[2]。PRRS 在全球大多數(shù)國家廣泛流行，流行毒株為PRRSV-1（歐洲種）和PRRSV-2（美洲種）。這兩種基因型的核苷酸序列同源性約為60%，同一種屬內(nèi)不同毒株核苷酸序列的變異率高達(dá)20%[3]。PRRSV 不同種之間存在顯著的抗原性差異，交叉反應(yīng)少。PRRSV 具有毒株多樣性、基因易重組、抗體依賴增強(qiáng)效應(yīng)（antibody-dependent enhancement，ADE）、中和抗體延遲效應(yīng)、免疫抑制等復(fù)雜特點(diǎn)，導(dǎo)致目前PRRS 防控存在巨大困難和挑戰(zhàn)[4]。專家學(xué)者對PRRSV 病原學(xué)、進(jìn)化和宿主免疫反應(yīng)等進(jìn)行了深入研究，但不斷出現(xiàn)的新PRRSV 變異毒株，使得目前獲得許可的疫苗在安全性和有效性方面存在一些問題，如毒力返強(qiáng)，不能產(chǎn)生針對異源病毒的交叉保護(hù)性免疫[5]。因此，只有密切關(guān)注PRRSV 流行變異情況，深入探究其免疫逃避和調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，才能靶向開發(fā)出更安全更有效的疫苗。本文歸納了PRRSV 誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答機(jī)制，總結(jié)了目前PRRSV 疫苗研究進(jìn)展和面臨的挑戰(zhàn)，以期為PRRSV 新型疫苗研發(fā)提供參考。

1 國內(nèi)外流行毒株的重組進(jìn)化和抗原變異

至今，PRRSV的起源仍然是未知的。北美（1987年）最早報道了PRRS，西歐（1990年）緊隨其后也暴發(fā)了PRRS。此后，PRRS 隨著商貿(mào)交通運(yùn)輸?shù)韧緩窖杆僭谌澜绶秶鷥?nèi)廣泛流行[5]。1991年，荷蘭首次分離鑒定了PRRSV。回顧性研究表明，PRRSV 抗體陽性樣本早在1979年就已存在，證實(shí)了PRRSV 在PRRS 被報道之前就已在豬群中傳播多年。自PRRSV 被報道以來，PRRSV 毒株不斷進(jìn)化，其毒力和致病性各不相同[6]。PRRSV-1和PRRSV-2 在豬群中不斷進(jìn)化，逃避宿主免疫系統(tǒng)，并不斷重組變異產(chǎn)生新的毒株，導(dǎo)致疫情新發(fā)。盡管PRRSV-1 的多樣性不如PRRSV-2，但進(jìn)化方式基本相同，一些毒株的致病性也越來越強(qiáng)[7]。1996年P(guān)RRSV-2 強(qiáng)毒株VR2385 在原型毒株VR2332 報道后不久便被分離出來，其核苷酸序列與VR2332 的變異率約為8%[8]。2001年，美國鑒定出高毒力MN184 毒株，基因組核苷酸變異率約為14.5%[9]。2006年，中國南部和越南北部以及印度等地發(fā)現(xiàn)了HP-PRRSV。2008年美國首次發(fā)現(xiàn)了PRRSV-2 NADC30 毒株，隨后我國也分離出了類NADC30 毒株[10-11]。2010年，研究人員發(fā)現(xiàn)我國流行的PRRSV-1 高致病性毒株與PRRSV-1 原型毒株Lelystad 的核苷酸同源性僅為87%[11]。2020年，美國新發(fā)現(xiàn)了“高致病性”PRRSV 毒株（即PRRSV 1-4-4 L1C），該毒株具有RFLP 模式1-4-4，作為1C 譜系中的新型變體，與我國NADC34 毒株屬于同一亞型分支，致死率達(dá)17.5%[12]。

目前我國流行的PRRSV 以PRRSV-2 毒株為主，其致病性和基因組變異呈現(xiàn)多樣性。PRRSV-2至少可以分為5 個亞群，其中大多數(shù)毒株屬于亞群3[13]。1996年我國首次分離到PRRSV-2 毒株CH-1a[14]。2012年我國首次報道類NADC30 毒株[15]，2015年我國首次分離到類NADC30 毒株JL580[16]，并對其致病性進(jìn)行了分析研究；自2016年以來，類NADC30 毒株已經(jīng)成為我國最主要的流行毒株，檢出率超過60%，類HP-PRRSV 次之[17]。此外，我國類NADC30 毒株基因組復(fù)雜，容易與類HP-PRRSV 毒株發(fā)生重組，且部分毒株為高致病性毒株，這大大增加了類NADC30 毒株感染的防控難度[18-20]。2017年我國首次報道在遼寧省豬群出現(xiàn)類NADC34 PRRSV 感染病例，隨后在黑龍江、福建、遼寧和河南4 個省份相繼發(fā)現(xiàn)類NADC34 PRRSV 感染病例[21-22]。近年來類NADC34 PRRSV 檢出比例在持續(xù)增加，從2017—2019年的陽性檢出率不足3%，驟升至2020年的11.5%，2021年高達(dá)28.6%，與類NADC30（35.4%）和HP-PRRSV（31.2%）共同成為我國的主要流行毒株[21，23]。研究[21]表明，我國部分新發(fā)類NADC34 PRRSV 與國內(nèi)流行毒株類NADC30 和類HPPRRSV 發(fā)生了復(fù)雜的基因重組，這可能是導(dǎo)致類NADC34 毒株在我國快速蔓延的原因之一。綜上所述，近來報道的致病性類NADC30 和類NADC34毒株在我國廣泛傳播，且變異重組速率較快。因此，需要對新發(fā)PRRSV 加大監(jiān)測力度和防控措施，從而降低新發(fā)毒株對養(yǎng)豬業(yè)的危害。

2 毒株生物學(xué)特性及中和抗原表位

PRRSV 是一種正鏈包膜RNA 病毒，屬于套式病毒目動脈病毒科β 動脈炎病毒屬[24]。PRRSV基因組大小約為15 kb，有10 個開放閱讀框（ORF），復(fù)制酶基因位于5'端，結(jié)構(gòu)蛋白基因位于3'端。非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因ORF1a 和ORF1b 占病毒基因組全長的2/3，分別編碼具有病毒復(fù)制酶和RNA聚合酶功能的2 個復(fù)制酶多聚蛋白（replicase pp1a and pp1ab），隨后在體內(nèi)多聚蛋白被蛋白水解酶裂解為16 個非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NSP）：NSPlα、NSP1β、NSP2、NSP2TF、NSP2N、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7α、NSP7β 和NSP8～12。這些蛋白大多數(shù)組裝形成與膜相關(guān)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白包括包膜糖蛋白（glycoprotein，GP）、膜蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N），其中GP 包括GP2a-b、GP3、GP4、GP5 和GP5a。PRRSV 編碼的7 種糖蛋白中4 種為GP，即GP2a（ORF2a）、GP3（ORF3）、GP4（ORF4）和GP5（ORF5）[25]。

中和抗體是機(jī)體抵御病毒入侵的一類免疫球蛋白，也是疫苗發(fā)揮作用的主要效應(yīng)分子。宿主和病毒結(jié)構(gòu)/非結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用會影響病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及免疫逃逸，只有更好地了解PRRSV 免疫應(yīng)答和免疫逃避的分子機(jī)制，才能設(shè)計出更有效的疫苗。病毒結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞受體之間的相互作用決定了病毒的組織嗜性和宿主范圍。目前PRRSV 的感染機(jī)制還不清楚。PRRSV 感染宿主細(xì)胞依靠特定的細(xì)胞受體和內(nèi)吞作用來完成病毒的生命周期。目前已報道了4 種PRRSV 細(xì)胞受體，即唾液酸黏附素、硫酸乙酰肝素、波形蛋白和清道夫受體CD163（cluster of differentiation 163，CD163）。唾液酸黏附素介導(dǎo)PRRSV 的內(nèi)化，它與M/GP5 復(fù)合物相互作用；硫酸乙酰肝素作為PRRSV 主要的附著因子，吸附PRRSV 到巨噬細(xì)胞上；CD163 協(xié)助波形蛋白促進(jìn)病毒脫殼和內(nèi)化，在PRRSV 感染過程中發(fā)揮重要作用[26-28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)，CD163 單克隆抗體能夠通過阻斷受體和抑制轉(zhuǎn)錄來降低PRRSV 的感染程度。PRRSV 感染豬2～4 周后才能檢測到中和抗體，表明病毒可以利用各種途徑逃避宿主的免疫監(jiān)控，延遲宿主免疫應(yīng)答。感染豬體內(nèi)的PRRSV 要完全被清除需要150 d 或更長的時間[30-32]。

GP5 是一種高度糖基化蛋白，被認(rèn)為是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要蛋白靶點(diǎn)，也是第一個被鑒定出線性病毒中和表位的蛋白（37～45 aa），隨后在該蛋白的N 端胞外域也發(fā)現(xiàn)了具有中和活性的表位（32～34、38～39 和57～59 aa）[33]。病毒主要的中和作用關(guān)鍵位點(diǎn)在GP5 蛋白上的N 端功能區(qū)，而該功能區(qū)能夠通過“誘騙”表位和異質(zhì)的糖基化作用隱藏關(guān)鍵性中和作用位點(diǎn)，從而阻礙或降低了機(jī)體針對病毒GP5蛋白中和表位的體液免疫反應(yīng)。這種N 端聚糖遮蔽中和作用的特點(diǎn)是病毒免疫逃避及形成持續(xù)性感染的主要機(jī)制之一[34]。GP5 是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體能力最強(qiáng)的蛋白，此外其他結(jié)構(gòu)蛋白如GP2、GP3、GP4 以及M 都存在病毒中和表位，具有病毒中和能力[35-36]。

前期研究[37]認(rèn)為，PRRSV 感染早期由非結(jié)構(gòu)蛋白2（non-structural protein 2，NSP2）和N 蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體不具有中和能力。但越來越多的研究[38-40]表明，NSP2 除了參與病毒復(fù)制和變異，還參與宿主免疫調(diào)控和誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。NSP2作為PRRSV 最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，變異性較高，特別是中間高變區(qū)域。PRRSV-1 和PRRSV-2 毒株均能夠發(fā)生NSP2 高變區(qū)氨基酸缺失，該現(xiàn)象與PRRSV 毒株進(jìn)化和抗原變異密切相關(guān)。與PRRSV其他結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白相比，NSP2 含有多個免疫顯性線性B 細(xì)胞表位，這些表位與病毒自然缺失或插入以及多變性有關(guān)，推測這些區(qū)域還有可能存在T 細(xì)胞表位[41-42]。NSP2 雖不是結(jié)構(gòu)蛋白，但在病毒粒子內(nèi)部和表面均發(fā)現(xiàn)NSP2 亞型分子結(jié)構(gòu)，尤其是在病毒雙膜囊泡（double-membrane vesicle，DMV）中的成熟和組裝過程中發(fā)揮著重要作用[43]。

NSP9 蛋白N 端與NSP8 相連，包含1 個與腺病毒RdRp 相關(guān)的核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（NiRAN），C 端包含RdRp 結(jié)構(gòu)域，其在PRRSV 的復(fù)制和毒力中起著至關(guān)重要的作用[44]。NSP9 序列高度保守，具有較強(qiáng)的免疫原性，含有T 細(xì)胞表位，有利于未來疫苗的開發(fā)。Parida等[45]在NSP9 中發(fā)現(xiàn)了兩個高度保守的七肽T 細(xì)胞表位，這為開發(fā)能夠?qū)Ω鞣NPRRSV 毒株提供廣泛交叉保護(hù)的免疫制劑提供了重要參考。此外，NSP9 的晶體結(jié)構(gòu)作為肽疫苗研究的靶點(diǎn)，在新型肽疫苗開發(fā)中發(fā)揮著重要的作用[46]。PRRSV 結(jié)構(gòu)/非結(jié)構(gòu)蛋白的功能及其誘導(dǎo)中和抗體的作用見表1。

表1 PRRSV 結(jié)構(gòu)/非結(jié)構(gòu)蛋白的功能及其誘導(dǎo)中和抗體的作用

3 已獲批準(zhǔn)的商業(yè)疫苗和正在研究的疫苗

PRRSV 疫苗主要包括改良活病毒疫苗（modified live virus，MLV）、滅活病毒疫苗、基因工程疫苗和免疫佐劑疫苗等。然而，已獲許可的商用疫苗的持久性和有效性均存在較多問題。尤其是，疫苗對國內(nèi)新發(fā)類NADC30 和類NADC34毒株保護(hù)作用有限。此外，2021年在山東省新發(fā)現(xiàn)的TZJ2134 毒株，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)它是由2 株商業(yè)PRRSV-1 活疫苗（Amervac 疫苗株和DV 疫苗株）基因重組后的新毒株類DV+Amervac 重組亞群。目前MLV 1 疫苗不允許在我國使用，提示國內(nèi)PRRSV-1 流行防控也面臨著巨大壓力[47]。鑒于PRRSV 高頻突變和重組，致使變異毒株不斷出現(xiàn)，現(xiàn)有疫苗無法提供完全保護(hù)，使得PRRSV 在全球范圍內(nèi)廣泛流行。因此，需要繼續(xù)開發(fā)新的有效的疫苗來靶向不斷進(jìn)化的PRRSV，這是重要的PRRS 防控措施。近年來，多種新技術(shù)被用于開發(fā)新型PRRSV 疫苗，尤其是嵌合疫苗、肽疫苗和納米疫苗，為未來PRRSV 疫苗設(shè)計提供了新思路。已獲批準(zhǔn)的商業(yè)疫苗和正在研究的PRRSV 疫苗詳見表2。

表2 已獲批準(zhǔn)的商業(yè)疫苗和正在研究的PRRSV 疫苗

3.1 MLV 疫苗

1994年，北美首次引入了基于PRRSV-2 的MLV 疫苗，幾年后歐洲引入了基于PRRSV-1 的MLV 疫苗?；赑RRSV-1 開發(fā)的MLV 1 疫苗，主要在西歐PRRSV-1 流行的國家獲得許可。而基于PRRSV-2 開發(fā)的MLV 2 疫苗，主要在美國、中國和韓國等PRRSV-2 流行國家獲得許可[48]。MLV疫苗免疫作為控制PRRSV 感染的主要手段，已經(jīng)在臨床上應(yīng)用了20 多年。盡管MLV 疫苗對部分毒株具有良好的保護(hù)效果，但疫苗的免疫原性、交叉保護(hù)效果和安全性仍是臨床上十分突出的問題，其對PRRS 防控效果有限[49-50]。

MLV 疫苗能夠?qū)ν碢RRSV 毒株引起的感染提供有效但滯后的保護(hù)，而對異源毒株僅提供部分保護(hù)或完全沒有保護(hù)，其保護(hù)效力取決于PRRSV 毒株的生物學(xué)特性[51-52]。MLV 疫苗的毒力返強(qiáng)和持續(xù)傳播感染在臨床上受到高度關(guān)注，這可能會加速病毒突變或重組以適應(yīng)宿主并逃避免疫反應(yīng)，增加致病風(fēng)險。目前已證實(shí)接種MLV 疫苗的豬群會出現(xiàn)長達(dá)4 周的病毒血癥期，導(dǎo)致疫苗毒在未接種豬群間垂直和水平傳播[53]。此外，有報道[54-56]稱，MLV 疫苗株能夠與野生毒株發(fā)生基因重組，這加劇了MLV 疫苗潛在的生物安全性問題。

大多數(shù)亞洲國家（如中國和韓國）的PRRSV-1 和PRRSV-2 均為致病性流行毒株，如果聯(lián)合接種MLV 1 和MLV 2 疫苗，可能會顯著降低MLV 2 疫苗的保護(hù)效力[48]。因此，需要科學(xué)制定MLV 疫苗的接種程序。研究[57]表明，弱毒疫苗免疫豬群后攻毒PRRSV，未觀察到ADE 效應(yīng)。但由于PRRSV 存在ADE 效應(yīng)，因此部分學(xué)者依然認(rèn)為MLV 疫苗可能誘導(dǎo)ADE 效應(yīng)，增加豬群PRRSV 的感染風(fēng)險[58-59]。MLV 疫苗接種后首先產(chǎn)生的PRRSV 特異性抗體大多是非中和性抗體，可能存在潛在ADE 的窗口期。若在ADE 窗口期發(fā)生PRRSV 感染，這些免疫早期產(chǎn)生的非中和性抗體可能會誘發(fā)ADE 并加劇感染程度，目前MLV疫苗誘導(dǎo)ADE 的機(jī)制尚不清楚[5]。

將國內(nèi)流行的類NADC30 SD 毒株在Marc-145 細(xì)胞中連續(xù)傳代獲得減毒SD-R 毒株，將其免疫接種豬群2 周后，用類NADC30 PRRSV 攻毒未發(fā)現(xiàn)明顯發(fā)熱，免疫組病理病變程度較攻毒對照組更輕，病毒滴度明顯低于攻毒對照組[60]。上述結(jié)果提示，可以通過定向減弱特定地區(qū)流行毒株來進(jìn)行PRRSV 疫苗毒株的篩選，從而使疫苗能為特定流行地區(qū)的仔豬提供完全的臨床保護(hù)，以抵抗區(qū)域性PRRSV 傳播。另有研究[61]表明，Prevacent PRRS MLV 疫苗對NC174 或NADC30（均為譜系1）、VR2332（譜系5）或NADC20（譜系8）PRRSV-2 毒株中的3 種（NADC20、NADC30 和VR2332）均誘導(dǎo)產(chǎn)生了中和抗體，但未能完全保護(hù)豬群免受感染。盡管目前使用的MLV 疫苗免疫后均無法完全阻止PRRSV 感染，交叉保護(hù)效力不足，但其能在一定程度上降低病毒滴度，縮短排毒時間。

為了提高M(jìn)LV 疫苗的免疫保護(hù)效力，評估了多種策略的增強(qiáng)效果，如佐劑類型和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑（如中藥提取物）。Montanide TM gel01 佐劑能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的PRRSV 特異性中和抗體，增強(qiáng)疫苗對同源PRRSV 的保護(hù)效果。新型肽納米纖維水凝膠能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高滴度的中和抗體和更強(qiáng)的IFN-γ 細(xì)胞免疫反應(yīng)，使得新型肽納米纖維水凝膠成為MLV 疫苗的良好佐劑[62]。魚腥草提取物顯著提高了PRRSV-1 MLV 疫苗IFN mRNA 表達(dá)水平，并降低HP-PRRSV-2 攻毒后的病毒血癥[63]。此外，目前常用的另一種增強(qiáng)策略是通過基因工程構(gòu)建嵌合疫苗，從而定制MLV 疫苗。

3.2 滅活疫苗

滅活疫苗盡管安全性較高，已在世界范圍內(nèi)獲得許可，但其對同源和異源病毒的保護(hù)效力卻非常有限。研究[64]發(fā)現(xiàn)，滅活疫苗不足以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠的特異性中和抗體，中和抗體滴度通常低于8，且無法誘導(dǎo)或僅誘導(dǎo)微弱的細(xì)胞免疫反應(yīng)，不能有效清除病毒。因此，美國等多數(shù)西方國家均不再提供該類疫苗[51]。但有研究[65]表明，滅活疫苗在防控PRRS 的垂直和水平傳播中發(fā)揮著重要作用。PRRSV 血清陽性的母豬反復(fù)暴露或長期免疫滅活病毒能夠增強(qiáng)機(jī)體抗PRRSV 免疫力，且能夠顯著提高母豬繁殖性能。與活疫苗相比，滅活疫苗具有更安全、更穩(wěn)定、更容易儲存等特點(diǎn)[66]。養(yǎng)殖場自家滅活疫苗能夠有效減輕臨床癥狀，縮短病毒血癥期。部分科學(xué)家對PRRSV 滅活疫苗充滿了信心，通過嘗試不同的病毒滅活策略、佐劑、基于納米顆粒的疫苗傳遞系統(tǒng)及接種方式等，以期研發(fā)出高效的PRRSV 滅活疫苗。

將PRRSV 滅活疫苗與CpG 寡脫氧核苷酸佐劑共同免疫豬群，可誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體、細(xì)胞免疫應(yīng)答以及促進(jìn)IFN-γ 和IL-6 的分泌[67]。研究[68]表明：將通過紫外線照射和二乙基亞胺（BEI）不同滅活途徑滅活的PRRSV 與水包油佐劑混合后制成的滅活疫苗均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；而通過BEI 滅活的PRRSV 與不完全弗氏佐劑制成的滅活疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，且能夠?qū)⒉《狙Y期縮短1 周。目前尚無理想的PRRSV 滅活疫苗，主要是因?yàn)镻RRSV滅活疫苗無法高效遞呈抗原至免疫系統(tǒng)。近年來，納米技術(shù)在疫苗研發(fā)中被廣泛應(yīng)用，這是利用了納米技術(shù)能夠提高抗原遞呈效率的特點(diǎn)，從而大大提升PRRSV 滅活疫苗的保護(hù)效力。Binjawadagi等[69]利用納米顆粒包裹PRRSV 滅活毒株與佐劑聚乳酸-乙醇酸或結(jié)核分枝桿菌裂解物制成納米滅活疫苗，鼻內(nèi)接種免疫豬群后能夠?qū)Ξ愒碢RRSV毒株產(chǎn)生較好的交叉保護(hù)效果。Chaikhumwang等[70]也研究證實(shí)了聚乳酸（PLA）納米顆粒能夠增強(qiáng)滅活疫苗的免疫效果。因此，基于納米顆粒的疫苗傳遞系統(tǒng)為增強(qiáng)滅活PRRSV 疫苗的免疫效果提供了新思路。

3.3 嵌合疫苗

自1998年P(guān)RRSV 反向遺傳系統(tǒng)被報道以來，研究人員通過定點(diǎn)誘變，刪除病毒基因或基因片段，插入外源基因，以及在PRRSV 毒株之間或PRRSV 與其他病原之間交換基因片段，已經(jīng)構(gòu)建了眾多的PRRSV 感染性cDNA 克隆以及嵌合毒株。嵌合疫苗能有效解決PRRSV 異源毒株交叉保護(hù)率低的問題，與其他毒株重組率低，較MLV 疫苗更安全。

PC 嵌合疫苗含有鑒別診斷（DIVA）的基因標(biāo)記，能夠鑒別PRRSV 野毒和疫苗株。通過將PRRSV SP 經(jīng)典株的非結(jié)構(gòu)蛋白基因和HP-PRRSV GD 毒株的結(jié)構(gòu)蛋白基因整合，利用反向遺傳技術(shù)拯救出PRRSV 嵌合疫苗株。PC 疫苗安全性良好，未見水平傳播、排毒和毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，是一種較為安全的PRRSV 嵌合疫苗[71]。將假單胞菌氨基酸序列KDEL（K3）整合入PRRSV 基因片段中，構(gòu)建的嵌合疫苗PE-K13 能夠有效誘導(dǎo)豬產(chǎn)生特異性中和抗體和細(xì)胞免疫[72]。將低致病性PPRSV HB-1/3.9 株非結(jié)構(gòu)蛋白 NSP2、以及結(jié)構(gòu)蛋白GP5 和M 與高致病性PRRSVJXwn06 株對應(yīng)區(qū)域的蛋白相互置換，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的嵌合株 HB-1/3.9/JXwn06 可以產(chǎn)生針對HB-1/3.9 和JXwn06 株的交叉中和反應(yīng)[39]。Tian等[73]將6 株異源PRRSV 毒株的ORF 3～6 重組到PRRSV-VR2385 骨架中，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的新型嵌合病毒對多種異源毒株表現(xiàn)出更好的交叉保護(hù)功效。Choi等[74]將PRRSV-2 LMY毒株的結(jié)構(gòu)蛋白基因替換FL12 相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白基因，構(gòu)建了基因工程嵌合疫苗K418DM。攻毒結(jié)果顯示：K418DM 對同源攻毒可提供高水平保護(hù)效果，顯著降低3 dpc 和7 dpc 時病毒血癥水平和肺損傷程度；對異源攻毒提供了延遲保護(hù)效果，顯著降低14 dpc 時病毒血癥水平。另有研究[75]針對韓國流行毒株P(guān)RRSV-1，利用逆向遺傳學(xué)技術(shù)將KU-PRRSV-2020-002 毒株的GP5 外域區(qū)域替換為CSNA11 的GP5 外域區(qū)域，從而開發(fā)出低糖基化嵌合病毒候選疫苗株vCSL1-GP5-N33D。該嵌合株vCSL1-GP5-N33D 滅活疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體滴度，表明vCSL1-GP5-N33D 嵌合疫苗是一種前景廣闊的候選疫苗，可有助于控制韓國PRRSV-1 的流行。

因此，嵌合疫苗可以應(yīng)用于新發(fā)PRRSV 毒株的疫苗開發(fā)研究。盡管嵌合疫苗具有良好的異源交叉保護(hù)效力，但這種保護(hù)往往不足以完全預(yù)防高變異的PRRSV 感染，因此開發(fā)出一種有效的候選嵌合疫苗還有很長的路要走，但嵌合疫苗為未來疫苗開發(fā)提供了一種新方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.4 基因工程疫苗

新型PRRSV 基因工程疫苗主要包括DNA 疫苗、亞單位疫苗、肽疫苗以及多種病毒載體和細(xì)菌載體疫苗。目前多數(shù)基因工程疫苗具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)效力不及MLV 疫苗，與較理想疫苗仍存在較大差距。DNA 疫苗和亞單位疫苗有望成為MLV 疫苗和滅活疫苗的增強(qiáng)劑，能夠在一定程度上提高疫苗的保護(hù)作用。表達(dá)PRRSV N 蛋白DNA 質(zhì)?；騺唵挝灰呙缁虿《据d體疫苗可用于增強(qiáng)MLV 疫苗的特異性免疫反應(yīng)，增加中和抗體和特異性IFN-γ 滴度[76]。GP5 DNA 疫苗免疫豬群后誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性抗體和IFN-γ，但未能提供完全保護(hù)[70]。重組PRRSV GP3 和GP5 DNA 疫苗pVAX-GP35 與佐劑皂苷提取物-水-油-水混合后免疫接種豬群，誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高水平的中和抗體和IL-4、IFN-γ、IL-2、IL-10[77]。

基于重組病毒基因組的PRRSV 病毒載體疫苗成為除嵌合疫苗外的另一種MLV 疫苗優(yōu)化方案。病毒疫苗載體能夠誘導(dǎo)黏膜免疫，為PRRSV 黏膜疫苗的研究和開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。目前常用的病毒載體主要包括偽狂犬病病毒、傳染性胃腸炎病毒、痘病毒、腺病毒。傳染性胃腸炎病毒載體能夠高水平表達(dá)PRRSV 外源蛋白GP5 和M，誘導(dǎo)IFN-α分泌和產(chǎn)生較低水平的中和抗體，攻毒后保護(hù)效果有限[78]。其他病毒載體疫苗的免疫效果相當(dāng)，均未能完全保護(hù)豬群免受感染。病毒載體疫苗免疫效果有限的主要原因可能是病毒載體對PRRSV 抗原的表達(dá)不穩(wěn)定，需要進(jìn)一步篩選穩(wěn)定表達(dá)中和抗原表位的抗原小結(jié)構(gòu)域，從而提高疫苗抗原遞呈總量。PRRSV 含有T 細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu)/非結(jié)構(gòu)蛋白（如M、NSP9 和NSP5），是開發(fā)肽疫苗的關(guān)鍵靶標(biāo)分子[79]，但其免疫保護(hù)效力需要深入研究評估。

3.5 干擾素誘導(dǎo)激活的疫苗

為了解決PRRSV 的免疫逃逸問題，研究者開發(fā)出干擾素誘導(dǎo)激活的PRRSV 候選疫苗，該疫苗能夠特異性誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，增強(qiáng)疫苗免疫保護(hù)效力。PRRSV-A2MC2 作為中等毒性的候選疫苗株，與VR-2332 和Ingelvac PRRS MLV 的同源性高達(dá)99.8%。PRRSV-A2MC2 能夠在Marc-145 和PAM細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN，但A2MC2 誘導(dǎo)IFN 的分子機(jī)制尚不清楚[80]。將PRRSV-A2MC2 在Marc-145 細(xì)胞中連續(xù)傳代90 次，獲得致弱毒株A2MC2-P90；A2MC2-P90 不僅保留了PRRSV-A2MC2 誘導(dǎo)IFN的能力，且能夠誘導(dǎo)更高水平的中和抗體，還能夠保護(hù)豬群免受同源毒株VR-2385 的攻擊[81]。A2MC2-P90 對異源毒株的研究[82]結(jié)果表明，在強(qiáng)毒攻擊仔豬后，A2MC2-P90 疫苗誘導(dǎo)了快速的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的中和抗體滴度更高，顯著降低了病毒血癥水平，對HP-PRRSV 毒株XJA1 具有良好的保護(hù)作用。A2MC2-P90 作為一種新型候選疫苗毒株，對異源PRRSV 毒株具有廣泛的保護(hù)譜。

PRRSV-con 由59 個野生型PRRSV-2 高頻序列經(jīng)人工合成而來，其復(fù)制效率與原型毒株FL12一致。PRRSV-con 與A2MC2 的特性相似，也能夠在細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN，但誘導(dǎo)IFN 的分子機(jī)制不同。PRRSV-con 接種豬群后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更廣泛的異源保護(hù)水平[83]。其他研究者[84]開發(fā)的MLV-129p-IFNmix 候選疫苗株也能夠快速誘導(dǎo)IFN合成。因此，具有干擾素誘導(dǎo)激活的A2MC2、PRRSV-Con 和MLV-129p-IFNmix 的候選毒株對未來PRRSV 疫苗開發(fā)設(shè)計提供了新材料。

3.6 納米疫苗

納米疫苗作為一種新型疫苗載體，在治療或者預(yù)防傳染病和腫瘤中具有廣泛的應(yīng)用前景。納米疫苗顆粒粒徑一般在1～1 000 nm，更易于集中在淋巴結(jié)、脾臟等淋巴器官中，此外納米粒徑與病原體相近，使得納米疫苗更容易被抗原呈遞細(xì)胞攝取，并且可以將抗原靶向遞送至特異性免疫細(xì)胞。同時，納米疫苗能夠激活特異性T 細(xì)胞，繼而可以殺傷病變細(xì)胞。目前常用的納米疫苗材料主要包括脂質(zhì)納米顆粒、自組裝蛋白質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、無機(jī)納米載體和仿生納米顆粒。自組裝蛋白質(zhì)納米顆粒包括鐵蛋白家族蛋白質(zhì)、丙酮酸脫氫酶（E2）和病毒樣顆粒（VLP），近年來被廣泛應(yīng)用于納米疫苗的開發(fā)應(yīng)用。有研究[85]將GP5 和鐵蛋白融合表達(dá)后構(gòu)建了GP5m-鐵蛋白納米顆粒疫苗，并證實(shí)該GP5m-鐵蛋白疫苗誘導(dǎo)的血清抗體滴度顯著高于PRRSV 滅活疫苗，表明使用多個抗原拷貝的納米疫苗能夠產(chǎn)生更有效和持久的免疫反應(yīng)。此外，該納米疫苗還能夠促進(jìn)Th1 主導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)并增強(qiáng)特異性T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。

馬賽克（Mosaic）疫苗利用鑲嵌的方式進(jìn)行設(shè)計，通過向免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)密集的抗原表位陣列，有效刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而產(chǎn)生持久的免疫。將PRRSV GP5-Mosaic 序列制備脂質(zhì)體DNA Mosaic 納米疫苗免疫豬群后，可以顯著提高IFN-γ mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和中和抗體水平，能夠部分免受VR2332、NADC9、NADC30 和SDSU73感染，提示GP5-Mosaic 疫苗能夠?qū)Σ煌局戤a(chǎn)生部分交叉保護(hù)[86]。有研究[87]開發(fā)了冠狀病毒“Mosaic-8”多功能納米疫苗，通過將SARSCoV-2 和其他7 種類似SARS 的乙型冠狀病毒的刺突蛋白片段置于蛋白質(zhì)納米顆粒結(jié)構(gòu)上，誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的交叉反應(yīng)抗體，從而保護(hù)人們免受新冠病毒未來變種、SARS、MERS 等冠狀病毒新毒株的影響。在SARS Mosaic 和HIV Mosaic 納米疫苗的啟發(fā)下，結(jié)合PRRSV 易突變和高重組的特點(diǎn)，以期開發(fā)出一種包括來自多種PRRSV 毒株的多結(jié)構(gòu)蛋白的多拷貝Mosaic 嵌合納米疫苗，預(yù)期對PRRSV多種異源毒株具有良好的交叉保護(hù)效果[88]。綜上，自組裝納米疫苗和Mosaic 納米疫苗為PRRSV 新型疫苗研究指明了新方向。

4 小結(jié)與展望

PRRS 作為全球流行性豬病，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。自20 世紀(jì)80年代以來，研究人員對PRRSV 免疫保護(hù)機(jī)制和疫苗改進(jìn)策略進(jìn)行了深入研究，但至今理想的PRRSV 疫苗仍未研發(fā)成功。PRRSV 高頻突變和重組，導(dǎo)致變異毒株不斷涌現(xiàn)，這增加了PRRS 的防控難度，阻礙了疫苗研究進(jìn)展。PRRSV 毒株中和性表位、中和表位糖基屏蔽、異源毒株共同中和表位以及免疫保護(hù)分子機(jī)制仍不十分清楚，這極大限制了新型疫苗的研發(fā)速度。MLV 疫苗仍然是目前控制PRRSV 感染的最優(yōu)選擇。特別是干擾素誘導(dǎo)激活的PRRSV MLV疫苗候選疫苗株的出現(xiàn)，為開發(fā)具有異源交叉保護(hù)能力的PRRSV 新型嵌合疫苗奠定了基礎(chǔ)。自組裝蛋白質(zhì)納米顆粒制備簡單，抗原遞送效率高，被廣泛應(yīng)用于各類疾病防治，為新型PRRSV 疫苗研發(fā)提供了新思路。盡管當(dāng)前PRRSV 疫苗在安全性和異源保護(hù)效力方面有諸多局限性，但是通過改良佐劑，改進(jìn)接種方式，改良MLV 疫苗和滅活疫苗，基于蛋白組學(xué)開發(fā)肽疫苗，基于蛋白納米遞送系統(tǒng)以及外泌體遞送系統(tǒng)等開發(fā)新型PRRSV 疫苗，將有望加快終結(jié)PRRS 的全球流行。