2019—2021年我國部分地區(qū)PRRSV ORF5 基因遺傳變異分析

何曉明，王東東，田小艷，劉桂武，李春梅，歐陽海平，葉敏慧

（溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東云浮 527400）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是屬于動(dòng)脈炎病毒科的RNA 病毒，主要引起母豬群流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等特征的繁殖障礙以及仔豬的發(fā)燒、呼吸困難、氣喘等癥狀[1]。

PRRSV 基因組全長15 kb 左右，包含ORF7、ORF6、ORF5、ORF4、ORF3、ORF2b、ORF2a、ORF1b、ORF1a 和5'端非編碼區(qū)。其中：ORF1a和 ORF1b 主要編碼 RNA 聚合酶和轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶等與病毒復(fù)制相關(guān)的酶類，ORF2—ORF5 依次編碼糖蛋白GP2—GP5，ORF6 編碼膜基質(zhì)蛋白GP6（又稱 M 蛋白），ORF7 編碼核衣殼蛋白GP7（又稱N 蛋白），部分相鄰的讀碼框存在重疊部位[2-3]。

GP5 蛋白變異是結(jié)構(gòu)蛋白中最為顯著的，此外GP5 蛋白含有糖基化位點(diǎn)，因而有助于識別細(xì)胞受體和中和病毒，GP5 也是促進(jìn)體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，因此GP5 蛋白已成為PRRSV 鑒定和分析的重要指標(biāo)[4-5]。

為了解近年P(guān)RRSV 的流行變異情況，本研究在2019—2021年收集了我國南方區(qū)域部分省份疑似PRRSV 感染的臨床病例樣品進(jìn)行RT-PCR 檢測，并對部分陽性樣品進(jìn)行病毒分離及ORF5 基因測序分析。

1 材料和方法

1.1 樣品收集

可疑樣品收集自廣東、廣西、湖南、江西4個(gè)省份不同豬場的流產(chǎn)母豬和有呼吸道癥狀育肥豬群，包括血清、肺臟、淋巴結(jié)、口腔液。

1.2 樣品處理

肺臟和淋巴結(jié)先在無菌條件下研磨，研磨液以及血清、口腔液均在離心后取上清進(jìn)行核酸抽提、RT-PCR 檢測。檢測陽性的樣品接種PAM 細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，對分離到的毒株進(jìn)行測序。

1.3 病毒RNA 提取

研磨液和培養(yǎng)上清取樣后加到天隆病毒DNA/RNA 提取試劑盒，加樣完畢后放入天隆核酸自動(dòng)提取儀，所有操作按儀器設(shè)備和試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.4 RT-PCR 檢測

按照《豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光RT-PCR檢測方法》（GB/T 35912—2018）中規(guī)定的方法，合成引物、探針（由上海生工合成），使用HiScript III U+One Step qRT-PCR Probe Kit（諾唯贊）配置反應(yīng)體系，在ABI QuantStudio6 熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測，Ct ≤38 且擴(kuò)增曲線為典型的S曲線，為PRRSV 核酸陽性。

1.5 ORF5 基因測序

對分離的病毒進(jìn)行ORF5 基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后送上海生工測序。測序引物序列見表1。

表1 測序引物序列

1.6 ORF5 基因進(jìn)化分析

ORF5 基因測序結(jié)果經(jīng)處理后，使用MEGA11軟件繪制進(jìn)化樹，參考毒株來自NCBI，進(jìn)化樹繪制采用Neighbor-Joining 模型，Bootstrap 設(shè)置為1 000。

1.7 重組分析

對其中1 株命名為GX-C4CG6 的毒株進(jìn)行基因組全長擴(kuò)增，并與其他參考毒株進(jìn)行比對，比對結(jié)果使用RDP 4 和SimPlot 3.5.1 軟件分析評估毒株重組情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測

2019—2021年，共收集25 個(gè)種豬場、22 個(gè)育肥場2 163 份各類樣品，其中565 份樣品檢測為陽性，樣品陽性檢出率為26.12%；種豬場場陽性檢出率為52.00%，育肥場為86.36%。不同省份和不同場檢測情況詳見表2。

表2 2019—2021年4 省份不同類型豬場PRRSV 場陽性檢出率 單位：%

2.2 ORF5 基因進(jìn)化分析

共成功分離到97 株病毒并對其進(jìn)行了ORF5基因測序和進(jìn)化分析。結(jié)果（圖1）顯示：50株屬于Sublineage 1.8（51.55%），13 株屬于Sublineage 1.5（13.40%），9 株屬于Lineage 3（9.28%），10株屬于Lineage 8（10.31%），15株屬于Lineage 5（15.46%）。

圖1 ORF5 基因進(jìn)化樹

2019—2021年4 省份臨床流行的PRRSV 毒株包括類NADC30 毒株、經(jīng)典株、類NADC34 毒株、變異株和類QYYZ 毒株，其中類NADC30 毒株占比最高，是臨床上主要流行毒株。

2.3 ORF5 測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

按年份進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖2-A）顯示：類NADC30 毒株在各年份占比均為最高，2021年首次檢測到類NADC34 毒株，且當(dāng)年占比達(dá)13.40%；類QYZZ 毒株、變異株和經(jīng)典株在各年份仍有流行。

按地區(qū)進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖2-B）顯示：廣東的類NADC30 毒株和經(jīng)典株占比最高，廣西、湖南的類NADC30 和類NADC34 毒株占比最高，江西的類NADC30 毒株和變異株占比最高；除江西外，其他3 個(gè)省份均有類NADC34 毒株被檢出。

圖2 不同年份和不同地區(qū)毒株占比

2.4 ORF5 基因推導(dǎo)氨基酸位點(diǎn)突變分析

因GP5 蛋白的R13和R151被認(rèn)為與毒力有關(guān)[6-8]，本研究對97 株分離株GP5 蛋白推導(dǎo)氨基酸與參考序列使用DNAstar 軟件進(jìn)行比對。結(jié)果顯示：20 株由Q13變?yōu)镽13，其中3 株為Sublineage 1.8，1 株為Lineage 5，10 株為Lineage 8，6 株為Lineage 3；23株由K151變?yōu)镽151，其中10株為Sublineage 1.8，3 株為Lineage 5，10 株為Lineage 8。

本研究發(fā)現(xiàn)，有24 株Sublineage 1.8、4 株Sublineage 1.5、15 株Lineage 5、10 株Lineage 8和3 株Lineage 3 毒株在36～52 位的中和表位區(qū)均發(fā)生了突變（圖3）。這些突變可能導(dǎo)致病毒逃避疫苗免疫誘導(dǎo)的中和作用，從而有可能會(huì)降低疫苗保護(hù)效果。

圖3 ORF5 序列推導(dǎo)氨基酸比對結(jié)果

圖3 ORF5 序列推導(dǎo)氨基酸比對結(jié)果（續(xù)）

2.5 GX-C4CG6 毒株重組分析

通過RDP4 軟件確定了重組事件和重組分界點(diǎn)，同時(shí)使用Simplot 進(jìn)行了結(jié)果驗(yàn)證。重組分析結(jié)果顯示：GX-C4CG6 基因組主要以類NADC30毒株基因序列為骨架，并與JXA1 和IA2014 毒株發(fā)生了重組；通過RDP4 和Simplot 軟件分析確定了4 處重組（表3），重組位置分別位于5 302～6 500、6 880～8 074、12 121～13 347 和13 724～14 542。全基因組進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GXC4CG6 屬于類NADC30 毒株（Sublineage 1.8）；但重組區(qū)域進(jìn)化分析顯示，其中兩處（5 302～6 500、6 880～8 074）與JXA1 毒株（Lineage 8）位于同一分支，另兩處（12 121～13 347、13 724～14 542）與IA2014 毒株（Sublineage 1.5）位于同一分支（圖4）。

圖4 重組分析結(jié)果

表3 GX-C4CG6 毒株RDP4 軟件重組分析信息

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）在國內(nèi)出現(xiàn)后，對國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)造成巨大影響。PRRSV 是RNA病毒，變異快，新毒株層出不窮[9]，這給PRRS 防控工作帶來了巨大挑戰(zhàn)。

本研究從廣東、廣西、湖南、江西4 個(gè)省份的種豬場和育肥場采集疑似PRRSV 感染樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV 總陽性檢出率為26.12%，其中育肥場的場陽性檢出率高于種豬場，表明PRRSV 在育肥豬群流行更為普遍。

對分離株進(jìn)行ORF5 基因測序發(fā)現(xiàn)，2019—2021年類NADC30 毒株是4 省份的主要流行毒株，占比高達(dá)51.55%。

類NADC34 毒株2017年在遼寧省首次被發(fā)現(xiàn)[10]，之后在多個(gè)省份陸續(xù)出現(xiàn)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，廣東、廣西、湖南2021年首次出現(xiàn)類NADC34毒株，但在江西未發(fā)現(xiàn)，這可能受采樣面和覆蓋豬場數(shù)量影響，相關(guān)情況待進(jìn)一步調(diào)查。類NADC34 毒株流行區(qū)域較為廣泛，需引起高度重視。養(yǎng)殖場需持續(xù)對場內(nèi)PRRSV 流行情況進(jìn)行監(jiān)測，評估場內(nèi)毒株流行變異情況。

GP5 蛋白分析顯示，PRRSV 毒力位點(diǎn)及中和表位突變較為普遍，特別是類NADC30 和類QYYZ 毒株，這可能是該類毒株疫苗保護(hù)效果不佳的一個(gè)原因。

GX-C4CG6 毒株基因組全長重組分析結(jié)果顯示，該毒株以NADC30 毒株為主要親本，并重組了包括高致病毒株JXA1 和類NADC34 毒株IA2014 在內(nèi)的基因組片段。PRRSV 在流行過程中發(fā)生重組可能導(dǎo)致病毒致病性等發(fā)生變化，該重組毒株的致病性以及現(xiàn)有疫苗對其免疫保護(hù)的效果有待進(jìn)一步研究。