• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于ITS2序列的鬼箭羽及其混偽品DNA條形碼鑒定

    2023-02-15 06:23:48郭麗嶸趙偉楊麗陳海娟楊志剛李一蒙
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2023年2期
    關(guān)鍵詞:衛(wèi)矛偽品條形碼

    郭麗嶸 ,趙偉 ,楊麗 ,陳海娟 ,楊志剛 , ,李一蒙, ,

    1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2.青海師范大學(xué)高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院,青海 西寧 810016;3.青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810008;4.蘭州大學(xué)隴藥協(xié)同創(chuàng)新中心,甘肅 蘭州 730000

    鬼箭羽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛Euonymus alatus(Thunb.)Sieb.的干燥具翅狀物的枝條或翅狀物[1]。全國除東北、新疆、青海、西藏、廣東及海南外,其余各地均產(chǎn),具有較高的藥用、觀賞及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鬼箭羽含有豐富的化學(xué)成分,包括黃酮類、甾體類、木脂素類、強(qiáng)心苷類、生物堿類、苯丙素類、萜類、揮發(fā)油類、酚酸類等[2-3]。古籍記載鬼箭羽主要用于治療女子?jì)D科經(jīng)血疾病及殺蟲驅(qū)邪。藥理研究表明,鬼箭羽提取物有明顯的降血糖、降血脂、降血壓、抗過敏、抗炎及保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞等作用,在治療糖尿病、慢性腎炎、盆腔炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等方面效果顯著[4-6]。衛(wèi)矛屬植物眾多,分布廣泛,植物形態(tài)相似,極易混淆,鑒別難度大?!肚Ы鹨矸健酚涊d,鬼箭羽與天麻苗均具有赤箭、鬼督郵等別稱。明代《本草崇原》將天麻苗描述為“赤箭。春生苗,中抽一莖直上如箭竿,色正赤,貼莖梢之半,微有小紅葉,遠(yuǎn)看如箭之有羽,根形如王瓜,皮色黃白,曬干則黑,去根三五寸,有游子環(huán)列如衛(wèi),皆有細(xì)根如白發(fā),氣相通而實(shí)不相連”,由此可知,蘭科植物天麻在形態(tài)上與鬼箭羽相似。這導(dǎo)致正品與偽品混用現(xiàn)象層出不窮,給用藥安全帶來很大隱患。因此,為控制鬼箭羽藥材質(zhì)量,建立一種快速準(zhǔn)確的鑒別方法尤為重要。

    傳統(tǒng)的藥材鑒別手段主要包括性狀鑒定、基原鑒定、顯微鑒定及理化鑒定等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,DNA條形碼分子鑒定法的出現(xiàn)對傳統(tǒng)鑒別手段進(jìn)行了有效補(bǔ)充。DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的DNA片段對物種進(jìn)行鑒定,不受樣品的形態(tài)和性狀的影響[7-8]。目前,植物類中藥材常選用細(xì)胞核基因組中的ITS2(Internal Transcribed Spacer 2)和葉綠體基因組中的psbA-trnH基因區(qū)間序列進(jìn)行鑒別。本研究將DNA條形碼技術(shù)用于鬼箭羽藥材的鑒別,比較鬼箭羽與其近源種的親緣關(guān)系,建立快速鑒別鬼箭羽及其混偽品的方法,為后續(xù)鬼箭羽的質(zhì)量控制及安全用藥提供分子依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    GE9612T-S型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(北京柏恒科技有限公司),ChampGel 6000型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司),D1524R型高速冷凍離心機(jī)(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司),Vortex 3000型渦旋混合器(WIGGENS labortechink GmbH公司),Nano-400A型超微量核酸分析儀(杭州奧盛儀器有限公司),Smart-S15型超純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。

    Genomic DNA Kit試劑盒(批號P81019)、DNA凝膠回收試劑盒(批號03921KE1),北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;GelstainRed核酸染料(批號210611L1-7),上海百賽生物技術(shù)股份有限公司;100 bp Marker(批號01000/60531),康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;KOD-Plus-Neo(批號067000),TOYOBO;西班牙瓊脂糖(批號111860)、50×TAE電泳緩沖液(批號21335470)、6×DNA loading buffer(批號01454/36320),蘭州勵合生物科技有限公司。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

    16批鬼箭羽藥材,分別為來源于四川、河南、山東、江西等地的野生種(見表1),經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院李建銀講師鑒定,為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛Euonymus alatus(Thunb.)Sieb.的干燥具翅狀物的枝條或翅狀物。鬼箭羽近源種西南衛(wèi)矛Euonymus hamiltonianus、歐洲衛(wèi)矛Euonymus europaeus、白杜衛(wèi)矛Euonymus maackii、冬青衛(wèi)矛Euonymus japonicus、衛(wèi)矛Euonymus alatus、扶芳藤Euonymus fortunei、紫花衛(wèi)矛Euonymus porphyreus、栓翅衛(wèi)矛Euonymus phellomanus及混偽品大果榆Ulmus macrocarpa序列均來源于GenBank數(shù)據(jù)庫(見表2)。

    表1 鬼箭羽樣品來源信息

    表2 鬼箭羽近源種及其偽品序列信息

    2 方法與結(jié)果

    2.1 ITS2序列分析

    2.1.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

    用酒精擦拭藥材表面,待藥材表面酒精揮干,粉碎后過5號篩,稱取樣品粉末約20 mg,使用全式金Genomic DNA Kit試劑盒提取總DNA。使用通用引物ITS2F (5” -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3” ) 和ITS3R(5” -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3” )進(jìn)行ITS2序列擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系為50 μL,擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性2 min;98 ℃、10 s,55 ℃、30 s,68 ℃、45 s,33個(gè)循環(huán);94 ℃,5 min,4 ℃保存。DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后將擴(kuò)增的基因送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行一代測序。

    2.1.2 種內(nèi)及種間遺傳距離分析

    瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為450~470 bp,條帶清晰無裂解(見圖1),表明ITS2序列擴(kuò)增效果好,純化回收后測序可獲得高質(zhì)量的堿基序列。測序后去除兩端5.8S和28S rDNA區(qū)段獲得ITS2標(biāo)準(zhǔn)序列,其長度為212 bp,GC含量為67.4%~67.9%。序列對比結(jié)果表明,16條序列僅在第100個(gè)位點(diǎn)處存在差異,其中,GJY4、GJY5、GJY6、GJY9、GJY10、GJY14為C,其他樣品為T,共獲得2個(gè)單倍型(見圖2),表明不同產(chǎn)地所產(chǎn)鬼箭羽的種內(nèi)變異率低,具有較高的遺傳穩(wěn)定性?;贙2P雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離,不同產(chǎn)地不同藥材市場鬼箭羽的種內(nèi)最大K2P為0.004 7,平均K2P為0.002 4,種間最大K2P為0.126 2,種間平均K2P為0.082 1,鬼箭羽與混偽品最小K2P為0.405 8,最大K2P為0.430 6,見表3~表4。

    表3 鬼箭羽樣品種內(nèi)遺傳距離

    表4 鬼箭羽與近源種和混偽品的遺傳距離

    圖1 鬼箭羽樣品ITS2擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳

    圖2 鬼箭羽樣品間ITS2序列對比

    2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

    測序峰圖利用CodonCode Aligner 3.0校對拼接,去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū),獲得一致性序列。所有序列使用隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列,其中5.8S rRNA的保守序列為CGAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCA,28S rRNA的保守序列為CGACCCCAGGTCAGG CGGGAACACC。將得到的所有序列用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 7.0軟件分析比對后用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

    使用MEGA 7.0軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫選取的8種近源種及1種偽品和16批鬼箭羽藥材ITS2序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹(見圖3)。系統(tǒng)聚類樹結(jié)果表明,GJY1~GJY16與西南衛(wèi)矛、歐洲衛(wèi)矛、白杜衛(wèi)矛、冬青衛(wèi)矛、扶芳藤、栓翅衛(wèi)矛、紫花衛(wèi)矛并為一個(gè)大分支,可以明顯看出,GJY1~GJY16與衛(wèi)矛屬材料親緣關(guān)系較近,而其偽品大果榆自成一支,表明ITS2序列作為DNA條形碼,能將鬼箭羽與其混偽品分開。

    圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的鬼箭羽及其混偽品NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 討論

    中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則已被列入2020年版《中華人民共和國藥典》(四部)通則,在中藥鑒定方面廣泛研究與應(yīng)用,為傳統(tǒng)中藥鑒定學(xué)的發(fā)展提供了新的理論和技術(shù)支撐[9-10]。劉金欣等[11]通過建立黃芩ITS2數(shù)據(jù)庫并對黃芩種子的ITS2序列進(jìn)行分子鑒定,發(fā)現(xiàn)黃芩的種內(nèi)序列變異小于種間序列變異,構(gòu)建的黃芩ITS2條形碼數(shù)據(jù)庫穩(wěn)定可靠,表明DNA條形碼可用于黃芩種子的物種鑒定。孫稚穎等[12]通過鑒定羌活及其混偽品的ITS2序列并比較了ITS2的二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)羌活種內(nèi)平均遺傳距離遠(yuǎn)小于與其混偽品的種間平均遺傳距離,ITS2結(jié)構(gòu)上也有明顯差異,表明ITS2序列作為DNA條形碼可方便快捷地鑒別羌活與其混偽品。

    1963年版《中華人民共和國藥典》將鬼箭羽的來源描述為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛的干燥具翅狀物枝條[13]。1993年版《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(二)》記載鬼箭羽藥材來源為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛E. alatus、同屬植物栓翅衛(wèi)矛E. phellomanus及同屬植物毛脈衛(wèi)矛E. alatusvar.pubescens[14]。2009年版《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》亦有類似說明[15]。目前,鬼箭羽基原已基本確定為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛,隨著臨床應(yīng)用日益增多,在市場流通過程中常有榆科植物大果榆的莖冒充鬼箭羽,值得注意的是,大果榆的干燥莖亦具有不規(guī)則木栓翅,判定時(shí)仍存在困難,使用時(shí)應(yīng)注意鑒別[16-17]。

    本研究采用DNA條形碼技術(shù),通過對不同產(chǎn)地不同藥材市場16批鬼箭羽ITS2序列分析,發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)保守性高,種內(nèi)變異率低,具有較高的遺傳穩(wěn)定性,可以將非變異材料的ITS2序列作為對照序列來鑒定正品鬼箭羽。此外,從K2P遺傳距離可以看出,本研究16批鬼箭羽樣品與其近源種的種內(nèi)種間遺傳距離遠(yuǎn)小于與其混偽品的遺傳距離,在NJ系統(tǒng)聚類樹上也可以看到16批鬼箭羽與其近源種成一個(gè)大分支,混偽品自成一支,其中,以往被作為鬼箭羽入藥的栓翅衛(wèi)矛與衛(wèi)矛聚為不同的支,而衛(wèi)矛與16批鬼箭羽樣品聚為一支,能夠明顯區(qū)分,可為后續(xù)研究提供參考。

    猜你喜歡
    衛(wèi)矛偽品條形碼
    創(chuàng)意條形碼
    冬沖夏草與摻偽品的鑒別研究
    甘肅省衛(wèi)矛科野生植物資源的評價(jià)及應(yīng)用
    尿素硝銨溶液對膠東衛(wèi)矛生長特性及保護(hù)酶活性的影響
    從條形碼到二維碼
    從條形碼到二維碼
    近紅外光譜技術(shù)鑒別白及粉及其混偽品
    市場預(yù)測
    電子舌技術(shù)鑒別川貝母粉及其摻偽品
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:58
    條形碼大變身
    亚洲内射少妇av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 日韩亚洲欧美综合| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 国产黄频视频在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久色成人| 97在线人人人人妻| 99精国产麻豆久久婷婷| 少妇人妻久久综合中文| 国产伦在线观看视频一区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲综合色惰| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费看av在线观看网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美精品国产亚洲| 嫩草影院入口| 又爽又黄a免费视频| 精品酒店卫生间| 亚洲欧美精品专区久久| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 中国三级夫妇交换| 亚洲精品日本国产第一区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲真实伦在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| kizo精华| 日韩av在线免费看完整版不卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲av在线观看美女高潮| 黄色配什么色好看| 精品人妻视频免费看| 五月玫瑰六月丁香| av专区在线播放| 三级国产精品片| 国产精品一区www在线观看| 青春草国产在线视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产高清国产精品国产三级 | 深爱激情五月婷婷| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲伊人久久精品综合| 天堂8中文在线网| 免费黄色在线免费观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 人妻一区二区av| .国产精品久久| av在线蜜桃| 欧美三级亚洲精品| 午夜福利在线在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲天堂av无毛| 日韩三级伦理在线观看| 国产亚洲最大av| 色吧在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲无线观看免费| 熟女av电影| 国产毛片在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产在线男女| 免费大片黄手机在线观看| 国产伦在线观看视频一区| tube8黄色片| 在线观看人妻少妇| 欧美97在线视频| 人人妻人人看人人澡| 伦理电影大哥的女人| 国产成人精品久久久久久| 亚洲av成人精品一二三区| 亚州av有码| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 国产精品精品国产色婷婷| 六月丁香七月| 国产视频内射| 欧美 日韩 精品 国产| 直男gayav资源| 久久av网站| 精品熟女少妇av免费看| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| av女优亚洲男人天堂| 在线免费观看不下载黄p国产| av专区在线播放| freevideosex欧美| 大片免费播放器 马上看| 乱码一卡2卡4卡精品| 在线天堂最新版资源| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 91狼人影院| 国产精品偷伦视频观看了| 久久综合国产亚洲精品| 特大巨黑吊av在线直播| 天堂中文最新版在线下载| 国产亚洲欧美精品永久| 干丝袜人妻中文字幕| 久久鲁丝午夜福利片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| av一本久久久久| a级毛色黄片| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品色激情综合| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av专区在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美高清性xxxxhd video| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99热网站在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲在久久综合| 婷婷色综合大香蕉| 男人和女人高潮做爰伦理| 成年女人在线观看亚洲视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 综合色丁香网| 精品亚洲成a人片在线观看 | 日本黄色片子视频| 精品酒店卫生间| 十分钟在线观看高清视频www | 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久久亚洲精品成人影院| 久久综合国产亚洲精品| 国产高清三级在线| 精品人妻视频免费看| 好男人视频免费观看在线| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av国产av综合av卡| 一区二区三区免费毛片| 国产av一区二区精品久久 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 少妇高潮的动态图| 少妇的逼好多水| 免费看av在线观看网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 美女高潮的动态| 女人久久www免费人成看片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久国内精品自在自线图片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久99蜜桃精品久久| 精品久久久久久久末码| 人妻 亚洲 视频| 欧美精品一区二区免费开放| 免费观看的影片在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| av卡一久久| 精品久久久噜噜| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲成人手机| 久久久欧美国产精品| 日本午夜av视频| 一本久久精品| 亚洲无线观看免费| 日韩大片免费观看网站| 国产v大片淫在线免费观看| 熟女电影av网| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 搡老乐熟女国产| 亚洲,一卡二卡三卡| 妹子高潮喷水视频| 久久久久久久久久成人| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人国产麻豆网| 国国产精品蜜臀av免费| 黄色视频在线播放观看不卡| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲精品色激情综合| 韩国av在线不卡| 国产精品一区二区在线观看99| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产深夜福利视频在线观看| freevideosex欧美| 久久久色成人| .国产精品久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人亚洲欧美一区二区av| 国国产精品蜜臀av免费| 观看免费一级毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 又爽又黄a免费视频| 美女中出高潮动态图| 久久精品人妻少妇| 久久国内精品自在自线图片| 三级经典国产精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 最近中文字幕2019免费版| 久久ye,这里只有精品| 丝瓜视频免费看黄片| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲第一av免费看| 国产精品无大码| 国产亚洲精品久久久com| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 免费观看无遮挡的男女| 在线播放无遮挡| 国产成人91sexporn| 亚洲精品第二区| 老司机影院毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 观看免费一级毛片| 日韩精品有码人妻一区| 日本黄色片子视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 熟女av电影| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成年免费大片在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 最近手机中文字幕大全| 精品酒店卫生间| 伦理电影免费视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费观看a级毛片全部| 在线 av 中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 免费观看无遮挡的男女| 在线精品无人区一区二区三 | 欧美+日韩+精品| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 九草在线视频观看| 国产精品女同一区二区软件| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99热这里只有是精品在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美成人a在线观看| 人人妻人人看人人澡| 亚州av有码| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美人与善性xxx| 一级a做视频免费观看| 久久精品国产a三级三级三级| 免费人妻精品一区二区三区视频| 下体分泌物呈黄色| 日本免费在线观看一区| 久久青草综合色| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一个人免费看片子| 亚洲av.av天堂| 成人二区视频| 亚洲真实伦在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲av二区三区四区| 国产精品精品国产色婷婷| 免费人成在线观看视频色| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 婷婷色av中文字幕| 男人舔奶头视频| 春色校园在线视频观看| av福利片在线观看| av国产精品久久久久影院| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲内射少妇av| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美日韩视频精品一区| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲精品乱久久久久久| 在线观看人妻少妇| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲内射少妇av| av在线老鸭窝| 亚洲精品色激情综合| 又爽又黄a免费视频| 欧美bdsm另类| 中文字幕制服av| 亚洲欧美精品专区久久| 成年免费大片在线观看| 国产精品成人在线| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 天堂中文最新版在线下载| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久青草综合色| 人妻一区二区av| 精品一区在线观看国产| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 搡老乐熟女国产| 日韩欧美一区视频在线观看 | 简卡轻食公司| 中文天堂在线官网| 精品一区二区三区视频在线| 大话2 男鬼变身卡| av不卡在线播放| 成人亚洲精品一区在线观看 | 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲欧洲日产国产| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品久久久久久久久亚洲| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜日本视频在线| 国产视频内射| 深夜a级毛片| 韩国av在线不卡| 男女啪啪激烈高潮av片| 99热全是精品| 街头女战士在线观看网站| 国产精品99久久99久久久不卡 | 男女免费视频国产| 亚洲av免费高清在线观看| 日本免费在线观看一区| 91精品国产国语对白视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 午夜视频国产福利| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 免费看日本二区| 五月开心婷婷网| 精品熟女少妇av免费看| 视频区图区小说| 一本一本综合久久| 成人美女网站在线观看视频| 精品亚洲成国产av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久 成人 亚洲| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲美女黄色视频免费看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久精品人妻少妇| 99久久综合免费| 18+在线观看网站| 日日撸夜夜添| 国产69精品久久久久777片| 91久久精品电影网| 亚洲国产最新在线播放| 精品酒店卫生间| 亚洲精品国产成人久久av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩伦理黄色片| 日本与韩国留学比较| 久久久久久久精品精品| 亚洲人成网站高清观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 婷婷色综合www| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产男人的电影天堂91| 国产精品久久久久久精品古装| 日本免费在线观看一区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | av福利片在线观看| 天堂8中文在线网| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 又大又黄又爽视频免费| 麻豆成人午夜福利视频| 九草在线视频观看| 激情五月婷婷亚洲| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av播播在线观看一区| av女优亚洲男人天堂| 黑丝袜美女国产一区| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲人成网站高清观看| 国产男女内射视频| av视频免费观看在线观看| 日韩强制内射视频| 亚洲,欧美,日韩| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品一区二区在线观看99| 能在线免费看毛片的网站| 99视频精品全部免费 在线| 最后的刺客免费高清国语| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品久久久久成人av| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产高潮美女av| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 最后的刺客免费高清国语| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产在视频线精品| 午夜福利高清视频| 人妻系列 视频| 国产黄频视频在线观看| 内地一区二区视频在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 日韩强制内射视频| www.av在线官网国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费观看在线日韩| 在线免费观看不下载黄p国产| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲图色成人| 精品午夜福利在线看| 日韩视频在线欧美| 舔av片在线| 国产在线视频一区二区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 身体一侧抽搐| 国产精品国产三级国产专区5o| av免费观看日本| av线在线观看网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 99久久精品一区二区三区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产在线视频一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 丝袜喷水一区| 日韩强制内射视频| 女人久久www免费人成看片| 能在线免费看毛片的网站| 国产免费一级a男人的天堂| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品久久久久久久久亚洲| 新久久久久国产一级毛片| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲无线观看免费| av国产久精品久网站免费入址| 成人毛片60女人毛片免费| 三级国产精品片| 99热国产这里只有精品6| 一个人免费看片子| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产在线免费精品| 最近手机中文字幕大全| freevideosex欧美| 丝瓜视频免费看黄片| 在线观看三级黄色| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲成人手机| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久99热6这里只有精品| 少妇人妻 视频| 日韩视频在线欧美| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | av国产精品久久久久影院| 美女脱内裤让男人舔精品视频| a 毛片基地| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲综合精品二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产69精品久久久久777片| 日本wwww免费看| 男人添女人高潮全过程视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 波野结衣二区三区在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品免费大片| www.av在线官网国产| 毛片女人毛片| 亚洲美女黄色视频免费看| av黄色大香蕉| 国产精品欧美亚洲77777| 久久鲁丝午夜福利片| 免费观看的影片在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品国产自在天天线| 99热这里只有精品一区| 最新中文字幕久久久久| 观看av在线不卡| 在线免费十八禁| 免费大片黄手机在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 精品视频人人做人人爽| 欧美精品国产亚洲| 中文字幕久久专区| 大片电影免费在线观看免费| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产男女内射视频| 秋霞伦理黄片| 激情五月婷婷亚洲| 欧美日本视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 在线播放无遮挡| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美+日韩+精品| av国产精品久久久久影院| 免费大片黄手机在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 看免费成人av毛片| 91久久精品国产一区二区成人| 九草在线视频观看| 大片免费播放器 马上看| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲精品国产av成人精品| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产免费一级a男人的天堂| 国产黄色免费在线视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级 | 51国产日韩欧美| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 少妇精品久久久久久久| 一边亲一边摸免费视频| a级毛色黄片| 黄色欧美视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产 一区 欧美 日韩| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 大香蕉久久网| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美97在线视频| 国精品久久久久久国模美| av网站免费在线观看视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 夫妻午夜视频| 日韩国内少妇激情av| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩伦理黄色片| a级一级毛片免费在线观看| 嫩草影院入口| 免费人妻精品一区二区三区视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 黄色怎么调成土黄色| 两个人的视频大全免费| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品一区二区在线不卡| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲av综合色区一区| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲色图av天堂| 秋霞在线观看毛片| 色吧在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 在线免费十八禁| 亚洲怡红院男人天堂| 国产午夜精品一二区理论片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产 一区 欧美 日韩| 国产黄片视频在线免费观看| 22中文网久久字幕| 欧美成人午夜免费资源| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲电影在线观看av| 18禁动态无遮挡网站| 一级毛片电影观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 如何舔出高潮| 亚洲欧洲日产国产| 国产av精品麻豆| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产欧美在线一区| 国产伦理片在线播放av一区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久这里只有精品19| 日韩精品免费视频一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲人成电影免费在线| 亚洲视频免费观看视频| 在现免费观看毛片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久av网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 老司机在亚洲福利影院| e午夜精品久久久久久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 国产在线免费精品| 亚洲三区欧美一区| 日韩av免费高清视频| 免费高清在线观看日韩| 老司机靠b影院| 久久久精品94久久精品| 国产精品av久久久久免费| 亚洲国产成人一精品久久久|