郭麗嶸 ,趙偉 ,楊麗 ,陳海娟 ,楊志剛 , ,李一蒙, ,
1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2.青海師范大學(xué)高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院,青海 西寧 810016;3.青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810008;4.蘭州大學(xué)隴藥協(xié)同創(chuàng)新中心,甘肅 蘭州 730000
鬼箭羽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛Euonymus alatus(Thunb.)Sieb.的干燥具翅狀物的枝條或翅狀物[1]。全國除東北、新疆、青海、西藏、廣東及海南外,其余各地均產(chǎn),具有較高的藥用、觀賞及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鬼箭羽含有豐富的化學(xué)成分,包括黃酮類、甾體類、木脂素類、強(qiáng)心苷類、生物堿類、苯丙素類、萜類、揮發(fā)油類、酚酸類等[2-3]。古籍記載鬼箭羽主要用于治療女子?jì)D科經(jīng)血疾病及殺蟲驅(qū)邪。藥理研究表明,鬼箭羽提取物有明顯的降血糖、降血脂、降血壓、抗過敏、抗炎及保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞等作用,在治療糖尿病、慢性腎炎、盆腔炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等方面效果顯著[4-6]。衛(wèi)矛屬植物眾多,分布廣泛,植物形態(tài)相似,極易混淆,鑒別難度大?!肚Ы鹨矸健酚涊d,鬼箭羽與天麻苗均具有赤箭、鬼督郵等別稱。明代《本草崇原》將天麻苗描述為“赤箭。春生苗,中抽一莖直上如箭竿,色正赤,貼莖梢之半,微有小紅葉,遠(yuǎn)看如箭之有羽,根形如王瓜,皮色黃白,曬干則黑,去根三五寸,有游子環(huán)列如衛(wèi),皆有細(xì)根如白發(fā),氣相通而實(shí)不相連”,由此可知,蘭科植物天麻在形態(tài)上與鬼箭羽相似。這導(dǎo)致正品與偽品混用現(xiàn)象層出不窮,給用藥安全帶來很大隱患。因此,為控制鬼箭羽藥材質(zhì)量,建立一種快速準(zhǔn)確的鑒別方法尤為重要。
傳統(tǒng)的藥材鑒別手段主要包括性狀鑒定、基原鑒定、顯微鑒定及理化鑒定等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,DNA條形碼分子鑒定法的出現(xiàn)對傳統(tǒng)鑒別手段進(jìn)行了有效補(bǔ)充。DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的DNA片段對物種進(jìn)行鑒定,不受樣品的形態(tài)和性狀的影響[7-8]。目前,植物類中藥材常選用細(xì)胞核基因組中的ITS2(Internal Transcribed Spacer 2)和葉綠體基因組中的psbA-trnH基因區(qū)間序列進(jìn)行鑒別。本研究將DNA條形碼技術(shù)用于鬼箭羽藥材的鑒別,比較鬼箭羽與其近源種的親緣關(guān)系,建立快速鑒別鬼箭羽及其混偽品的方法,為后續(xù)鬼箭羽的質(zhì)量控制及安全用藥提供分子依據(jù)。
GE9612T-S型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(北京柏恒科技有限公司),ChampGel 6000型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司),D1524R型高速冷凍離心機(jī)(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司),Vortex 3000型渦旋混合器(WIGGENS labortechink GmbH公司),Nano-400A型超微量核酸分析儀(杭州奧盛儀器有限公司),Smart-S15型超純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。
Genomic DNA Kit試劑盒(批號P81019)、DNA凝膠回收試劑盒(批號03921KE1),北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;GelstainRed核酸染料(批號210611L1-7),上海百賽生物技術(shù)股份有限公司;100 bp Marker(批號01000/60531),康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;KOD-Plus-Neo(批號067000),TOYOBO;西班牙瓊脂糖(批號111860)、50×TAE電泳緩沖液(批號21335470)、6×DNA loading buffer(批號01454/36320),蘭州勵合生物科技有限公司。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。
16批鬼箭羽藥材,分別為來源于四川、河南、山東、江西等地的野生種(見表1),經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院李建銀講師鑒定,為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛Euonymus alatus(Thunb.)Sieb.的干燥具翅狀物的枝條或翅狀物。鬼箭羽近源種西南衛(wèi)矛Euonymus hamiltonianus、歐洲衛(wèi)矛Euonymus europaeus、白杜衛(wèi)矛Euonymus maackii、冬青衛(wèi)矛Euonymus japonicus、衛(wèi)矛Euonymus alatus、扶芳藤Euonymus fortunei、紫花衛(wèi)矛Euonymus porphyreus、栓翅衛(wèi)矛Euonymus phellomanus及混偽品大果榆Ulmus macrocarpa序列均來源于GenBank數(shù)據(jù)庫(見表2)。
表1 鬼箭羽樣品來源信息
表2 鬼箭羽近源種及其偽品序列信息
2.1.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序
用酒精擦拭藥材表面,待藥材表面酒精揮干,粉碎后過5號篩,稱取樣品粉末約20 mg,使用全式金Genomic DNA Kit試劑盒提取總DNA。使用通用引物ITS2F (5” -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3” ) 和ITS3R(5” -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3” )進(jìn)行ITS2序列擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系為50 μL,擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性2 min;98 ℃、10 s,55 ℃、30 s,68 ℃、45 s,33個(gè)循環(huán);94 ℃,5 min,4 ℃保存。DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后將擴(kuò)增的基因送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行一代測序。
2.1.2 種內(nèi)及種間遺傳距離分析
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為450~470 bp,條帶清晰無裂解(見圖1),表明ITS2序列擴(kuò)增效果好,純化回收后測序可獲得高質(zhì)量的堿基序列。測序后去除兩端5.8S和28S rDNA區(qū)段獲得ITS2標(biāo)準(zhǔn)序列,其長度為212 bp,GC含量為67.4%~67.9%。序列對比結(jié)果表明,16條序列僅在第100個(gè)位點(diǎn)處存在差異,其中,GJY4、GJY5、GJY6、GJY9、GJY10、GJY14為C,其他樣品為T,共獲得2個(gè)單倍型(見圖2),表明不同產(chǎn)地所產(chǎn)鬼箭羽的種內(nèi)變異率低,具有較高的遺傳穩(wěn)定性?;贙2P雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離,不同產(chǎn)地不同藥材市場鬼箭羽的種內(nèi)最大K2P為0.004 7,平均K2P為0.002 4,種間最大K2P為0.126 2,種間平均K2P為0.082 1,鬼箭羽與混偽品最小K2P為0.405 8,最大K2P為0.430 6,見表3~表4。
表3 鬼箭羽樣品種內(nèi)遺傳距離
表4 鬼箭羽與近源種和混偽品的遺傳距離
圖1 鬼箭羽樣品ITS2擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳
圖2 鬼箭羽樣品間ITS2序列對比
測序峰圖利用CodonCode Aligner 3.0校對拼接,去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū),獲得一致性序列。所有序列使用隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列,其中5.8S rRNA的保守序列為CGAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCA,28S rRNA的保守序列為CGACCCCAGGTCAGG CGGGAACACC。將得到的所有序列用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 7.0軟件分析比對后用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。
使用MEGA 7.0軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫選取的8種近源種及1種偽品和16批鬼箭羽藥材ITS2序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹(見圖3)。系統(tǒng)聚類樹結(jié)果表明,GJY1~GJY16與西南衛(wèi)矛、歐洲衛(wèi)矛、白杜衛(wèi)矛、冬青衛(wèi)矛、扶芳藤、栓翅衛(wèi)矛、紫花衛(wèi)矛并為一個(gè)大分支,可以明顯看出,GJY1~GJY16與衛(wèi)矛屬材料親緣關(guān)系較近,而其偽品大果榆自成一支,表明ITS2序列作為DNA條形碼,能將鬼箭羽與其混偽品分開。
圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的鬼箭羽及其混偽品NJ系統(tǒng)發(fā)育樹
中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則已被列入2020年版《中華人民共和國藥典》(四部)通則,在中藥鑒定方面廣泛研究與應(yīng)用,為傳統(tǒng)中藥鑒定學(xué)的發(fā)展提供了新的理論和技術(shù)支撐[9-10]。劉金欣等[11]通過建立黃芩ITS2數(shù)據(jù)庫并對黃芩種子的ITS2序列進(jìn)行分子鑒定,發(fā)現(xiàn)黃芩的種內(nèi)序列變異小于種間序列變異,構(gòu)建的黃芩ITS2條形碼數(shù)據(jù)庫穩(wěn)定可靠,表明DNA條形碼可用于黃芩種子的物種鑒定。孫稚穎等[12]通過鑒定羌活及其混偽品的ITS2序列并比較了ITS2的二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)羌活種內(nèi)平均遺傳距離遠(yuǎn)小于與其混偽品的種間平均遺傳距離,ITS2結(jié)構(gòu)上也有明顯差異,表明ITS2序列作為DNA條形碼可方便快捷地鑒別羌活與其混偽品。
1963年版《中華人民共和國藥典》將鬼箭羽的來源描述為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛的干燥具翅狀物枝條[13]。1993年版《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(二)》記載鬼箭羽藥材來源為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛E. alatus、同屬植物栓翅衛(wèi)矛E. phellomanus及同屬植物毛脈衛(wèi)矛E. alatusvar.pubescens[14]。2009年版《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》亦有類似說明[15]。目前,鬼箭羽基原已基本確定為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛,隨著臨床應(yīng)用日益增多,在市場流通過程中常有榆科植物大果榆的莖冒充鬼箭羽,值得注意的是,大果榆的干燥莖亦具有不規(guī)則木栓翅,判定時(shí)仍存在困難,使用時(shí)應(yīng)注意鑒別[16-17]。
本研究采用DNA條形碼技術(shù),通過對不同產(chǎn)地不同藥材市場16批鬼箭羽ITS2序列分析,發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)保守性高,種內(nèi)變異率低,具有較高的遺傳穩(wěn)定性,可以將非變異材料的ITS2序列作為對照序列來鑒定正品鬼箭羽。此外,從K2P遺傳距離可以看出,本研究16批鬼箭羽樣品與其近源種的種內(nèi)種間遺傳距離遠(yuǎn)小于與其混偽品的遺傳距離,在NJ系統(tǒng)聚類樹上也可以看到16批鬼箭羽與其近源種成一個(gè)大分支,混偽品自成一支,其中,以往被作為鬼箭羽入藥的栓翅衛(wèi)矛與衛(wèi)矛聚為不同的支,而衛(wèi)矛與16批鬼箭羽樣品聚為一支,能夠明顯區(qū)分,可為后續(xù)研究提供參考。