馬立克氏病病毒活載體疫苗的研究進(jìn)展

王子書

（徐州市賈汪區(qū)畜牧獸醫(yī)站 江蘇徐州 221011）

馬立克氏?。╩arek's disease，MD），是當(dāng)前危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的主要禽類傳染病之一，是由馬立克氏病病毒（marek's disease virus，MDV）引起的一種高度接觸性腫瘤病，以外周神經(jīng)、虹膜、性腺、肌肉、各種內(nèi)臟器官和皮膚等處形成淋巴腫瘤為主要特征[1,2]。目前，MDV 已發(fā)現(xiàn)的有3 個(gè)血清型，即致病性的血清I 型（MDV-1），根據(jù)其毒力分為弱毒株（mMDV）、強(qiáng)毒株（vMDV）、超強(qiáng)毒株（vvMDV）和特超強(qiáng)毒株（vv+MDV）[3]；血清II 型（MDV-2）是非致瘤性的自然弱毒株；血清III 型（MDV-3）是火雞皰疹病毒（herpes virus of turkey，HVT）。其中，血清I 型中的vvMDV 和vv+MDV 的一些野毒株能在免疫過CVI988/Rispens 株的雞群中引發(fā)嚴(yán)重的疾病。MDV 的主要宿主是雞，傳染源為病雞和帶毒雞，病毒從羽毛囊中排出，經(jīng)呼吸道侵入機(jī)體內(nèi)。MD 病程較長，雛雞易感，死亡率較高，目前針對(duì)MD 尚無特效治療藥物，但已研發(fā)了有效的商品疫苗。但隨著MDV 毒力的不斷增強(qiáng)，其流行及危害也不斷上升，嚴(yán)重?fù)p害養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，研發(fā)安全有效的疫苗迫在眉睫。

疫苗包括傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗。目前傳染病流行情況復(fù)雜，抗原變異迅速，滅活疫苗只能誘導(dǎo)體液免疫，且接種劑量大，需添加佐劑，成本過高，在滅活的過程中，還可能存在滅活不完全、病毒逃逸等風(fēng)險(xiǎn)。弱毒疫苗雖產(chǎn)生免疫力快，但存在致弱毒株毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，還可能加劇病毒的變異[4]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，用活病毒作載體來表達(dá)異源基因的重組活載體疫苗為當(dāng)前疫苗研究的熱點(diǎn)?；蚬こ讨亟M活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將一種或幾種病原的保護(hù)性抗原基因插入到活載體中并使之在體內(nèi)表達(dá)出保護(hù)性抗原的活疫苗[5]。該類疫苗不僅免疫效力高，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫比較廣泛，還兼具成本和安全優(yōu)勢(shì)，能同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因可制成多價(jià)或多聯(lián)疫苗，達(dá)到一針防多病的目的，簡化免疫程序，能克服不同病毒弱毒苗間產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象，減輕了動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，具有廣泛的應(yīng)用前景，是當(dāng)今及未來疫苗研發(fā)的主要方向之一。

1 MDV 作為疫苗載體的優(yōu)勢(shì)

MD 作為可用疫苗預(yù)防的腫瘤性疾病，接種疫苗是有效控制MD 的主要手段。HVT 是最早能安全有效控制MD 的疫苗，MDV-2用作疫苗的保護(hù)力較低，但將HVT 和MDV-2 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)生的保護(hù)效力會(huì)提升，這種保護(hù)性協(xié)同作用已被證明對(duì)MDV-2 和MDV-3 組合具有特異性，但不適用于MDV-1 和MDV-2，因此，MDV-2 病毒通常用于二價(jià)或三價(jià)疫苗制劑[6]。自20 世紀(jì)70 年代以來，HVT、HVT+SB-1 雙價(jià)疫苗、CVI988/Rispens 株弱毒活疫苗和814 疫苗等都曾先后成為有效預(yù)防MD 的疫苗?；蚬こ碳夹g(shù)為開發(fā)MD 疫苗提供了新路徑，MDV 屬于α-皰疹病毒，是大分子DNA病毒，其弱毒株可作為表達(dá)外源基因的病毒載體[7]。MDV 作為載體目前受到廣泛關(guān)注，它有以下優(yōu)點(diǎn)：①M(fèi)DV 載體疫苗可胚內(nèi)或1 日齡接種，誘導(dǎo)早期免疫保護(hù)，并且產(chǎn)生較長時(shí)間的免疫反應(yīng)，有利于外源蛋白的持續(xù)表達(dá)，免疫保護(hù)效果較為理想；②MDV 基因組龐大，可插入多個(gè)或較長的外源基因，有利于構(gòu)建多價(jià)或多聯(lián)重組活載體疫苗，而且遺傳穩(wěn)定；③MDV 為細(xì)胞結(jié)合型病毒，可突破母源抗體的干擾；④MDV 載體疫苗既能預(yù)防MD，還可預(yù)防其他的病毒性家禽疾病，且MDV 的自然宿主僅限于禽類，對(duì)其他家畜和人類是安全的[8]。

2 病毒載體的構(gòu)建方法

目前構(gòu)建MDV 重組活載體疫苗主要采用的是同源重組法（homologous recombination，HR）和細(xì)菌人工染色體法（bacterial artificial chromosome，BAC）。因MDV 基因組龐大，利用同源重組法構(gòu)建過程繁雜，效率較低。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,利用BAC 技術(shù)，通過同源重組法將BAC 載體功能序列mini-F 插入到病毒基因組中的某個(gè)位點(diǎn)，用獲得的重組病毒基因組DNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用有限稀釋法純化出重組病毒[9]。該方法可以方便地在體外操作，而且具有遺傳穩(wěn)定、容量大、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景十分廣闊。但BAC 自身的序列難以去除，導(dǎo)致獲得的重組病毒帶有非必要的外源基因序列，存在安全隱患。除了以上兩種方法，目前采用的還有Fosmid多片段拯救系統(tǒng)、CRISPR/Cas9 系統(tǒng)等基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9與同源重組和BAC 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于操作簡便、成本低及無外源基因干擾等。

3 MDV 活載體疫苗的研究進(jìn)展

近年來，國內(nèi)外研究人員都在致力于重組MDV 活載體疫苗的研制，多家實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建了重組MDV 疫苗。HVT 是構(gòu)建表達(dá)外源抗原基因重組活載體疫苗和誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫最有效的載體之一，普遍使用的方法是將HVT 基因組克隆到黏粒（cosmid）或細(xì)菌人工染色體（BAC）中，利用反向遺傳操作，使其他病毒的保護(hù)性抗原基因能夠快速定向性地插入到HVT 基因組中[10]。用HVT重組病毒表達(dá)MDV-1 抗原的優(yōu)點(diǎn)是二者有交叉抗原反應(yīng)且HVT在雞體內(nèi)維持時(shí)間長，因此可用大量的HVT 蛋白來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[11]。由于HVT 的疫苗生產(chǎn)成本低，可凍干，使用方便，易于保存和運(yùn)輸；同時(shí)，HVT 對(duì)雞無致病性，不產(chǎn)生任何副作用，也不發(fā)生水平傳播，從而降低了重組活載體疫苗散毒的風(fēng)險(xiǎn)。例如，以HVT 為載體構(gòu)建表達(dá)MDV gB 基因的重組病毒，具有MDV-HVT 二價(jià)苗優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)更安全且易保存。1992 年Nilkura 等[12]以HVT 為載體，構(gòu)建出表達(dá)MDV gB 基因的重組病毒在保證安全性的基礎(chǔ)上保留了與HVT 同等的免疫效果。研究表明，與傳統(tǒng)IBDV 疫苗相比，rHVT-VP2 重組疫苗對(duì)預(yù)防雞傳染性法氏囊病十分有效，不僅對(duì)法氏囊沒有損害，而且在含有母源抗體的雞中也能誘導(dǎo)產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)效果，在國內(nèi)外市場(chǎng)取得了巨大成功，已作為商業(yè)化疫苗廣泛應(yīng)用于商品雞中。此外，研究表明MDV-2 和HVT 疫苗之間存在協(xié)同保護(hù)作用，因此將MDV-2 用作載體前景廣闊[13]。

然而，由于MDV 毒力不斷增強(qiáng)，HVT 防控效果正在減弱，利用MDV-1 疫苗作為載體更具有現(xiàn)實(shí)意義。20 世紀(jì)90 年代，MDV-1開始作為表達(dá)IBDV、NDV、AIV 的載體。1999 年，有學(xué)者[14]采用CVI988 疫苗株為載體，構(gòu)建了表達(dá)IBDV VP2 基因的重組MDV 疫苗，對(duì)MD 和IBD 有較強(qiáng)保護(hù)力。Cui 等[15]以MDV-1 為載體構(gòu)建的rMDV-HA 重組疫苗獲得了比以HVT 為載體的rHVT-HA 重組疫苗更好的免疫保護(hù)效果。李凱[16]用MDV-1 弱毒疫苗株814 作為載體，構(gòu)建表達(dá)IBDV VP2 基因的重組MDV 活載體疫苗有望成為一種可以同時(shí)高效預(yù)防IBDV 和MDV 的二聯(lián)活疫苗。近年來，國內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室利用MDV 的常規(guī)疫苗成功構(gòu)建了多個(gè)重組MDV 疫苗。

4 結(jié)論與展望

多數(shù)研究表明，活載體疫苗的研究和應(yīng)用具有廣闊的開發(fā)前景?；蛑亟M活載體疫苗有望成為今后控制MD 的主要疫苗，關(guān)于重組MDV 活載體疫苗的研究進(jìn)展明顯，多種病原體保護(hù)性抗原在MDV 載體中成功表達(dá)，部分重組MDV 活載體疫苗已取得獸藥證書，為進(jìn)一步控制MD 提供可能。但也存在一些局限性。例如，哪些病毒基因與免疫或毒力有關(guān)，以及必須表達(dá)哪些基因組合才能生產(chǎn)出有效的疫苗，目前的知識(shí)尚且有限，還需要更多研究。此外，對(duì)MDV 的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)以及現(xiàn)有疫苗的保護(hù)機(jī)制還不是完全了解，對(duì)涉及MDV 在感染和傳播中的基因也需要更加深入地了解[17]。為構(gòu)建出理想的MDV 重組疫苗，不僅要考慮影響重組疫苗效果的關(guān)鍵因素，例如抗原基因、病毒載體、插入位點(diǎn)等方面的選擇，還要兼顧生物安全性，因此常規(guī)使用的疫苗株是構(gòu)建MDV 載體的最佳選擇。未來基因重組活載體疫苗的發(fā)展應(yīng)該以提高疫苗的安全性與靶向性為主要方向，為畜禽等動(dòng)物傳染性疾病防治以及食品安全提供重要保障?！?/p>