針刺腧穴“降壓方”對自發(fā)性高血壓大鼠ACEAngⅡ-AT1R軸及Profilin-1的影響*

張 銘 董愛愛 冀雨芳 崔依依 李盼麗 郭繼龍△

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)分子中醫(yī)藥學(xué)國家級國際聯(lián)合研究中心，山西 太原 030024；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030024；3.河北省保定市第一中醫(yī)院，河北 保定 071000）

近年來隨著生產(chǎn)生活水平的逐步提高、人口老齡化速度的逐漸加快，人們生存壓力不斷增大，飲食、作息時(shí)間不規(guī)律，且大量攝入高脂、高鹽、高糖飲食又缺少鍛煉，導(dǎo)致我國被診斷為原發(fā)性高血壓的患者逐年增加。長期血壓的增高使人的情緒易激動，行為習(xí)慣、日?；顒影l(fā)生改變。隨著高血壓的發(fā)生、發(fā)展，會產(chǎn)生一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，如心腦血管疾病、腎臟病變等［1］，不僅給人們的日常生活造成嚴(yán)重的影響，而且長期服藥會給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床報(bào)道中醫(yī)針刺有良好的降壓作用［2］。韓玉慧等［3］通過計(jì)量分析發(fā)現(xiàn)針刺治療自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）效果顯著，為針刺治療原發(fā)性高血壓方面提供了參考。基于課題組對全國名老中醫(yī)冀來喜的腧穴“降壓方”的針刺研究［4］，筆者采用SHR模型，探討針刺腧穴“降壓方”是否通過影響血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）-血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）-血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）軸及前纖維蛋白-1（Profilin-1）來實(shí)現(xiàn)降壓?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取30只體質(zhì)量250～290 g的12周齡清潔級雄性SHR，選取15只同周齡、同性別、相似體質(zhì)量的清潔級WKR，實(shí)驗(yàn)中所用大鼠全部購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室。在適宜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度22～25℃，相對濕度45%～65%，通風(fēng)、光照良好，室內(nèi)清潔安靜。所有大鼠均自由攝食、飲水，飲水瓶每日均予以消毒更換。大鼠墊料每3日更換1次。飼養(yǎng)和操作符合山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會規(guī)定。

1.2 儀器與試劑

大鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（泰盟有限公司，BP-600A），一次性無菌針灸針（北京太和醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.22 mm×25 mm）；超級恒溫水浴箱（成都泰盟軟件公司，型號：HW-500），高速臺式離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司，型號：HC-3018），病理切片機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用公司，型號：YGQ-3），石蠟包埋機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用公司，型號：YB-6LF），生物顯微鏡（重慶市澳浦光電公司，型號：UB102i）；不同濃度酒精（貨號：G1114）、復(fù)合消化液（貨號：G1006）、PBS緩沖液（貨號：G1006）、二甲苯（貨號：G1114）、二抗羊抗兔IgG-HRP（貨號：814）均購自Servicebio；AngⅡ ELISA試劑盒（貨號：EK0585）、ACE ELISA試劑盒（貨號：EK0585）；SABC免疫組化染色試劑盒（貨號：EK0585）；DAB底物顯色試劑盒（貨號：EK0585）均購自BOSTER。

1.3 分組與干預(yù)

將30只SHR按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組15只、針刺組15只，另外15只WKR作為正常對照組，并編號標(biāo)記。針刺組針刺腧穴“降壓方”：人迎穴、曲池穴、足三里穴（雙側(cè)）。取穴：人迎穴［兩側(cè)下頜骨髁突連線下（8.00±0.30）mm，前正中線旁開（5.50±0.40）mm］［5］，直刺（5.00±0.20）mm；曲池穴［橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷中］［6］，直刺（4.00±0.50）mm；足三里穴［位于后腿外側(cè)，略低于膝蓋，脛骨嵴的外側(cè)中間，約在脛骨和腓骨腹側(cè)肌肉的中間部位，在腓骨小頭下約5 mm處］［6］，直刺（7.00±0.50）mm。模型組隨意在大鼠軀干部位針刺，針刺手法和針刺組相同。對照組無針刺干預(yù)，其他操作和另外兩組相同。實(shí)驗(yàn)中留針30 min，每間隔10 min行針1次，輕微提插捻轉(zhuǎn)，每次1 min。周一至周六每天干預(yù)1次，周日休息進(jìn)行測血壓、記錄行為變化，持續(xù)4周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血壓 采用尾壓測量法：在適宜的環(huán)境中使大鼠尾動脈充分?jǐn)U張，于大鼠安靜狀態(tài)下應(yīng)用BP-600A泰盟全自動無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測量。如果測量過程中出現(xiàn)大鼠活動使血壓波形紊亂，需要重新測量，最終血壓值是在大鼠穩(wěn)定狀態(tài)下連續(xù)測量3次求取的平均值。血壓測量均在周日12∶00～16∶00進(jìn)行。

1.4.2 行為變化 由3位課題組成員分別對實(shí)驗(yàn)中的所有大鼠進(jìn)行打分和記錄，最后對3組的記分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。一般行為觀察：毛色光澤、攝食量、飲水量、二便形態(tài)等，每日觀察并做記錄。易激惹程度［7］：1分為捉拿頸部時(shí)尖叫、驚跳；2分為捉持頸部時(shí)憤怒、欲咬人；3分為提拿尾部時(shí)即出現(xiàn)尖叫、驚跳，甚至欲傷人或同籠大鼠頻繁撕咬，或啃咬鼠籠。上述情況不明顯者為0分，每周測量血壓時(shí)記錄。

1.4.3 AngⅡ、ACE含量 針刺結(jié)束后禁食給水，麻醉下行腹主動脈取血5 mL，將血清放置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，用塑料離心管分裝，按照ELISA試劑說明書方法測定大鼠血清中AngⅡ、ACE的含量。

1.4.4 AT1R、Profilin-1表達(dá) 剪取約0.5cm胸主動脈放入包埋框中，清水沖洗后乙醇脫水，二甲苯透明后浸蠟、包埋、切片。二甲苯脫蠟后，H2O2滅活內(nèi)源性酶、消化液抗原修復(fù)，5%BSA封閉孵育盒，滴加稀釋的一抗（AT1R配置比例為1∶100 PBS液；Profilin-1配置比例為1∶500 PBS液）。在4℃環(huán)境中過夜后滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，常溫放置30 min后擦去多余液體，滴加SABC，DAB顯色。在顯微鏡400倍鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表現(xiàn)，運(yùn)用Image-ProPlus6.0系統(tǒng)圖像對圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，隨機(jī)選取5個(gè)視野測定每張切片的平均光密度值（IOD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析；等級資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間血壓變化的比較

見表1。針刺前與對照組相比，模型組、針刺組收縮壓（SBP）及舒張壓（DBP）均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和針刺組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針刺1周后，與針刺相比，模型組血壓有所升高，針刺組血壓有所下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；針刺組與模型組相比，SBP及DBP均稍有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針刺2周后，與針刺前及針刺1周后相比，模型組SBP及DBP逐漸上升，針刺組SBP及DBP逐漸下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；針刺組與模型組相比，SBP及DBP均呈現(xiàn)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺3周及4周后，針刺組與模型組相比，SBP及DBP均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)SBP、DBP水平比較（kPa，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)SBP、DBP水平比較（kPa，±s）

注：與對照組同時(shí)期比較，*P＜0.05；與模型組同時(shí)期比較，△P＜0.05。下同。

組別對照組（n=15）模型組（n=15）針刺組（n=15）時(shí)間針刺前第1周第2周第3周第4周針刺前第1周第2周第3周第4周針刺前第1周第2周第3周第4周SBP 16.89±2.52 16.62±2.32 16.91±2.66 16.60±2.92 16.226±2.56 24.91±1.77*25.12±1.98*25.34±1.93*25.65±1.99*25.84±1.82*25.17±1.81*23.78±2.70*23.07±2.58*△21.12±2.80*△19.28±3.01*△DBP 13.04±1.98 12.76±2.05 12.91±1.99 12.61±1.88 12.23±2.43 19.72±2.21*19.79±2.63*19.98±2.05*20.19±1.87*20.39±1.81*19.85±2.48*19.39±2.90*18.51±2.44*△17.67±2.27*△16.53±2.08*△

2.2 各組大鼠行為變化的比較

見表2。對照組大鼠狀態(tài)較好，表現(xiàn)為毛色有光澤鮮亮，攝食、飲水量充足，淡黃色小便，顆粒狀大便軟硬適中。模型組大鼠毛色暗淡無光澤，攝食、飲水量減少，掉毛較多，小便顏色較深且量少，大便稀薄或不能成形，量少。針刺組大鼠毛色欠光澤，但掉毛較模型組少，且攝食、飲水量較模型組增加，二便基本同對照組。實(shí)驗(yàn)前，模型組和針刺組大鼠警惕、應(yīng)激狀態(tài)明顯，同籠間經(jīng)常有打斗、撕咬現(xiàn)象，評分高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；針刺組和模型組易激惹程度相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠持續(xù)表現(xiàn)為應(yīng)激、狂躁、易激惹狀態(tài)，啃咬鼠籠、雙后肢站立和同籠大鼠間打斗等現(xiàn)象，并可見外抓傷。針刺組大鼠在針刺前和針刺1周時(shí)，與模型組表現(xiàn)相似，針刺時(shí)掙脫現(xiàn)象明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；針刺2周后，順從性好轉(zhuǎn)，激惹程度下降，與其他兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；從第3至4周結(jié)束時(shí)，激惹程度持續(xù)下降，與同期模型組評分相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠易激惹程度評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠易激惹程度評分比較（分，±s）

組別對照組模型組針刺組n 15 15 15針刺前0.79±0.25 1.60±0.36*1.66±0.27*第1周0.82±0.27 1.73±0.38*1.71±0.35*第2周0.85±0.27 1.78±0.42*1.57±0.37*第3周1.02±0.39 1.82±0.36*1.21±0.28△第4周0.93±0.32 1.79±0.43*1.02±0.33△

2.3 各組大鼠血清中AngⅡ、ACE含量比較

見表3。針刺4周后，模型組與對照組相比，ACE、AngⅡ含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；針刺組較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠針刺4周后血清AngⅡ、ACE含量比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠針刺4周后血清AngⅡ、ACE含量比較（pg/mL，±s）

組別對照組模型組針刺組n 15 15 15 ACE 15.98±6.45 55.21±7.58*30.90±6.04△AngⅡ96.21±18.78 221.28±31.84*177.38±26.64△

2.4 各組大鼠主動脈組織中AT1R、Profiin-1表達(dá)比較

見表4、圖1。針刺4周后，模型組與對照組相比，AT1R、Profiin-1陽性表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；針刺組陽性表達(dá)較模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠主動脈AT1R、Profilin-1免疫組化（400倍）

表4 各組大鼠主動脈組織AT1R及Profilin-1的表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠主動脈組織AT1R及Profilin-1的表達(dá)比較（±s）

組別對照組模型組針刺組n 15 15 15 AT1R 0.35±0.03 0.87±0.08*0.68±0.05△Profilin-1 0.27±0.03 0.72±0.08*0.53±0.04△

3 討論

原發(fā)性高血壓的病名在中醫(yī)古籍中沒有相關(guān)記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸于“頭痛病”“眩暈病”等，在臨床應(yīng)用中針刺治療高血壓的取穴多集中于多氣多血的手足陽明經(jīng)上。實(shí)驗(yàn)前筆者對冀來喜教授的腧穴“降壓方”組成進(jìn)行資料查詢發(fā)現(xiàn)，人迎穴、足三里穴、曲池穴單穴降壓效果明確：針刺人迎穴降壓的機(jī)制可能與其周圍有豐富的神經(jīng)分布有關(guān)，進(jìn)而影響神經(jīng)信號傳導(dǎo)來達(dá)到降壓目的［8］。張紅星等［9］通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)針刺曲池穴降壓起效時(shí)間明顯早于舌下含服硝苯地平片；針刺足三里穴可抑制交感神經(jīng)興奮性而發(fā)揮其降壓作用［10］。關(guān)于針刺降壓腧穴處方，以石學(xué)敏院士的“活血散風(fēng)，疏肝健脾”降壓針刺法降壓療效確切，又可減輕靶器官的損害，為臨床針刺降壓提供依據(jù)［11］，并兼有潛在抗焦慮、抗抑郁而達(dá)到降壓目的的作用［12］，體現(xiàn)了中醫(yī)針刺的整體調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究表明針刺1周時(shí)，模型組血壓較針刺前升高，針刺組血壓較針刺前有所下降，說明針刺腧穴“降壓方”可以降低血壓；在針刺2周后，模型組SBP及DBP持續(xù)上升，針刺組血壓逐漸下降且兩組相比針刺組SBP及DBP均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明連續(xù)針刺腧穴“降壓方”可使血壓持續(xù)降低；針刺第3、4周后，針刺組與模型組相比，SBP及DBP均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從上述結(jié)果可以看出連續(xù)針刺腧穴“降壓方”可在第2周后平穩(wěn)持續(xù)降低SHR的血壓。針刺過程中一般行為觀察結(jié)果表明：針刺前模型組、針刺組、對照組3組相比，模型組和針刺組較對照組表現(xiàn)出明顯的警惕、應(yīng)激狀態(tài)，且同籠中經(jīng)常有打斗、撕咬等現(xiàn)象，毛色光澤度、攝食、飲水量也有明顯差異。針刺組在針刺前和針刺1周后，與模型組表現(xiàn)相似，無明顯區(qū)別；針刺組針刺2周后，順從性好轉(zhuǎn)，激惹程度下降；針刺結(jié)束時(shí)，針刺組激惹程度明顯下降，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明模型組出現(xiàn)了易激惹程度高的病理行為改變。以上結(jié)果表明針刺腧穴“降壓方”可以改善高血壓一般行為特征。激惹程度增高是SHR交感亢進(jìn)的病理行為學(xué)表征。屈會化等［7］研究顯示，高血壓治療的療效可以從SHR宏觀表征和行為學(xué)改變更全面的反映出來。張志國等［13］通過SHR動物實(shí)驗(yàn)研究表明，長期血壓控制不佳易引起腦組織損傷，造成認(rèn)知功能障礙，并可引起行為改變。這些均與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，其中ACE、AngⅡ參與的對血壓調(diào)節(jié)有關(guān)鍵性作用［14］的RAAS是高血壓的主要發(fā)病機(jī)制之一。血壓的升高與RAAS的激活有直接關(guān)系，其中在心血管和血壓調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的ACE-AngⅡ-AT1R軸是RAAS的經(jīng)典途徑。近年來實(shí)驗(yàn)已證明RAAS系統(tǒng)中的核心活性肽AngⅡ在自發(fā)性高血壓大鼠血壓變化的病理生理過程中有重要意義［15］，隨著AngⅡ含量的增加血壓也在升高，AngⅡ的含量取決于ACE及其受體AT1R。對比本實(shí)驗(yàn)各組大鼠的AngⅡ含量，發(fā)現(xiàn)針刺4周后，針刺組與模型組相比有顯著差異，這說明針刺腧穴“降壓方”的降壓機(jī)制與AngⅡ密切相關(guān)。廣泛分布于體內(nèi)的激肽酶ACE通過轉(zhuǎn)化或降低酶活性使血漿和組織中的AngⅡ含量增加［16］，進(jìn)而激活RAAS使血壓升高。本實(shí)驗(yàn)中模型組的ACE含量較對照組明顯升高，針刺4周后，針刺組的ACE含量較模型組下降幅度明顯，說明針刺腧穴“降壓方”可能是通過降低ACE、AngⅡ含量，進(jìn)而抑制了RAAS的活性，達(dá)到使血壓下降的目的。

現(xiàn)已證明AngⅡ的大部分生理病理過程是通過AngⅡ受體AT1介導(dǎo)，并且該亞型在AngⅡ誘導(dǎo)的血管功能中起到主要作用［17］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法檢驗(yàn)各組大鼠AT1R的陽性表達(dá)，其中模型組較對照組棕黃色陽性表達(dá)十分明顯，說明AT1R在SHR主動脈中表達(dá)強(qiáng)烈，針刺4周后，針刺組較模型組棕黃色顆粒明顯減少，說明針刺腧穴“降壓方”是通過調(diào)節(jié)AngⅡ受體含量達(dá)到降壓的效果。在調(diào)節(jié)血管功能中起著重要作用的前纖維蛋白Profilin-1是一種小分子量的肌動蛋白的結(jié)合蛋白，從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出模型組的陽性表達(dá)明顯增多，說明隨著血壓的升高，血管功能降低，在針刺4周后，針刺組較模型組陽性表達(dá)降低，說明針刺腧穴“降壓方”能夠影響血管功能。

本實(shí)驗(yàn)所選用的動物模型是生長過程與人類原發(fā)性高血壓發(fā)展過程有很多相似之處的SHR，12周齡時(shí)的SHR出現(xiàn)外周阻力升高說明其存在小動脈硬化的病理損傷［18］，此時(shí)不僅需要降壓，還需要降低外周阻力，臨床高血壓也多處于此期。選用不具備高血壓特征且血壓穩(wěn)定與SHR同一品系的WKR作為正常對照組，通過觀察血壓及其行為的變化，分析評價(jià)針刺效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，針刺腧穴“降壓方”降壓效應(yīng)明確，降壓機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)ACE-AngⅡ-AT1R軸及Profilin-1實(shí)現(xiàn)的。