冠心病中醫(yī)證型代謝組學研究進展*

汪順偉 荊曉朔 歐 穎 陳善達 李 靜 謝夢洲 李 亮

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

大量研究表明中醫(yī)學治療冠心病療效確切。但冠心病證型缺乏客觀化標準及足夠的數(shù)據(jù)支持，使中醫(yī)證型本質(zhì)研究難以進行。代謝組學是系統(tǒng)生物學的重要分支［1-3］，被廣泛應(yīng)用于疾病早期診斷、藥學以及作用機制研究等領(lǐng)域［4-5］。其動態(tài)性、整體性、即時性的特點與中醫(yī)學的“整體觀”“辨證論治”核心理論不謀而合。本文通過代謝組學技術(shù)對冠心病證型研究進行評述，探討冠心病各證型代謝產(chǎn)物差異，將中醫(yī)學證型診斷與現(xiàn)代醫(yī)學客觀指標相結(jié)合，以期為冠心病不同證型客觀化標準提供理論支撐，有利于更好地揭露其證候本質(zhì)、指導疾病診斷及預后，發(fā)揮中醫(yī)學與現(xiàn)代醫(yī)學在冠心病診治上的優(yōu)勢。

1 代謝組學技術(shù)與冠心病中醫(yī)證型的關(guān)聯(lián)

中醫(yī)證型是發(fā)展的、變化的，包括病位、病因、病性等，能夠更全面、更深刻、更準確地揭示疾病本質(zhì)。而代謝組學是一門關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其變化規(guī)律的科學。二者在整體觀念上高度統(tǒng)一，均為整體中某一階段病理變化的本質(zhì)和發(fā)展趨勢的反映。

代謝組學主要技術(shù)平臺包括：核磁共振技術(shù)（NMR）［6-7］、質(zhì)譜（MS）［8］技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）［9］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）［10］、毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE/MS）、液相色譜與質(zhì)譜先后使用技術(shù)（LC/MS/MS）等。其中最常用的3種技術(shù)為 NMR、LC-MS、GC-MS［11-12］。代謝組學技術(shù)通過尋找中醫(yī)證型的標志代謝物，為中醫(yī)理論提供數(shù)據(jù)支持的同時，也為中醫(yī)的理論研究提供了新方法。

2 代謝組學技術(shù)在冠心病各證型中的應(yīng)用

2.1 核磁共振技術(shù)

2.1.1 心血瘀阻證 通過NMR探討心血瘀阻型冠心病的指紋代謝圖譜，易敏等［13］研究發(fā)現(xiàn)冠心病心血瘀阻證患者血漿代謝物中葡萄糖、3-羥基丁酸、極低密度脂蛋白水平升高，甘氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、磷脂酰膽堿、甘油磷脂酰膽堿、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、酪氨酸、甲酸鹽水平下降，提示以上15種代謝物可能是冠心病血瘀證血漿標志性代謝物。王勇等［14］采用NMR研究Ameriod縮窄環(huán)對冠心病血瘀證小型豬血清代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)樣本中檸檬酸、葡萄糖、γ-氨基丁酸、肌酸、谷氨酸、乳酸、蘇氨酸、β-羥丁酸、脯氨酸等糖類和氨基酸類代謝物的水平上升，極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量降低。說明冠心病心血瘀阻證代謝途徑主要為糖、脂、氨基酸類代謝，其中檸檬酸、乳酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸等分子可能成為冠心病心血瘀阻證的臨床診斷與治療靶標。史琦等［15］使用NMR檢測冠心病心血瘀阻證患者血漿樣本中內(nèi)源性小分子和大分子代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)心血瘀阻證患者血漿代謝物中脂類、脂類化合物、纈氨酸、異亮氨表達水平下降，賴氨酸、肌氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、乙酰谷氨酸、蘇氨酸、β-羥丁酸、天冬氨酸、肉堿、組氨酸、甲胺、丙酮、谷酰胺、低密度脂蛋白、膽堿、不飽和脂肪酸等的表達水平明顯升高。表明氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝互相影響，共同作用于冠心病的發(fā)生發(fā)展，以上代謝產(chǎn)物可能為鑒別心血瘀阻證的重要理化指標。

2.1.2 氣虛證 史琦等［16］使用NMR研究冠心病氣虛證患者血漿代謝物，發(fā)現(xiàn)乙酰谷氨酸、纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸、肉堿、天冬氨酸、谷酰胺含量降低，色氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、?；撬帷⒔M氨酸、谷氨酸含量上升，其中乙酰谷氨酸、纈氨酸、肉堿、賴氨酸可能是冠心病氣虛證的標志性代謝物，與糖、氨基酸、脂肪、能量代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)。華何與等［17］使用NMR研究冠心病氣虛證患者血漿代謝物，發(fā)現(xiàn)其代謝物中丙酮、檸檬酸、氧化三甲胺、3-羥基丁酸含量較高，酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、亮氨酸含量較低。通過數(shù)據(jù)對比，何華與等［17］發(fā)現(xiàn)NMR圖譜能夠有效區(qū)分氣虛證與心血瘀阻證。

2.1.3 痰濁證 易敏等［18］發(fā)現(xiàn)冠心病痰濁證患者血漿中有16種生物潛在標志物，為丙氨酸、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、纈氨酸、乳酸、谷氨酸、丙酮酸、肌酸、谷氨酰胺、膽堿、谷氨酰胺、丙酮酸、肌酸、檸檬酸鹽、組氨酸、甘氨酸、酪氨酸和甲酸鹽、葡萄糖、苯丙氨酸。除膽堿和葡萄糖水平升高外，其余代謝物水平均下降。由此可見，能量代謝是冠心病痰濁證血漿代謝中的重要環(huán)節(jié)。張紅栓等［19］研究冠心病痰濁證患者尿液代謝物，發(fā)現(xiàn)順式-烏頭酸、葡萄糖、丙酮、檸檬酸、α-酮戊二酸、3-羥基丁酸、酪氨酸、馬尿酸、肌酐、二甲胺、氧化三甲胺的含量高于血瘀證組，而膽汁酸及組氨酸的含量則低于血瘀證組，其涉及能量代謝、糖代謝、脂代謝等多個方面。而血漿NMR結(jié)果［20］顯示，痰濁證組存在能量代謝、氨基酸代謝紊亂以及嚴重脂質(zhì)代謝紊亂。其特異性標志物可能為丙氨酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂類化合物、酮體、高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白、天門冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酞胺、白蛋白賴氨酰、丙氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸。

2.2 色譜-質(zhì)譜技術(shù)

2.2.1 心血瘀阻證 通過GC-MS，牟菲等［21］發(fā)現(xiàn)冠心病心血瘀阻證與假手術(shù)組大鼠血清之間的內(nèi)源性代謝物差異生物標志物共14種，其中乳酸、3-羥基丁酸、硬脂酸、磷酸、十七酸、棕櫚油酸、花生四烯酸水平升高，而苯丙氨酸、谷氨酰胺、蘋果酸、延胡索酸、肌酸、檸檬酸及亞油酸水平降低。魏星等［22-23］采用GC-MS發(fā)現(xiàn)冠心病心血瘀阻證血漿的代謝標志物共23種，分別為異亮氨酸、L-絲氨酸、甲基丙二酸、L-纈氨酸、亮氨酸、L-蘇氨酸、L-焦谷氨酸、花生四烯酸、丙氨酸、檸檬酸、亞油酸、油酸、甘氨酸、棕櫚酸、異油酸、羥基乙酸、（9E）-9-十六烯酸、草酸、2-羥基丁酸、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖。周曼麗等［24］研究發(fā)現(xiàn)心血瘀阻證組與正常組大鼠心肌組織代謝物之間相比存在19種組間差異代謝物，并鑒定出苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸生物合成，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸生物合成，?；撬峒皝喤；撬岽x與氨酰-tRNA生物合成富集性顯著，可作為研究心血瘀阻證作用機制的代謝通路。李靜等［25］使用LC-MS研究發(fā)現(xiàn)冠心病心血瘀阻證與假手術(shù)組大鼠尿液代謝物存在36種差異，其中甘油、L-硒代蛋氨酸、尿嘧啶含量上升，N-乙酰基-L-天門冬氨酸、丙氨酰亮氨酸、D-丙氨酸、氨基葡萄糖6-磷酸、D-核糖5-磷酸、纈氨酸賴氨酸、丙氨酰谷氨酸、賴氨酰纈氨酸、草酰乙酸、丙酮酸、纈氨酸、D-木酮糖、脯氨酰脯氨酸、5'-磷酸吡哆醛、4-乙酰氨基丁酸、假尿苷、D-核糖、尿酸、海藻糖、1H-吲哚-3-甲醛、5-磷酸-α-D-核糖 1-二磷酸、α-D-核糖1，2-環(huán)磷酸鹽 5-磷酸鹽、脫氧腺苷、泛酸、N-乙酰丙酮酰谷氨酸、D-木糖醇、磷酸烯醇丙酮酸鹽、乳糖、L-硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、5-氨基咪唑-4-羧酰胺、D-葡糖醇-1，5-內(nèi)酯6-磷酸鹽、磷酸甘油含量減少，其機制涉及能量代謝失衡及氨基酸代謝、糖代謝、嘌呤代謝紊亂、脂質(zhì)堆積等多個方面。

2.2.2 氣陰兩虛證 朱明丹等［26］通過LC-MS研究發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛證組中苯丙氨酸、磷酸肌酸、甘氨酸、高絲氨酸、葡萄糖含量較低，提示氣陰兩虛證可能與氨基酸代謝水平低及能量代謝異常相關(guān)。朱萱萱等［27］使用GC-MS研究發(fā)現(xiàn)女性患者中氣陰兩虛型冠心病完全能和氣虛血瘀型、痰阻心脈型冠心病區(qū)分開來，但并未說明其具體差異代謝物。

2.2.3 氣滯血瘀證 朱明丹等［26］應(yīng)用LC-MS研究發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀證中葡萄糖、花生四烯酸、亞油酸顯著增高。楊小芳等［28］采用LC-MS發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀證樣本中組氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、?；撬帷⒘涟彼?、纈氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-組氨酸較對照組含量升高，谷氨酰胺、γ-氨基丁酸較對照組降低。

2.2.4 氣虛血瘀證 楊小芳等［28-29］采用LC-MS發(fā)現(xiàn)冠心病氣虛血瘀證和氣滯血瘀證血清樣本之間的差異物主要是瓜氨酸和組氨酸，在前者中升高更為明顯。尹春園等［30］使用LC-MS研究發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀證證型標志物為可能為亮氨酸和異丁肉堿，代謝途徑主要涉及能量代謝、脂肪酸氧化和磷酸膽堿代謝。徐利云等［31］基于LC-MS發(fā)現(xiàn)21個差異代謝物可能是氣虛血瘀證潛在生物標志物，其中花生四烯酸、脂肪酸酰胺、維生素B6、色氨酸引起的代謝紊亂可能是導致大鼠氣虛而無力推動血液運行的主要途徑。通過色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，陳浩等［32］認為天冬氨酰蛋酸和半胱氨酸亞磺酸可能成為此證型的潛在生物標志物。這為冠心病中醫(yī)辨證分型客觀化、標準化提供了重要理論支撐。

2.2.5 痰阻心脈證 程鵬等［33］使用GC-MS區(qū)分冠心病痰阻心脈證與氣虛證患者的血清代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了共46個化合物，其中絲氨酸和2-羥基丙酸可能成為區(qū)別該兩種證型的標準代謝物。鹿小燕等［34］使用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對比痰阻心脈證患者和心血瘀阻證患者血清代謝物，發(fā)現(xiàn)5-羥色胺/可替寧、溶血卵磷脂、蘋果酸、琥珀酸、果糖、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、棕櫚烯酸等在心血瘀阻證組中升高，而7，10-十六碳二烯酸和DPA在痰阻心脈證組中降低，由此可見其差異代謝物主要有果糖、葡萄糖、蘋果酸、琥珀酸、甘氨酸、丙氨酸以及棕櫚烯酸。

2.2.6 痰瘀互結(jié)證 具星等［35］對冠心病痰瘀互結(jié)證患者血清進行LC-MS，發(fā)現(xiàn)其特異代謝物為6-去氫睪酮葡糖苷酸、甘氨鵝脫氧膽酸、LTE4及Corchorifatty acid A。張妮等［36］通過LC-MS發(fā)現(xiàn)經(jīng)化瘀祛痰方治療后40個潛在代生物標志發(fā)生改變，涉及脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝、嘌呤代謝、維生素代謝等代謝途徑。李珠［37］使用LC-MS分析發(fā)現(xiàn)冠心病痰瘀互結(jié)證大鼠的血清樣本中丹蔞片主要通過能量代謝、類固醇激素代謝、甘油磷脂代謝以及氨基酸代謝等調(diào)節(jié)17個生物標記物［甜菜堿、γ-亞麻酸、亞油酸、11，14，17-二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、LPC（16∶1）、LPC（20∶4）、LPC（22∶6）、LPC（16∶0）、LPC（18∶1）、異丁酰肉堿、19-羥基脫氧皮質(zhì)酮、L-氯化棕櫚酰肉堿、精氨酸、5-羥基吲哚乙醛、L-辛?；鈮A、5-羥基色胺］，這些標記物中可能存在冠心病痰瘀互結(jié)證特異性代謝產(chǎn)物。采用LCMS，朱黎霞等［38］研究發(fā)現(xiàn)痰瘀互結(jié)證患者尿液存在13種差異代謝物，其中鞘脂類在兩組中差異最為明顯，其對細胞增殖、分化以及凋亡具有重要作用，能有效辨別冠心病痰瘀互結(jié)證型。

3 討論與展望

中醫(yī)學以整體觀為理論核心、以辨證論治為診療特點。代謝組學以代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)，研究疾病變化的動態(tài)代謝輪廓，二者十分相似。因此代謝組學能夠為冠心病各證型的實質(zhì)研究提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐，對其辨證、診斷和治療具有重要意義［39］。但檢索數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，使用代謝組學進行冠心病中醫(yī)證候分型的研究較少，其使用技術(shù)大部分為核磁共振技術(shù)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，其他技術(shù)研究極少?，F(xiàn)有證型研究不僅缺乏動物實驗研究，且臨床試驗樣本研究也較少。需研究人員在整合現(xiàn)有研究成果基礎(chǔ)上，不斷拓寬研究類型、豐富研究內(nèi)容，為冠心病中醫(yī)辨證分型研究提供實驗依據(jù)和方法。

本研究發(fā)現(xiàn)冠心病各證型代謝通路皆涉及氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、糖代謝等方面［40］。如心肌缺血后產(chǎn)生大量乳酸，激活糖異生途徑，將乳酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖，伴隨糖氧化障礙等使甘油三酯代謝異常，導致脂質(zhì)沉積，冠狀動脈粥樣硬化，且過量脂肪酸進入線粒體導致氧化磷酸化解耦聯(lián)［37］，使能量代謝產(chǎn)物消耗，進一步使線粒體功能失調(diào)從而加重冠心病的發(fā)生。因此氨基酸、能量、糖脂等各項相關(guān)代謝物可能成為評價不同證型冠心病特異性指標。所以代謝組學有望成為揭示冠心病不同“中醫(yī)證型”本質(zhì)的平臺，能夠為中醫(yī)臨床診療提供更加科學豐富的臨床檢測指標，但代謝組學技術(shù)還存在一些局限，首先，不同代謝組學檢測手段可能產(chǎn)生不同研究結(jié)果，尚不能對代謝產(chǎn)物進行全方面定性定量分析。其次，冠心病各證型中不同課題組使用的代謝組學技術(shù)不同，其研究結(jié)果的代謝物差異較大，無法在一定程度上保持高度一致，不利于冠心病不同證型的標志代謝物的標準化制定。各實驗研究中樣本種類及樣本量的不足對代謝組學檢測結(jié)果的準確性和可靠性有較大影響。最后，研究者所依托的數(shù)據(jù)庫標準未統(tǒng)一，在一定程度上延誤了冠心病各證型代謝標志物的研究進展，造成了一定的資源浪費。因此，增加樣本種類及樣本量，統(tǒng)一生物樣本采集與處理標準，加強科研人員之間的聯(lián)系，充分利用現(xiàn)有研究資源，使用多種聯(lián)合組學技術(shù)是未來代謝組學研究的關(guān)鍵舉措。