12-去氧佛波醇-13-棕櫚酸酯通過Fas/FasL通路調(diào)控K562細(xì)胞凋亡

馬立威 陳哲 李京 張洪濤 賈永明 劉吉成

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2公共衛(wèi)生學(xué)院；3附屬第三醫(yī)院；4藥學(xué)院)

白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差。按起病的緩急可分為急性白血病和慢性白血病兩大類。其中，K562細(xì)胞是慢性白血病中的慢性粒細(xì)胞性白血病的典型代表細(xì)胞，常被用于抗白血病的藥物研究。目前西醫(yī)對白血病的治療仍以化療為主要治療手段。近年來，由于化療方案的不斷完善，使白血病能夠得到一定的緩解，但化療帶來許多的不良結(jié)果不容忽視，諸如產(chǎn)生耐藥、骨髓抑制、白細(xì)胞低易感染、血色素低需輸血、血小板低出血等〔1〕。而中藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的作用特點(diǎn)，使得從中藥中尋找有效的抗腫瘤成分的研究成為熱點(diǎn)，也為探討中藥及其有效成分對白血病的治療研究提供了重要的方向。狼毒大戟為多年生的草本植物，根入藥，其味辛，性平，具有逐水祛痰，散結(jié)殺蟲的功效。中醫(yī)記載為毒性中藥，作為傳統(tǒng)中藥材，在臨床上常被用來治療腫瘤、癲癇等；民間用狼毒大戟根與大棗蒸食，用于晚期癌癥和癌癥術(shù)后治療，也用于抗炎、驅(qū)蟲等。12-去氧佛波醇-13-棕櫚酸酯(DP)有較好的抗腫瘤效果〔2～5〕。本研究旨在探討DP體外抗慢性粒細(xì)胞性白血病作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 白血病K562細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，本研究室液氮中保存。

1.2實(shí)驗藥物及試劑 DP由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院天然藥物化學(xué)實(shí)驗中心提供，4℃保存，使用時二甲基亞砜(DMSO)調(diào)成所需濃度(10 g/L)。RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司，批號：AD21582265)，胎牛血清(Hyclone公司，批號：NIJ1221)、雙抗(Hyclone公司，批號：1170005)，Hoechst33342-碘化丙啶(PI)染色液(南京建成試劑公司，批號：20160712)，DNA梯帶抽提試劑盒(TaKaRa公司，批號：AK1301)，半胱氨酸蛋白酶(caspase)3活性檢測試劑盒(碧云天試劑公司，批號：c1116)，PrimeScriptRT reagent Kit、SYBR PremixEx Tap、Trizol(TaKaRa公司，批號分別為：AK6002、AK8802、AI51028A)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(康為試劑公司，批號：00071407)，發(fā)光試劑盒(Thermo公司，批號：PA194447A)，Anti-Fas、Anti-FasL(Abcam公司，批號分別為：82419、15285)，Anti-caspase3、Anti-GAPDH、Anti-rabbit lgG HRP-linked(CST公司，批號分別為：#12、#06、#20)。

1.3主要儀器 Observer A1型熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)，3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，Safire2型酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)，IX51型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，7300型實(shí)時定量RCR儀(美國ABI公司)，ChemiDoc MP型全自動熒光及化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含雙抗(青-鏈霉素)及10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)，1～2 d傳代1次。實(shí)驗剩余細(xì)胞液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Hoechst33342/PI染色檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 待測細(xì)胞樣的準(zhǔn)備：取生長狀態(tài)良好的K562細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整濃度每2×105/ml，接種于6孔板中，每孔2 ml，同時按DP濃度分對照(control)組、DP 5 μg/ml組、DP 10 μg/ml組、DP 20 μg/ml組共4組，并對應(yīng)加入各孔中。按試劑說明書操作：收集藥物作用12 h的各組細(xì)胞于4 ml離心管中，分別加入Hoechst33342避光染色10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入PI避光染色5 min，PBS洗2次，后將各組染色細(xì)胞分別滴到載玻片上并蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測分析 待測細(xì)胞準(zhǔn)備同1.5。取出DP作用16 h的各組細(xì)胞于EP管中，離心棄上清加入PBS重懸細(xì)胞，按照DNA提取試劑盒說明書操作，分別加入RNaseA、蛋白酶K、裂解液混勻后放入70℃水浴中10 min；后加入無水乙醇混勻，可見白色絮狀沉淀，將帶沉淀的液體全部移到DNA純化柱內(nèi)；經(jīng)2次離心，洗滌液洗滌后，將DNA純化柱置于1.5 ml的EP管上，加入適量洗脫液，室溫放置10 min，離心收集到液體即為純化的總DNA。將得到的各組DNA液加至預(yù)先制備的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測、拍照。

1.7分光光度法檢測caspase3的相對活性 待測細(xì)胞準(zhǔn)備同1.5。取出DP作用12 h的各組細(xì)胞計數(shù)(2.0×106)后收集到EP管中，加PBS重懸細(xì)胞，離心棄上清。按試劑盒說明書，各組細(xì)胞中加100 μl裂解液，冰浴裂解15 min。4℃，13 000 r/min離心15 min，收集上清。按總體積100 μl設(shè)置反應(yīng)體系：空白組(檢測緩沖液90 μl + Ac-DEVD-pNA 10 μl)，樣品組(檢測緩沖液80 μl + 待測樣10 μl + Ac-DEVD-pNA 10 μl)，并加至96孔酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀405 nm處測定吸光度值(OD)，同時根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品(pNA)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)計算各樣品的pNA值，以pNA濃度反映caspase3酶的相對活性。

1.8qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá) 待測細(xì)胞準(zhǔn)備同1.5。取出DP作用12 h的各組細(xì)胞于1.5 ml的EP管中，離心棄上清，每管中加1 ml Trizon，提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度及純度；按照試劑說明書操作：通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR，以β-actin正義鏈：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，反義鏈：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′作為內(nèi)參基因，待測基因為caspase3正義鏈：5′-AGCAATAAATGAATGGGCTGAG-3′，反義鏈5′-GTATGGAGAA ATGGGCTGTAGG-3′、Fas正義鏈：5′-GCATCTGGACCCTCCTACCT-3′，反義鏈5′-TCCTCAATTCCAATCCCTTG-3′、FasL正義鏈：5′-GCACACAGCATCATCT TTGG-3′，反義鏈5′-GGACCTTGAGTTGGACTTGC-3′得到各組樣本的Ct值，并采用相對定量法，按下列公式，計算基因的相對表達(dá)量；基因的相對表達(dá)量=2-ΔΔCt〔注：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct對照基因)-(Ct內(nèi)參目的基因-Ct內(nèi)參對照基因〕。

1.9Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4.0×105/ml，每個培養(yǎng)皿(100 mm)加8.0 ml，同時加入不同濃度的DP(control組、5 μg/ml組、10 μg/ml組、20 μg/ml組)；培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12 h后收集細(xì)胞于4 ml的EP管中，PBS洗滌2次離心棄上清，每個管里加1.0 ml的含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白后，按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書操作，計算各樣品的蛋白濃度。提取的蛋白經(jīng)100℃水浴變性后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行分離，后經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗〔GAPDH、caspase3以無活性的前體(procaspase)3、Fas、FasL〕反應(yīng)、二抗反應(yīng)后進(jìn)行曝光、獲取圖片。

1.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行Dunnett檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Hoechst33342-PI染色 熒光顯微鏡下觀察可見，正常培養(yǎng)的K562細(xì)胞，細(xì)胞增殖較旺盛，鏡下細(xì)胞呈弱的藍(lán)色銀光，可見部分細(xì)胞重疊生長；隨著DP濃度的增加，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞藍(lán)色亮染數(shù)目增多；同時被PI染色的細(xì)胞數(shù)量也增多，紅色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；細(xì)胞可見核碎裂、核解體等現(xiàn)象，見圖1。

2.2DNA瓊脂糖凝膠電泳 control組電泳圖顯示為一條區(qū)帶，DP作用的各組細(xì)胞電泳均呈現(xiàn)“梯形”條帶，且隨DP濃度的增大“梯形”條帶變得更加明顯，見圖2。

圖1 DP作用的K562細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察Hoechst33342-PI染色后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×100)

圖2 DP作用的K562細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳

2.3分光光度法檢測caspase3酶活性結(jié)果 隨著DP濃度逐漸增大pNA濃度逐漸增加，即caspase3酶相對活性逐漸增加，與control組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見表1。

2.4qRT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá) 與control組比較，DP作用12 h的K562細(xì)胞，根據(jù)所得Ct值計算：隨著DP的劑量增加caspase3、Fas、FasL mRNA表達(dá)水平均逐漸增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見表1。

2.5Western印跡檢測 各組procaspase3蛋白表達(dá)量，隨DP劑量的增大逐漸降低，F(xiàn)as和FasL蛋白表達(dá)量隨DP劑量的增大逐漸增加，與control組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2、圖4。

表1 DP作用的K562細(xì)胞caspase3酶相對活性值與DP濃度的關(guān)系、caspase3、Fas、FasL mRNA表達(dá)比較

表2 DP作用的K562細(xì)胞procaspase3、Fas、FasL蛋白表達(dá)

圖4 Western印跡檢測procaspase3、Fas、FasL蛋白表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體正常細(xì)胞受到生理和病理性刺激后出現(xiàn)的一種自發(fā)的、基因控制的一系列酶參與的死亡過程〔6〕。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的主流方向，無論是傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物或是靶向治療藥均通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作用。因此，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是評價抗腫瘤藥物療效的主要指標(biāo)〔7〕。前期研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，DP對K562細(xì)胞的增殖有較好抑制作用，而對于細(xì)胞的增殖抑制作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。本研究初步證實(shí)了DP的作用可能使細(xì)胞發(fā)生了凋亡。在細(xì)胞凋亡過程中DNA的裂解是標(biāo)志細(xì)胞最終走向死亡的不可逆的過程；DNA瓊脂糖凝膠電泳法也曾被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡判定的金標(biāo)準(zhǔn)之一〔8〕。本研究證實(shí)了DP的作用誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者在研究中表示，caspase家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，caspase3是caspase家族的重要一員，是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵〔9〕，也是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者〔10〕。另外，對于細(xì)胞凋亡信號通路主要包括3條途徑，即線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑及死亡受體途徑，這3條途徑之間相互聯(lián)系，其中凋亡酶caspase8是死亡受體途徑的關(guān)鍵酶；凋亡酶caspase9既是線粒體途徑的關(guān)鍵酶；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的關(guān)鍵酶是caspase12；而凋亡酶caspase3是3條凋亡路徑的共同交匯點(diǎn)〔11〕。caspase3是目前caspase家族中研究最多、功能明確的、已知的與凋亡關(guān)系最密切的成員之一〔12〕。其中caspase8、caspase9參與細(xì)胞凋亡的起始，caspase3參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行〔13〕。正常情況下的procaspase3形式存在，一旦損傷因素導(dǎo)致凋亡發(fā)生，procaspase3即被激活誘發(fā)下游的級聯(lián)反應(yīng)〔14〕；從而進(jìn)入細(xì)胞核中執(zhí)行凋亡效應(yīng)，使得染色質(zhì)凝集、DNA片段化、凋亡小體的形成等〔15，16〕。本研究結(jié)果顯示，隨著DP濃度的增大細(xì)胞中caspase3 mRNA的表達(dá)量也逐漸增加。另外，對于細(xì)胞凋亡信號通路中死亡受體途徑，主要由 Fas、DR3、DR4、DR5、TNFR1等受體介導(dǎo)。目前認(rèn)為Fas/FasL是最重要的一類〔17〕。FasL與受體Fas結(jié)合后會激活caspase8，再通過介導(dǎo)的caspase級聯(lián)反應(yīng)激活caspase3來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18〕。

綜上，死亡受體途徑中Fas/FasL通路參與了DP誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的調(diào)控，但是否還有其他調(diào)控機(jī)制參與需進(jìn)一步研究。