雷帕霉素灌胃對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用及機(jī)制

哈利，王琴，楊燁

1 深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院急診內(nèi)科，廣東深圳 518110；

2 新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病科干部病房

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為微血管病變，是糖尿病患者致盲的潛在危險(xiǎn)因素之一。研究顯示，罹患2 型糖尿病8 年后，50%的患者會(huì)發(fā)生DR，20 年后則有超過77%的患者發(fā)生DR［1］。目前DR 的治療方法多為控制血糖、降低血脂、激光治療等，雖然對(duì)視力損害起到一定治療作用，但仍缺少根治DR 的特效藥物。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞自噬的重要信號(hào)通路，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡過程中具有非常重要的作用［2］。研究顯示，PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在糖尿病及其并發(fā)癥中起關(guān)鍵作用［3］。雷帕霉素是mTOR 特異性抑制劑，對(duì)癌癥、代謝性疾病均具有一定的藥理作用［4］。本研究通過建立2 型糖尿病大鼠模型，使用雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)治療，以PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路為靶點(diǎn)，觀察雷帕霉素對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SPF 級(jí)SD 大鼠50 只，體質(zhì)量180～220 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物使用許可證SCXK（新）2016-0002。飼養(yǎng)于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫21～23 ℃，濕度50%～60%，12 h/12 h 光暗周期循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利與倫理要求，并通過新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)20190531-08）。

1.1.2 主要試劑與儀器 雷帕霉素、鏈脲佐菌素（STZ）由北京索萊寶科技有限公司提供；二甲雙胍為中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品；兔抗PI3K/AKT/mTOR 一抗為Abcam 公司產(chǎn)品；山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、GAPDH 內(nèi)參蛋白為Bioswamp 公司產(chǎn)品。低速冷凍離心機(jī)（KDC-2046）、高速冷凍離心機(jī)（HC-3018R）、酶標(biāo)儀（Varioskan Flash）、血糖儀及配套試紙（拜安捷2）。

1.2 動(dòng)物分組與糖尿病模型制備 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10 只和模型組40 只。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)。糖尿病組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周后，腹腔一次性注射35 mg/kg STZ，注射后第3 天采集空腹尾靜脈血，以隨機(jī)血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L、食量及飲水量增加、尿量增多為造模成功。

1.3 藥物干預(yù)方法 取造模成功的30 只大鼠，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、雷帕霉素組各10 只。陽(yáng)性對(duì)照組給予二甲雙胍20 mg/（kg·d）灌胃，雷帕霉素組給予雷帕霉素1 mg/（kg·d）灌胃，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組給予同等體積純凈水灌胃，連續(xù)4周。

1.4 空腹血糖檢測(cè) 大鼠麻醉，采集空腹尾靜脈血，使用血糖儀檢測(cè)血糖水平。

1.5 視網(wǎng)膜病理檢查 采用HE 染色法。大鼠處死，取左側(cè)視網(wǎng)膜組織，4%多聚甲醛固定24 h，75%乙醇脫水，石蠟包埋，HE 染色，400 倍顯微鏡下觀察病理改變。每張切片隨機(jī)選取20個(gè)固定面積（不重疊視野），分別計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值，用來評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜病變程度。

1.6 視網(wǎng)膜組織中PI3K/AKT/mTOR 表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。取大鼠右側(cè)視網(wǎng)膜組織，加入裂解液制備組織勻漿，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白上清中總蛋白含量。加入1×PBS 和4×Loading Buffer 稀釋蛋白，100 ℃水浴20 min 使蛋白變性。使用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入兔抗鼠一抗（PI3K、AKT、mTOR、內(nèi)參GAPDH 稀釋比例分別為1∶3 000、1∶200、1∶1 000、1∶3 000），4 ℃搖床孵育。TBST 洗膜，加入山羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶3 000）孵育2 h。TBST 洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色，Image Lab曝光條帶，Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組用藥前后空腹血糖水平比較 各組用藥前空腹血糖水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。用藥后與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及雷帕霉素組空腹血糖均升高（P均＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和雷帕霉素組空腹血糖均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組用藥前后空腹血糖比較（mmol/L， ± s）

表1 各組用藥前后空腹血糖比較（mmol/L， ± s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組雷帕霉素組n 10 10 10 10空腹血糖用藥前5.06 ± 0.87 5.19 ± 0.98 5.24 ± 1.12 5.30 ± 1.05用藥后5.54 ± 1.25 21.08 ± 5.46*18.27 ± 4.60*#16.15 ± 5.05*#

2.2 各組視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)比較 正常對(duì)照組視網(wǎng)膜形態(tài)無明顯病理改變；模型對(duì)照組視網(wǎng)膜形態(tài)改變，細(xì)胞水腫嚴(yán)重，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核染色質(zhì)深染加重，可見大量空泡變性的細(xì)胞，外層和內(nèi)層結(jié)構(gòu)紊亂，界限模糊不清，視網(wǎng)膜全層明顯變?。魂?yáng)性對(duì)照組視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫，核質(zhì)染色深染，各層結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜全層變薄；雷帕霉素組視網(wǎng)膜細(xì)胞輕度水腫，厚度稍變薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)外層排列稍紊亂，細(xì)胞間隙增大，有少量核固縮，染色加深，大量節(jié)細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞數(shù)量稍微減少。

2.3 各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、雷帕霉素組視網(wǎng)膜神經(jīng) 節(jié) 細(xì) 胞 數(shù) 分 別 為（24.56 ± 1.66）、（17.40 ± 1.06）、（19.07 ± 1.03）、（20.13 ± 0.96）個(gè)。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及雷帕霉素組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低（P均＜0.05），與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及雷帕霉素組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)均升高（P均＜0.05），雷帕霉素組高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 各組視網(wǎng)膜PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及雷帕霉素組PI3K、AKT表達(dá)水平降低，mTOR表達(dá)水平升高；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組與雷帕霉素組PI3K、AKT 表達(dá)水平升高，mTOR 表達(dá)水平降低；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，雷帕霉素組AKT 表達(dá)水平升高、mTOR表達(dá)水平降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組視網(wǎng)膜PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)比較（± s）

表2 各組視網(wǎng)膜PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組雷帕霉素組n 10 10 10 10 PI3K 0.751 ± 0.105 0.454 ± 0.086*0.544 ± 0.082*#0.587 ± 0.099*#AKT 0.843 ± 0.134 0.223 ± 0.067*0.425 ± 0.060*#0.632 ± 0.082*#△mTOR 0.371 ± 0.058 0.724 ± 0.037*0.635 ± 0.059*#0.582 ± 0.064*#△

3 討論

DR是糖尿病主要的眼部并發(fā)癥，按照病變嚴(yán)重程度可分為早期非增殖性DR 和中晚期增殖性DR。目前全世界已有9 300萬DR患者，其中1 700萬為增殖性DR［5］。DR 的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，AGEs 聚集、蛋白激酶C信號(hào)通路阻礙、多元醇通路代謝異常等對(duì)DR 的發(fā)生發(fā)展均有促進(jìn)作用［6］。目前治療DR的方法主要針對(duì)晚期階段的增殖性DR，且效果有限。雷帕霉素是一種具有廣泛抑制增殖作用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可特異性抑制mTOR，用于癌癥、代謝性疾病的治療已取得一定效果。抑制mTOR 活性是雷帕霉素改善2型糖尿病胰島素抵抗并降低血糖的機(jī)制之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，雷帕霉素可降低糖尿病小鼠的血糖水平，提高小鼠對(duì)胰島素的敏感性［7］。mTOR/S6K1 可被胰島素信號(hào)激活，通過增加IRS-1絲氨酸殘基磷酸化，促使IRS-1 與胰島素受體解離，引起胰島素抵抗［8］。本研究結(jié)果顯示，給予雷帕霉素治療4周后，糖尿病大鼠血糖明顯降低，表明雷帕霉素能夠?qū)μ悄虿〈笫蟮难瞧鸬揭欢ǖ目刂谱饔谩?/p>

DR 是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，以視網(wǎng)膜屏障通透性增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞減少、血管基底膜增厚、毛細(xì)血管閉塞、視網(wǎng)膜神經(jīng)元和膠質(zhì)異常為主要病理改變。在高血糖狀態(tài)下，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞極易受到損傷，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用受損。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組視網(wǎng)膜病理改變嚴(yán)重，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量下降明顯，而與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及雷帕霉素組視網(wǎng)膜雖同樣出現(xiàn)病理改變，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量下降明顯，但較模型組更輕，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，雷帕霉素組視網(wǎng)膜病理改變則更輕。王菲菲［9］對(duì)高眼壓模型SD 大鼠使用雷帕霉素滴眼液后，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素降低了大鼠的眼壓，同時(shí)減弱了大鼠視網(wǎng)膜組織及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，結(jié)合本次研究結(jié)果可見，雷帕霉素大鼠的視網(wǎng)膜組織及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞確有一定的保護(hù)作用，同時(shí)能夠?qū)R 大鼠起到一定的治療作用。

PI3K/AKT 是重要的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路，具有控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與凋亡的作用。PI3K/AKT 廣泛存在于細(xì)胞中，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［10］。研究顯示，糖尿病時(shí)的低氧和低血糖可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子過度表達(dá)，通過fms 樣酪氨酸激酶受體和胎肝激酶受體這兩個(gè)酪氨酸激酶家族的特異性受體，激活PI3K 信號(hào)通路，引起過度的血管生成，從而導(dǎo)致DR 和糖尿病腎?。?］。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織中PI3K、AKT 表達(dá)水平均下降；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和雷帕霉素組PI3K、AKT 表達(dá)水平均升高，其中雷帕霉素組AKT 表達(dá)水平高于陽(yáng)性對(duì)照組，表明糖尿病與PI3K/AKT 信號(hào)通路受到抑制存在一定的關(guān)聯(lián)，而雷帕霉素可能通過上調(diào)AKT 表達(dá)水平改善糖尿病大鼠血糖水平及視網(wǎng)膜受損程度。

mTOR 是PI3K/AKT 信號(hào)通路下游重要的絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶，AKT可以直接磷酸化mTOR，激活mTOR 及下游信號(hào)通路，發(fā)揮生物學(xué)功能，其主要功能為促進(jìn)物質(zhì)代謝、參與細(xì)胞凋亡、自噬的功能等，在2 型糖尿病、肥胖、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。研究顯示，mTOR在胰島素代謝過程中具有重要作用，mTOR 可以反饋性調(diào)節(jié)胰島素敏感性，保護(hù)胰島β 細(xì)胞［13］。呂相川等［14］報(bào)道，mTOR在2型糖尿病大鼠肝臟和肌肉的表達(dá)水平較正常大鼠明顯升高，認(rèn)為其可能參與了2 型糖尿病的發(fā)病。INOKI 等［15］發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞中mTORC1 的激活是誘導(dǎo)糖尿病腎病的關(guān)鍵。INOKI 的另一項(xiàng)研究則提出，TSC/mTOR 信號(hào)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和生存控制中起關(guān)鍵作用，TSC/mTOR通路失調(diào)可能導(dǎo)致代謝紊亂，如糖尿病及其并發(fā)癥［16］。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織中mTOR 表達(dá)水平明顯升高；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及雷帕霉素組mTOR 表達(dá)水平明顯下降；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，雷帕霉素組mTOR 表達(dá)水平明顯降低。雷帕霉素能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物mTOR，并通過抑制mTOR 的活化而進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的調(diào)節(jié)。陳玨等［17］觀察雷帕霉素對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可減輕糖尿病腎病大鼠的蛋白尿癥狀。肖堂利等［18］研究雷帕霉素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎小球足細(xì)胞自噬和損傷的影響，以及對(duì)糖尿病腎病的改善作用，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以減輕腎小球病理改變和足細(xì)胞損傷。結(jié)合本研究結(jié)果，雷帕霉素抑制mTOR 表達(dá)后，PI3K 和AKT表達(dá)也出現(xiàn)了一定的變化，推測(cè)抑制mTOR 可能成為DR 的潛在治療方式。通過觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)和視網(wǎng)膜病理變化，雷帕霉素組視網(wǎng)膜損傷較其他兩組明顯減輕，更加證實(shí)了這一推測(cè)，提示雷帕霉素能夠?qū)?型糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜組織起到一定的保護(hù)作用。

綜上所述，糖尿病大鼠給予雷帕霉素后，空腹血糖得到了一定的控制，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及病理改變程度均得到不同程度的改善，其機(jī)制可能與雷帕霉素對(duì)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的抑制有關(guān)。mTOR可能成為未來DR治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。