抗菌肽Epinecidin-1 的研究進展

王吉榮，韓 涵，鄧 莉 （.海軍軍醫(yī)大學藥學系藥劑學教研室, 上海 00433；.解放軍總醫(yī)院京中醫(yī)療區(qū), 北京0080）

抗菌肽是一種存在于各種生物體內(nèi)的防御性多肽，是生物進化過程中留存的重要先天免疫組成部分[1]。魚類是抗菌肽的重要來源之一，已被發(fā)現(xiàn)的魚類抗菌肽已達上百種。Epinecidin-1 抗菌肽于2006 年首次從石斑魚白細胞的cDNA 文庫被鑒定發(fā)現(xiàn)，其基因由3 個內(nèi)含子和4 個外顯子組成，編碼一種由25 個氨基酸（序列為FIFHIIKGLFHAGKMIHGLVTRRRH）組成的成熟抗菌肽。這種抗菌肽的分子量為2 985.63，等電點為 12.31。Epinecidin-1 抗菌肽屬于piscidins 家族，具有兩親性的α-螺旋結構，兩側含有疏水和親水殘基，能破壞病原體細胞膜的完整性從而達到殺傷作用[2]。通常，Epinecidin-1 抗菌肽mRNA 在石斑魚的各種器官組織中均能表達，尤其是在頭腎、腮、皮膚等部位。在細菌脂多糖的刺激下，石斑魚頭腎內(nèi)Epinecidin-1 抗菌肽 mRNA 的轉錄表達量顯著增加，翻譯出更多的Epinecidin-1 抗菌肽用來抵御外來病原微生物的侵入[3]。

由于從生物樣品中獲得研究所需的大量抗菌肽相當困難，因此抗菌肽的化學合成已成為首選方法[4]。Epinecidin-1 抗菌肽可以采用Fmoc 固相多肽合成法制備獲得，并通過反相高效液相色譜法與質(zhì)譜法分別對其進行純化與分析。與完整的Epinecidin-1 抗菌肽相比，合成的21 聚體Epinecidin-1 抗菌肽也能保護魚類免受感染，但總體活性較低。盡管如此，由于合成短肽更具成本效益，大多數(shù)研究還是選擇21 聚體Epinecidin-1 抗菌肽，并在C 端酰胺化，用以改善其抗菌活性[5]。合成的Epinecidin-1 抗菌肽具有多種藥理活性，包括抗病原微生物、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、傷口愈合等，已被用于局部傷口的愈合治療以及提高水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的免疫力方面[6]。本文旨在介紹Epinecidin-1 抗菌肽的作用機制、藥理活性、局限性以及應用前景方面的研究進展，為進一步研究與應用提供借鑒。

1 作用機制

雖然大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Epinecidin-1 抗菌肽具有抗微生物、免疫調(diào)節(jié)、促傷口愈合活性等生物活性，但其作用機制還未完全明確。目前研究認為，Epinecidin-1 抗菌肽的作用方式可分為直接殺傷作用與免疫調(diào)節(jié)作用。

1.1 直接殺傷作用

抗菌肽的抗菌作用可部分歸因于抗菌肽所帶的正電荷與細菌表面的負電荷結構成分產(chǎn)生的靜電吸引作用，而這種靜電作用可以使抗菌肽非特異性吸附到細菌表面進行直接殺傷。根據(jù)酰胺化Epinecidin-1 抗菌肽的結構，研究者已經(jīng)提出幾種不同的直接殺傷機制模型。一種作用機制是“地毯”模型。在該模型中，Epinecidin-1 抗菌肽附著到目標細胞膜的磷脂頭部基團而不插入疏水區(qū)域，通過中斷膜曲率誘導膜崩解。另一種機制是“桶形”模型，即Epinecidin-1 抗菌肽的兩親性α-螺旋直接插入細胞膜的親脂性區(qū)域并產(chǎn)生跨膜孔，直接破壞細胞膜的完整性致其死亡[2]。Narayana 等[7]通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)Epinecidin-1 處理的幽門螺桿菌以“鬼影”細胞（細胞核溶解消失，殘留細胞輪廓）的形式出現(xiàn)，并提出Epinecidin-1 選擇性誘導細菌膜的負高斯曲率，引起膜的破壞以及跨膜孔的形成，進而使細胞的內(nèi)容物泄漏并致其死亡。此外，研究者還提出了“環(huán)形”模型、“聚集”通道模型假說來解釋抗菌肽的直接殺傷作用[8]。

1.2 免疫調(diào)節(jié)

除直接對膜的破壞殺傷作用外，Epinecidin-1 抗菌肽能與宿主免疫細胞上的外膜蛋白或胞內(nèi)蛋白相互作用，刺激多種信號轉導途徑，調(diào)節(jié)免疫相關基因并增加促炎細胞因子的產(chǎn)生與釋放，從而增強宿主對細菌、病毒等病原體的免疫反應[9]。Su 等[10]研究證明了Epinecidin-1 抗菌肽可以通過抑制Toll 樣受體的內(nèi)化以及增強下游信號（活性氧、Akt、p38 和核因子κB）的傳導來減輕G+菌磷壁酸所誘導的宿主炎癥。Huang 等[11]利用轉錄組測序技術與實時熒光定量PCR 技術研究了Epinecidin-1抗菌肽在石斑魚脾臟淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。結果顯示，該抗菌肽能顯著上調(diào)白介素-1β、腫瘤壞死因子α、T 細胞抗原受體以及主要組織相容性復合體，并通過上調(diào)細胞周期相關基因的表達來促進脾臟淋巴細胞的增殖。此外，Epinecidin-1 還能通過上調(diào)斑馬魚中細胞骨架角蛋白和原肌球蛋白等基因的表達來穩(wěn)定宿主細胞骨架，從而增強宿主對病原體的抗性[12]。

2 藥理活性

在體內(nèi)外研究中，Epinecidin-1 抗菌肽表現(xiàn)出對多種海洋G-菌、G+菌以及真菌的廣譜抗菌活性，包括多種弧菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌科、腦膜炎黃桿菌等[2]。Epinecidin-1 抗菌肽對部分耐藥菌也具有很強的抗菌活性。Huang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，2.5 mg/kg靜脈給藥Epinecidin-1 抗菌肽可使耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的豬完全存活，而萬古霉素治療組存活率僅為80%。該抗菌肽可顯著減少感染MRSA 豬體內(nèi)的細菌數(shù)，并有效控制MRSA誘導的炎癥。Pan 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Epinecidin-1 抗菌肽對抗生素耐藥的銅綠假單胞菌具有良好的抗菌活性，其對耐藥銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（3.12 μg/ml）比亞胺培南（200 μg/ml）更低。Narayana等[7]研究了Epinecidin-1 抗菌肽對不同幽門螺桿菌的作用。該抗菌肽的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為8～12 μg/ml 與12.5～25 μg/ml，其對幽門螺桿菌的殺菌作用呈現(xiàn)劑量與時間依賴性。幽門螺桿菌在含2 倍或1 倍最小抑菌濃度的抗菌肽培養(yǎng)基內(nèi)分別培養(yǎng)1 h 與12 h 后，細菌計數(shù)均能降低99%。Chen 等[15]通過電子顯微鏡觀察到Epinecidin-1 抗菌肽能使白色念珠菌的細胞膜破裂、收縮，其最小抑菌濃度為25 μg/ml。

此外，Epinecidin-1 抗菌肽可抑制多種類型的病毒，包括口蹄疫病毒，神經(jīng)壞死病毒和日本腦炎病毒等。低濃度Epinecidin-1 抗菌肽(6.2 μg/ml)可阻斷口蹄疫病毒進入倉鼠腎細胞，而高濃度Epinecidin-1 抗菌肽（125 μg/ml）對口蹄疫病毒有較強的殺傷作用[16]。Epinecidin-1 抗菌肽與日本腦炎病毒共注射可以顯著激活輔助型T 細胞2 來誘導腦炎病毒抗體的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫應答基因的表達，最終增強宿主對病毒的抗性[17]。

除廣譜抗菌與抗病毒外，還有研究發(fā)現(xiàn)Epinecidin-1 抗菌肽能殺傷多種寄生蟲，抑制腫瘤細胞增殖，促進皮膚和神經(jīng)損傷的修復。Epinecidin-1抗菌肽能顯著抑制陰道毛滴蟲的生長，其最小抑菌濃度為62.5 μg/ml[18]。Epinecidin-1 抗菌肽也能通過增加細胞內(nèi)鈣水平，從而誘導活性氧的產(chǎn)生并激活鈣蛋白酶，繼而引起線粒體的損傷和腫瘤細胞的死亡[19]。Lumpkins 等[20]研究發(fā)現(xiàn)Epinecidin-1 抗菌肽能誘導神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白的產(chǎn)生，而該蛋白與星形膠質(zhì)細胞活化修復神經(jīng)損傷相關。

3 潛在局限與挑戰(zhàn)

盡管Epinecidin-1 抗菌肽已經(jīng)在諸多研究中表現(xiàn)出多樣的藥理活性，但其潛在局限性也不容忽視。這些局限性包括生物利用度低下、潛在毒性、特定生理環(huán)境下不穩(wěn)定以及潛在的耐藥性等。

靜脈給藥是Epinecidin-1 抗菌肽理想的給藥途徑，但由于肽鏈結構存在穩(wěn)定的兩親性α-螺旋結構，其劑量依賴性溶血效應在靜脈使用期間應特別關注。肌內(nèi)注射75 mg/kg 和100 mg/kg Epinecidin-1抗菌肽會使1/3 的實驗小鼠出現(xiàn)瞳孔縮小但沒有全身中毒癥狀，且5 h 后基本恢復正常，但這種潛在毒性也可能限制其在臨床的應用[14]。Epinecidin-1抗菌肽雖然在實驗動物模型上的應用被證明是相對安全的，但仍需要進一步研究以確定其在人體應用的最佳用藥方式和劑量。

此外，Epinecidin-1 抗菌肽作為一種多肽，口服給藥容易被胃腸道酶快速降解且很難穿透腸黏膜，因此口服給藥方式受到限制。進入血液的抗菌肽也會被血漿中蛋白水解酶失活，并通過肝臟和腎臟快速清除，導致其短暫的作用時間；到達靶器官的Epinecidin-1 抗菌肽活性會因體內(nèi)pH 值、溫度、離子等因素而受到影響，從而導致其作用效果不穩(wěn)定[21]。當然，Epinecidin-1 抗菌肽在殺傷病原微生物的過程中必然會出現(xiàn)耐藥菌，因此，如何保持該抗菌肽的殺傷作用還有待進一步研究。

4 應用前景

雖然Epinecidin-1 抗菌肽存在一些局限性，但是研究人員可以通過多肽定向修飾改造、納米載體遞送等方法克服其使用限制，從而提高抗菌肽的穩(wěn)定性、安全性以及生物利用度。鑒于Epinecidin-1抗菌肽的多種藥理活性，其在抗感染、局部傷口愈合、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面存在巨大的潛在應用價值。如前文所述，Epinecidin-1 抗菌肽能廣譜殺傷抑制多種細菌（包括多重耐藥菌MRSA、創(chuàng)傷弧菌、幽門螺旋桿菌等），真菌（白念珠菌），病毒（日本腦炎病毒、神經(jīng)壞死病毒、口蹄疫病毒等），寄生蟲（陰道毛滴蟲）等病原體，這就意味著Epinecidin-1 抗菌肽在抗病原微生物方面存在應用潛力，尤其適用于海洋病原微生物（包括創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌等）感染的治療[22]。由于Epinecidin-1 抗菌肽能抑制殺傷痤瘡丙酸桿菌并誘導皮膚角質(zhì)形成細胞增殖來促進傷口的愈合過程，故其與膠原蛋白聯(lián)合使用策略可能對化妝品行業(yè)有潛在的商業(yè)價值[23]。Epinecidin-1抗菌肽能顯著增強宿主對日本腦炎病毒滅活疫苗的免疫應答，因此具有成為新型蛋白類免疫佐劑的開發(fā)價值[17]。鑒于Epinecidin-1 抗菌肽能通過線粒體超極化并產(chǎn)生活性氧誘導腫瘤細胞DNA 損傷和壞死，因此，將其與靶向遞送載體相結合有可能成為潛在的新型抗腫瘤藥物[24]。此外，將Epinecidin-1抗菌肽基因轉導至魚類或者將其摻入魚飼料中，在一定程度上能改善魚類的免疫力，這在水產(chǎn)養(yǎng)殖領域存在相當大的應用價值[25]。

5 結論

Epinecidin-1 抗菌肽作為石斑魚抵抗海洋病原體的第一道天然防御屏障，具有抗病原微生物、免疫調(diào)節(jié)、傷口愈合等多種藥理活性。本文綜述了該抗菌肽的作用機制與藥理活性，并探討了該抗菌肽的潛在局限性與應用前景。由于Epinecidin-1 抗菌肽來源于海洋魚類，且對多種海洋病原微生物具有顯著的殺傷抑制作用，故在治療海水浸泡傷感染方面具有潛在的轉化應用潛力。未來，針對Epinecidin-1抗菌肽還需在藥動學、藥效學、潛在毒性、最佳治療劑量等各方面開展更充分的研究。