光滑念珠菌耐藥機制的研究進展

徐怡瀾，閻 瀾 （海軍軍醫(yī)大學：.基礎醫(yī)學院；b.藥學系軍特藥研究中心；c.軍事藥學國家級實驗教學示范中心，上海 200433）

侵襲性念珠菌?。╥nvasive candidiasis）是院內血液感染的第四大原因[1]。由于各類疾病導致的免疫力低下病人增多，光滑念珠菌（Candida glabrata）的感染率逐年遞增，引起敗血癥的數量也隨之增加。除白念珠菌外，光滑念珠菌已成為部分國家和地區(qū)侵襲性感染中第二常見的念珠菌種類[2]。光滑念珠菌是一種條件致病菌，它廣泛存在于自然界，也在人體皮膚黏膜、消化道寄生。當人體免疫功能降低或皮膚黏膜環(huán)境發(fā)生改變時，光滑念珠菌即可大量繁殖，引起深部臟器感染。與其他念珠菌相比，光滑念珠菌對于抗真菌藥物顯著耐受[3]，它可以在抗真菌治療過程中迅速產生耐藥性，最終導致治療失敗[4-5]。我國侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網（CHIFNET）2020 年統(tǒng)計結果顯示，臨床常用抗真菌藥物氟康唑和伏立康唑對光滑念珠菌的最低抑菌濃度（MIC90）分別32 μg/ml 和1 μg/ml。目前治療光滑念珠菌的藥物主要包括廣譜三唑類、棘白菌素類以及多烯類抗真菌藥。本文對光滑念珠菌的耐藥機制進行綜述。

1 對唑類藥物的耐藥機制

1.1 麥角甾醇合成通路中基因改變

針對念珠菌屬使用最廣泛的藥物當屬唑類抗真菌藥物。唑類藥物通過作用14ɑ-去甲基化酶系統(tǒng)中的細胞色素P450，使環(huán)上氮原子與P450 的血紅素鐵結合，阻礙麥角甾醇生物合成，同時致使其合成前體24-甲烯二氫羊毛甾醇累積，從而使念珠菌細胞膜損傷。麥角甾醇是保證念珠菌細胞膜穩(wěn)定和流動性的重要成分，而ERG11編碼的羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶作為關鍵酶，催化羊毛甾醇生成麥角甾醇。唑類藥物通過結合14ɑ-去甲基化酶，阻礙催化過程，而麥角甾醇不足最終導致細胞膜結構改變，念珠菌增殖減少。

1.1.1ERG11基因突變

ERG11基因突變導致唑類藥物作用靶酶羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶的結構發(fā)生變化，其與唑類藥物的結合位點消失，無法結合，從而產生耐藥性。Hull 等[6]在臨床耐藥分離株中發(fā)現ERG11基因G315D 突變位點，這導致菌株對唑類藥物敏感性降低。Zhang 等[7]在念珠菌血流分離株中發(fā)現6 株光滑念珠菌耐藥株，并在其中2 株中檢測到ERG11基因I166S 突變位點，其他4 株耐藥株并未出現ERG11基因的突變，但仍能產生耐藥。由此推測，ERG11基因突變或許不能作為光滑念珠菌耐藥的主要原因。

1.1.2ERG11基因高表達

ERG11基因高表達導致唑類藥物的靶酶生成增加，藥物無法完全抑制靶酶活性。Upc2A 和Rpn4 是光滑念珠菌ERG11表達的關鍵調節(jié)因子，RPN4 與UPC2A 的基因突變是ERG11高表達的主要原因[8-9]。Wang 等[10]研究2 株耐藥分離株，其中1 株的CDR1和ERG11高表達，而另1 株只有CDR1高表達，盡管驗證ERG11高表達確實會導致光滑念珠菌產生耐藥，但由于耐藥株均存在CDR1高表達，因而ERG11高表達不能作為光滑念珠菌耐藥的唯一原因。

1.1.3AUS1基因高表達

當麥角甾醇生物合成在缺氧或由于甾醇合成缺陷而受到抑制時，甾醇流入轉運蛋白基因（AUS1和TIR3）和麥角甾醇生物合成通路中相關基因（ERG2、ERG3、ERG6等）在真菌細胞中表達明顯上調。在低氧條件或唑類作用下，細胞中的AUS1表達增加，通過輸入外源性膽固醇和麥角甾醇，可使光滑念珠菌得以存活[11]。

1.2 藥物外排增強

與其他念珠菌不同，光滑念珠菌細胞膜上與耐藥性相關的外排泵主要是ABC 轉運蛋白家族（由念珠菌耐藥性CDR1、CDR2、SNQ2基因編碼），這類外排泵通過水解ATP 獲得能量，并通過細胞膜主動外排藥物。

1.2.1 ABC 轉運蛋白家族表達增加

CDR1、CDR2及SNQ2基因高表達導致光滑念珠菌內藥物被快速排出，從而對唑類藥物產生耐藥性。Zhang 等[6]在念珠菌血流分離株中發(fā)現，光滑念珠菌耐藥分離株的CDR1、CDR2基因表達顯著增加。Wang 等[10]研究兩株耐藥分離株，發(fā)現CDR1基因均高表達。有研究發(fā)現[12]，CDR1、CDR2在16 種耐藥分離株中分別有12 及8 株高表達，且其中有4 株耐藥株CDR1、CDR2同時高表達；而有8 株耐藥株SNQ2表達僅相對升高，這可能說明SNQ2沒有單獨表達或并非主要外排泵，表明這些ABC 轉運蛋白之間可能存在相互作用。

1.2.2PDR1基因突變

PDR1是ABC 轉運蛋白家族的上游調節(jié)基因。研究發(fā)現，Pdr1 和Pdr3 是釀酒酵母中兩種密切相關的蛋白同系物，作用與光滑念珠菌中的Pdr1 相似。Yao[13]等在耐藥菌株中發(fā)現PDR1中的新錯義突變位點A848V。Khakhina[14]等發(fā)現光滑念珠菌PDR1的作用是釀酒酵母PDR1和PDR3自調節(jié)轉錄作用的結合，PDR1自調節(jié)在光滑念珠菌耐藥性產生中起重要作用。PDR1基因的功能獲得性突變（GOF），會導致CDR1表達上調。Hou[15]等對PDR1多態(tài)性進行研究，發(fā)現唑類耐藥分離株的PDR1多態(tài)性比率（14 個中的13 個，92.9%）明顯高于唑類敏感分離株（144 個中的28 個，19.4%）。

1.3 DNA 錯配修復系統(tǒng)缺陷

真菌耐藥性產生大多緣于基因突變。DNA 錯配修復（MMR）系統(tǒng)糾正DNA 聚合酶在DNA 復制過程中產生的錯誤，以及修復由環(huán)境因素或內源性因素引起的DNA 損傷。MSH2為該修復系統(tǒng)的關鍵基因之一。

Healey[16]等發(fā)現有55%攜帶MSH2功能喪失的突變（LOF），導致體外和體內抗真菌藥物耐藥性的加速出現，這些突變在氟康唑處理后更為常見。但也有研究表明MSH2序列與氟康唑耐藥性或基因型增加之間無明確關聯，在這些研究中MSH2被認為是光滑念珠菌的管家基因，即該基因的多態(tài)性可能與遺傳復合物的差異有關，而與抗真菌藥物耐藥性不直接相關[15,17]。盡管如此，不能否認MSH2功能喪失的突變引起錯誤的不匹配修復，進而參與真菌耐藥性的發(fā)展，其相關性仍有待進一步研究。

2 對棘白菌素類藥物的耐藥機制

β-葡聚糖是念珠菌細胞壁的基本成分，棘白菌素類藥物通過抑制β-1,3-葡聚糖的合成，對念珠菌屬發(fā)揮殺真菌活性。

多項研究表明，FKS基因突變導致其結合位點改變是棘白菌素耐藥性產生的主要原因。Wang[10]等研究2 株耐藥分離株，對FKS測序顯示，2 種分離株在FKS2中都含有S663P 突變且存在4 個單核苷酸多態(tài)性（SNP），而FKS1則無突變。同時，FKS1和FKS2的表達均上調。Al-Baqsami[18]等在5 種耐米卡芬凈的分離株中，發(fā)現4 株分離株FKS2含有非同義（S663P）突變，1 株分離株含有FKS2熱點-1（HS1）中的三核苷酸缺失（對應于F659；ΔF659）。Pham[19]等在1 037 株耐棘白菌素光滑念珠菌中進行FKS測序，檢測出47 株具有FKS突變。其中，檢測出12 種獨特的突變：FKS1中的5 種（15 株）和FKS2中的7 種（35 株）。所有突變都發(fā)生在HS1 中，沒有檢測到HS2 突變。通過以上研究結果，可推測影響光滑念珠菌對棘白菌素易感性的大多數突變位于FKS1HS1 和FKS2HS1 區(qū)域，且FKS2的突變多于FKS1。

3 對多烯類藥物的耐藥機制

多烯類藥物是廣泛運用于臨床的抗真菌感染的廣譜抗菌藥。兩性霉素B 是多烯類的代表藥物，通過結合念珠菌細胞膜上的麥角甾醇，形成孔道，以改變念珠菌細胞膜通透性從而使念珠菌死亡。

3.1 自身合成替代甾醇

真菌能夠自身合成甾醇中間體完成代謝，但麥角甾醇缺乏，導致兩性霉素B 無作用靶點。Hull 等[6]在多種臨床耐藥分離株中發(fā)現CG156 分離株內僅可檢測到14α-甲基化甾醇中間體這一種甾醇，即這種分離株內缺乏麥角甾醇，但該耐藥株仍可以在沒有外源性供應甾醇的情況下，用14α-甲基化甾醇中間體合成細胞所需的甾醇。

3.2 麥角甾醇生物合成基因突變

由ERG6中密碼子Tyr192、Trp286 或Leu341無義突變導致Erg6 蛋白的過早終止；由ERG2中含有的G122S 和G119S 無義突變導致Erg2 蛋白功能受損，最終均導致突變株細胞膜缺乏麥角甾醇，進而破壞細胞膜通透性和流動性[20-23]。

4 小結

綜上所述，光滑念珠菌作為臨床上較為重要的致病菌之一，由于抗真菌藥物種類有限，臨床應用重復率高，導致的耐藥問題日益嚴重。因此，一方面需要臨床合理用藥、聯合用藥，盡量避免耐藥性的產生；另一方面，需要研發(fā)新型抗真菌藥物。有研究表明[24-28]，阿魏酸與卡泊芬凈，薄荷醇、百里酚、替加環(huán)素、絨毛鉤藤不溶性成分與唑類藥物的協同作用，通過損傷念珠菌生物被膜等方式，可以有效降低唑類耐藥菌的MIC。也有研究開辟新的思路，尋找新的藥物靶點：合成的鉍納米顆粒可以潛在地用于改善氧化應激和各種微生物感染，對念珠菌病病例有強大抗真菌能力[29]；4 種雙鳥胍衍生物（BG1-BG4）對光滑念珠菌和白念珠菌的MIC 在2～15.6 μg/ml 之間，其中BG3 作用于DNA，擾亂復制轉錄過程，導致在細胞質膜外層的磷脂酰絲氨酸暴露，半胱氨酸蛋白酶活化，促進真菌細胞凋亡[30]。藥物研發(fā)和探索是漫長的過程，需要一代代人的驗證和實踐，但可以預見，在不久的將來，這些藥物最終會有一部分應用于臨床實踐中，為緩解臨床耐藥問題提供新的選擇。