甘草酸對(duì)慢性腎臟病大鼠心肌HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α信號(hào)通路的影響

張雪，王家瑞，陳康寅

慢性腎臟?。–KD）是全球性的公共衛(wèi)生問題，該類患者具有較高的冠心病、心力衰竭、心臟驟停等心血管疾病患病率［1］，其心臟改變主要體現(xiàn)在左心室結(jié)構(gòu)、功能異常，左心室肥厚、心肌纖維化，左心室收縮和（或）舒張功能障礙，其中，心肌纖維化不可逆轉(zhuǎn)。由于腎臟清除率降低，毒素在體內(nèi)蓄積，CKD患者內(nèi)環(huán)境處于促炎狀態(tài)，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，誘發(fā)炎癥-免疫反應(yīng)［2-3］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）存在于大多數(shù)細(xì)胞中且含量豐富，參與轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和核小體組裝等環(huán)節(jié)［4］。Toll樣受體4（TLR4）是HMGB1的主要受體，TLR4被激活后，誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）發(fā)生核轉(zhuǎn)位［4-5］。NF-κB入核后可調(diào)控下游基因的表達(dá)，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等病理生理過程中起決定性作用，而缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）主要受NF-κB的調(diào)節(jié)［6］。甘草酸（Gly）是目前應(yīng)用最廣泛的HMGB1抑制劑，可直接與HMGB1結(jié)合，抑制其化學(xué)趨化作用和有絲分裂活性［7］，但Gly與心肌纖維化相關(guān)研究較少。本研究旨在探索Gly可否通過調(diào)節(jié)CKD大鼠心肌HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α表達(dá)進(jìn)而影響心肌纖維化程度，為CKD相關(guān)心臟疾病提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 6周齡雄性Wistar大鼠38只，體質(zhì)量200~250 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：假手術(shù)（Sham）組8只，假手術(shù)給藥組（Sham+Gly）組8只，CKD組10只，CKD給藥（CKD+Gly）組12只。所有動(dòng)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食禁水。

1.2 試劑與儀器 Gly購(gòu)自MCE有限公司，使用前按10 g/L溶解于DMSO中，待完全溶解后用37℃生理鹽水稀釋10倍。肌酐檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，蛋白Marker購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司，β-actin、HIF、NF-κB、HMGB1、TLR4單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Masson染液試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司，伊紅、蘇木素染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中性樹膠購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲苯購(gòu)自天津優(yōu)瑞爾公司。小動(dòng)物心臟彩色超聲儀購(gòu)自美國(guó)Visual Sonics公司，TP1020全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)、病理石蠟切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)Leica公司，生物組織包埋機(jī)（BMJ-1）購(gòu)自上海珂淮有限公司，Tanon 5200多化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 模型制備及給藥 所有大鼠按照50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉并固定，于大鼠束脊肌向下一橫指位置做2~2.5 cm橫向口。逐層分離脂肪層、筋膜、腹內(nèi)外斜肌筋膜，進(jìn)入后腹膜腔，暴露左側(cè)腎臟。剝離腎包膜及腎上腺，動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈，結(jié)扎動(dòng)脈后，行左腎全切。同樣方法暴露右側(cè)腎臟，行2/3右腎切除，明膠海綿壓迫止血，止血后還納殘余腎臟，逐層縫合肌層、皮下及皮膚。術(shù)后第2天，Sham+Gly組、CKD+Gly組采用Gly（80 mg/kg）腹腔注射給藥；Sham組、CKD組腹腔注射等量DMSO的生理鹽水稀釋液，4組給藥時(shí)間均為4周。

1.4 血壓及心臟彩超測(cè)定 給藥4周后，測(cè)定大鼠收縮壓、平均動(dòng)脈壓、舒張壓及脈率，有效重復(fù)測(cè)量至少5次后取平均值。給予大鼠異氟烷麻醉后，采用M型超聲測(cè)量心臟舒張期室間隔厚度、收縮期室間隔厚度、舒張期左心室內(nèi)徑、收縮期左心室內(nèi)徑、舒張期左心室后壁厚度、收縮期左心室后壁厚度、左心室射血分、E/A峰、肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間。記錄3個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值。

1.5 組織病理學(xué)檢測(cè) 血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲檢測(cè)后，稱取大鼠質(zhì)量并進(jìn)行麻醉，麻醉方法同前。左心室取血約5 mL用于血清鎂、肌酐、尿酸、尿素氮的檢測(cè)，后迅速取大鼠心臟，稱取心臟總質(zhì)量后留取心室。將心室分為兩部分，心尖部用于Western blot分析，其余組織置于4%多聚甲醛中，經(jīng)乙醇梯度脫水后石蠟包埋，4μm厚切片，HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，馬松（Masson）染色觀察及測(cè)定心室肌組織纖維化程度。每只動(dòng)物取Masson染色切片在200倍視野下隨機(jī)讀取5個(gè)視野。使用Image J軟件計(jì)算膠原纖維和心室組織整體面積，計(jì)算左心室膠原容積分?jǐn)?shù)（LVCVF）。

1.6 Western blot檢測(cè)心肌組織HMGB1、TLR4、NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá) 向心肌組織加入組織裂解液提取總蛋白，BCA法定量蛋白質(zhì)濃度，選用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），待不同蛋白條帶徹底分離后，轉(zhuǎn)膜，按照不同蛋白的分子量對(duì)條帶進(jìn)行分割后，分別置于按照1∶10 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000稀釋的兔抗大鼠HMGB1、TLR4、NF-κB、HIF-1α、β-actin的一抗溶液中孵育，4℃雜交過夜，TBST漂洗后加入兔抗大鼠蛋白二抗（1∶10 000），雜交1 h曝光，顯影。使用Image J軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行量化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠生化指標(biāo)、心臟質(zhì)量及體質(zhì)量結(jié)果 相較于Sham組，Sham+Gly組血清鎂水平升高（P＜0.05），其余生化指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CKD組肌酐、尿酸、尿素氮和血清鎂水平均升高（P＜0.05）；相較于Sham+Gly組，CKD+Gly組肌酐、尿酸、尿素氮、血清鎂水平和心臟體質(zhì)量比均升高（P＜0.05）；CKD組與CKD+Gly組各生化指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4組大鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of biochemical indicators and baseline characteristics between the four groups表1 4組大鼠的生化指標(biāo)及基本特征比較（n=4）

Tab.1 Comparison of biochemical indicators and baseline characteristics between the four groups表1 4組大鼠的生化指標(biāo)及基本特征比較（n=4）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Sham+Gly組比較，c與CKD組比較，P＜0.05。

組別Sham組Sham+Gly組CKD組CKD+Gly組F肌酐（μmol/L）20.16±9.62 25.35±5.39 47.53±9.22ab 44.32±9.23ab 22.514＊＊尿酸（μmol/L）16.43±5.65 24.15±16.07 59.84±12.49ab 54.08±21.96ab 16.478＊＊尿素氮（mmol/L）6.15±0.53 6.45±0.59 12.87±1.92ab 13.21±3.13ab 33.016＊＊血清鎂（mmol/L）0.75±0.06 0.87±0.18a 1.11±0.10ab 1.12±0.13ab 19.717＊＊組別Sham組Sham+Gly組CKD組CKD+Gly組F心臟質(zhì)量（g）1.13±0.17 1.27±0.15 1.21±0.09 1.29±0.19 1.005體質(zhì)量（g）351.75±28.50 389.50±38.51 348.75±18.72 332.67±46.31 1.973心臟體質(zhì)量比（%）0.32±0.03 0.33±0.01 0.35±0.02 0.39±0.04ab 5.266＊

2.2 4組大鼠心率、血壓結(jié)果 4組大鼠心率和舒張壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Sham組相比，Sham+Gly組心率、血壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CKD組收縮壓和平均動(dòng)脈壓升高（P＜0.05）。CKD組與CKD+Gly組血壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 4組大鼠心臟超聲結(jié)果 與Sham組相比，Sham+Gly組左心室射血分?jǐn)?shù)降低（P＜0.05），CKD組舒張期室間隔厚度增厚、收縮期左心室內(nèi)徑增大，左心室射血分?jǐn)?shù)降低，E/A比值降低，肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）。與CKD組相比，CKD+Gly組收縮期室間隔厚度增加，左心室射血分?jǐn)?shù)升高，E/A比值升高（P＜0.05），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

Tab.2 Comparison of blood pressure and heart rate between the four groups表2 4組大鼠心率和血壓比較（n=4，

Tab.2 Comparison of blood pressure and heart rate between the four groups表2 4組大鼠心率和血壓比較（n=4，

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Sham+Gly組比較，P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

組別Sham組Sham+Gly組CKD組CKD+Gly組F心率（次/min）406.84±25.63 401.78±32.92 421.09±42.17 408.59±36.40 0.497收縮壓（mmHg）129.03±9.92 138.95±19.00 154.30±13.68ab 149.86±15.80a 5.137＊＊平均動(dòng)脈壓（mmHg）109.65±7.83 114.63±17.54 125.59±12.80a 124.47±14.49a 2.905＊舒張壓（mmHg）99.80±7.98 102.07±17.75 111.10±13.12 111.31±15.16 1.684

2.4 4組大鼠左心室HE染色結(jié)果 Sham組和Sham+Gly組心肌纖維排列整齊緊密，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核大小一致；CKD組心肌組織的病理學(xué)特征表現(xiàn)明顯異常：心肌纖維紊亂、斷裂、不規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)不均一，可見細(xì)胞核部分腫大，部分萎縮，形態(tài)不一，呈深染、畸形，胞漿疏松、腫脹；CKD+Gly組心肌纖維的排列紊亂程度以及形態(tài)異常均較CKD組有所改善，但較Sham+Gly組有所惡化，見圖1。

2.5 4組大鼠左心室Masson染色結(jié)果 Sham組、Sham+Gly組、CKD組和CKD+Gly組LVCVF（%）分別為2.25±0.90、2.27±0.27、11.65±2.03、6.41±0.73，4組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=130.443，P＜0.01）。與Sham組比較，Sham+Gly組LVCVF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CKD組LVCVF增大（P＜0.05），心室肌纖維化程度加重。與CKD組比較，CKD+Gly組LVCVF減?。≒＜0.05），心室肌纖維化程度減輕。見圖2。

Tab.3 Comparison of cardiac color Doppler ultrasound indicators between the four groups表3 4組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較 （n=4

Tab.3 Comparison of cardiac color Doppler ultrasound indicators between the four groups表3 4組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較 （n=4

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Sham+Gly組比較，c與CKD組比較，P＜0.05。

組別Sham組Sham+Gly組CKD組CKD+Gly組F舒張期室間隔厚度（mm）1.83±0.28 2.06±0.24 2.08±0.23a 2.21±0.17a 4.653＊＊收縮期室間隔厚度（mm）2.94±0.36 3.21±0.47 2.93±0.31 3.49±0.44ac 4.693＊＊舒張期左心室內(nèi)徑（mm）6.54±0.63 6.76±0.30 6.65±0.58 6.50±0.65 0.401收縮期左心室內(nèi)徑（mm）3.26±0.81 3.86±0.47 4.37±1.06a 3.85±0.67 2.931＊舒張期左心室后壁厚度（mm）2.01±0.28 2.10±0.25 2.32±0.48 2.37±0.43 1.839收縮期左心室后壁厚度（mm）3.52±0.57 3.54±0.47 3.54±0.51 3.61±0.34 0.075左心室射血分?jǐn)?shù)0.81±0.07 0.76±0.07a 0.62±0.11ab 0.70±0.08ac 8.093＊＊E/A 1.34±0.28 1.19±0.05 0.84±0.11ab 1.14±0.20c 11.010＊＊肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間（ms）25.32±2.00 25.38±4.67 34.43±5.98ab 31.66±5.62ab 7.635＊＊

Fig.1 Results of ventricular pathological staining in four group of rats(HE staining,×200)圖1 4組大鼠心室病理染色結(jié)果（HE染色，×200）

Fig.2 Results of ventricular pathological staining in four groups of rats(Masson staining,×200)圖2 4組大鼠心室病理染色結(jié)果（Masson染色，×200）

2.6 4組大鼠心肌HMGB1、TLR4、NF-κB和HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較 與Sham組相比，Sham+Gly組各蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CKD組HMGB1、NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）。與CKD組比較，CKD+Gly組HMGB1、NFκB、HIF-1α蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。各組間TLR4蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖3。

Tab.5 Comparison of HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α signaling pathway related protein expression levels in myocardial tissue between four groups of rats表5 4組大鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=4，）

Tab.5 Comparison of HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α signaling pathway related protein expression levels in myocardial tissue between four groups of rats表5 4組大鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=4，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Sham+Gly組比較，c與CKD組比較，P＜0.05。

組別Sham組Sham+Gly組CKD組CKD+Gly組F HMGB1 0.93±0.12 1.12±0.17 2.38±0.31ab 1.93±0.59abc 40.287＊＊TLR4 1.03±0.07 1.08±0.10 1.14±0.13 1.03±0.09 0.799 NF-κB 0.97±0.06 1.01±0.21 3.54±0.24ab 1.57±0.22abc 111.536＊＊HIF-1α 1.03±0.07 1.13±0.12 2.30±0.17ab 1.82±0.16abc 57.732＊＊

Fig.3 The expression of HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1αsignaling pathway related proteins detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測(cè)HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

慢性腎臟病是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，我國(guó)CKD患病率約為10.8%，而CVD則是CKD的首要死亡原因［8］。CKD合并CVD（CKD-CVD）十分常見，且患者大多預(yù)后不良，其包括動(dòng)脈硬化性心血管?。ˋCVD）和非動(dòng)脈硬化性心血管病（NACVD）［9］。中國(guó)慢性腎臟病隊(duì)列研究（C-STRIDE）發(fā)現(xiàn)，相較于正常人群中CVD的發(fā)生率（1.4%），在CKD患者中CVD發(fā)生率可達(dá)10%，遠(yuǎn)高于正常人群；并且隨著CKD的進(jìn)展，CVD發(fā)生率持續(xù)增加，嚴(yán)重影響患者預(yù)后和死亡［10］。CKD-CVD發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前被廣泛認(rèn)同可能存在的機(jī)制有CKD患者腎小球?yàn)V過率降低，致使體內(nèi)毒素蓄積，進(jìn)而誘發(fā)炎癥-氧化應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)一系列病理生理改變［3］。

本研究通過5/6腎切除構(gòu)建慢性腎臟病大鼠模型，隨著腎功能的異常，大鼠血壓升高，心臟收縮和舒張功能受損，左心室射血分?jǐn)?shù)顯著降低，心室肌細(xì)胞排列紊亂，纖維化程度增加，證實(shí)慢性腎臟病確會(huì)對(duì)心臟產(chǎn)生不利影響，但這僅是CKD-CVD發(fā)生的表觀現(xiàn)象，其分子機(jī)制尚不明確。

目前對(duì)CKD-CVD發(fā)生的分子機(jī)制主要集中在炎癥、氧化應(yīng)激、自身免疫反應(yīng)以及某些相關(guān)信號(hào)通路的激活開放方面。Jin等［11］研究發(fā)現(xiàn)，CKD患者血清HMGB1水平顯著高于健康對(duì)照組，并且與CKD分期有關(guān)。在心血管系統(tǒng)疾病中，HMGB1作為促炎因子發(fā)揮重要作用。一方面，維持適當(dāng)?shù)暮薍MGB1水平可防止DNA氧化應(yīng)激從而避免心肌細(xì)胞凋亡；另一方面，細(xì)胞外HMGB1的蓄積則可誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響［12-14］。作為HMGB1主要受體的TLR4廣泛存在于心血管系統(tǒng)，通過髓樣分化因子88依賴和髓樣分化因子88非依賴途徑發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位［15］，進(jìn)而活化HIF-1α，最終導(dǎo)致心肌纖維化、心功能受損。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CKD組大鼠心肌HMGB1、NFκB、HIF-1α蛋白表達(dá)水平升高，這也反映了當(dāng)CKD發(fā)生時(shí)，HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α信號(hào)通路部分激活。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HMGB1發(fā)揮炎癥因子作用，即對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響時(shí)，HMGB1需要與TLR4/MD-2復(fù)合物結(jié)合，此時(shí)結(jié)合位點(diǎn)位于MD-2蛋白，炎癥信號(hào)的下傳是通過改變MD-2的表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)的［7，16-17］。

Gly是目前實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的HMGB1抑制劑，能夠直接與HMGB1結(jié)合，抑制其化學(xué)趨化作用和有絲分裂活性。近年來研究表明，Gly通過抑制細(xì)胞外HMGB1細(xì)胞因子活性，保護(hù)脊髓、肝臟、大腦和心臟免受炎癥損傷［18-20］。Zhai等［21］研究發(fā)現(xiàn)，Gly通過直接抑制細(xì)胞外HMGB1細(xì)胞因子活性和阻斷磷酸化JNK/Bax途徑減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)Gly及其衍生物能夠通過抑制HMGB1活性延長(zhǎng)慢性和急性心力衰竭小鼠的存活時(shí)間［22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Gly后，相比CKD組，CKD+Gly組大鼠的E/A峰延后，左心室射血分?jǐn)?shù)升高，病理學(xué)顯示其心肌纖維的排列紊亂程度及形態(tài)的異常也均有改善，纖維化程度降低。以上結(jié)果均表明Gly可以在一定程度上改善CKD大鼠心臟功能。

本實(shí)驗(yàn)利用大鼠制備了CKD-CVD模型，模擬其內(nèi)環(huán)境，進(jìn)一步證明了CKD情況下，大鼠心肌組織HMGB1表達(dá)上調(diào)，NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá)增加，證實(shí)在CKD大鼠心肌組織中，HMGB1/TLR4/NFκB/HIF-1α信號(hào)通路被激活。使用Gly后，大鼠心功能有所改善，HMGB1、NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá)下調(diào)，提示甘草酸改善CKD大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能可能是通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α炎癥信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于沒有驗(yàn)證MD-2表達(dá)量的變化；此外，本研究?jī)H限于對(duì)該信號(hào)通路的探討，而CKD-CVD發(fā)病機(jī)制是多方面的，故有待深入探究。

綜上，本研究不僅發(fā)現(xiàn)CKD對(duì)心臟的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生不利影響，還進(jìn)一步揭示了在CKD-CVD中，當(dāng)炎癥缺氧通路HMGB1/TLR4/NF-κB/HIF-1α被激活，應(yīng)用Gly后可通過抑制HMGB1表達(dá)下調(diào)炎癥的下傳，對(duì)心臟功能起到一定程度的改善。