電針調(diào)控Nrf2/HO-1通路對(duì)缺血缺氧性腦損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

張赟，李珂，補(bǔ)王珍

缺血缺氧性腦損傷（hypoxia-ischemia brain damage，HIBD）是新生兒殘疾和死亡的主要原因之一，可造成癲癇、智力低下、腦癱、視覺(jué)運(yùn)動(dòng)或感知功能障礙等［1］。因此，迫切需要探索更好的治療措施以最大程度地減少新生兒腦部損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦缺血時(shí)會(huì)立即被激活，促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)生［2］。小膠質(zhì)細(xì)胞能夠極化為經(jīng)典（M1）和替代（M2）表型，M1型可釋放白細(xì)胞介素（IL）-1β等促炎因子并加劇腦損傷，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放IL-10等抗炎因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等生長(zhǎng)因子，保護(hù)神經(jīng)［3］。因此，有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化并在一定程度上促進(jìn)其由M1型向M2型轉(zhuǎn)換可能對(duì)治療新生兒HIBD具有重要作用［3］。針灸可改善腦損傷，而電針是電刺激與傳統(tǒng)針灸的結(jié)合，能夠有效抑制腦損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，起到神經(jīng)保護(hù)作用［4］。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是重要的抗氧化信號(hào)通路，激活該通路可有效改善HIBD大鼠腦損傷［5］。另外，激活Nrf2/HO-1通路還能抑制腦缺血再灌注小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而降低炎癥反應(yīng)［6］。目前，鮮見(jiàn)有關(guān)電針對(duì)HIBD中小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及Nrf2/HO-1通路的影響研究。本研究旨在通過(guò)探究電針調(diào)控Nrf2/HO-1通路對(duì)HIBD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，為HIBD治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級(jí)7日齡SD大鼠40只，體質(zhì)量10~12 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007，于通風(fēng)良好且室溫（24±3）℃的環(huán)境中飼養(yǎng)7 d（光照12 h/d）。針灸針（河南澤垣醫(yī)療器械銷(xiāo)售有限公司，貨號(hào)：HT0067）；BCA試劑盒（無(wú)錫云萃生物科技有限公司，貨號(hào)：YRX301804R）；Nrf2抑制劑全反式維甲酸（南京北魚(yú)生物科技有限公司，貨號(hào)：BYDR-C17608000）；兔抗離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、β-actin、HO-1、Nrf2抗體、HRP-IgG抗體（貨號(hào)：ab5076、ab15323、ab8227、ab13243、ab62352、ab6721）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗精氨酸酶（Arginase）抗體（貨號(hào)：93668）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；兔抗CD68抗體（上海恒斐生物公司，貨號(hào)：bs-0649R-2）；IL-10、IL-1β試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)：CSB-E04595r、CSB-E08055r）；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（翌圣生物，貨號(hào)：50101ES01）；丙二醛（MDA）試劑盒（武漢益普生物公司，貨號(hào)：YX-E20805）；凝膠成像儀（上海百賽生物技術(shù)股份有限公司）；酶標(biāo)儀（上海研卉生物科技有限公司）。

1.2 分組與HIBD模型構(gòu)建 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+全反式維甲酸組［7］，10只/組。除假手術(shù)組外其余組大鼠均進(jìn)行HIBD模型建立：乙醚麻醉大鼠后將其固定并暴露頸部，于頸部切開(kāi)0.5 cm長(zhǎng)切口，分離皮膚并暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，剝離迷走神經(jīng)，對(duì)頸總動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎后縫合，將大鼠放回母鼠籠中1 h后將其放入含8%氧氣+92%氮?dú)獾拿荛]缺氧箱中2 h即造模結(jié)束，繼續(xù)母鼠喂養(yǎng)［8］。造模結(jié)束后，Longa評(píng)分為2～3分即為造模成功［9］。假手術(shù)組大鼠僅暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，不進(jìn)行結(jié)扎及缺氧處理；造模結(jié)束次日取電針組、電針+全反式維甲酸組大鼠，用無(wú)菌針灸針在百會(huì)穴向前平刺2 mm，連接電極一端，于右耳根部連接電極另一端形成回路，接G6805電極儀（疏密波、電流1 mA、頻率1～20 Hz），右耳微顫則為針刺有效（30 min/次，1次/d）［10］；電針處理后，電針+全反式維甲酸組大鼠腹腔注射7 mg/kg全反式維甲酸，共3 d（1次/d），其余組大鼠注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 在造模結(jié)束及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均通過(guò)Longa評(píng)分進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估：未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征（0分）；對(duì)側(cè)前爪不能伸展（1分）；偏癱并于偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈（2分）；于行走時(shí)向偏癱一側(cè)跌倒（3分）；無(wú)法行走、意識(shí)昏迷（4分）［9］。1.4 大鼠行為學(xué)觀(guān)察

1.4.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估結(jié)束后，通過(guò)Smart系統(tǒng)記錄100 cm×100 cm的觀(guān)察箱中大鼠的站立次數(shù)及5 min運(yùn)動(dòng)的路程，評(píng)估其自主活動(dòng)能力；每換一只大鼠，均使用75%乙醇擦去殘留氣味以避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.4.2 水迷宮實(shí)驗(yàn) 將水池（直徑150 cm，水深25 cm）劃分為均等的4個(gè)象限，將黑色圓形平臺(tái)（高22 cm，直徑12 cm）放置在距第一象限池壁35 cm處，距水面約3 cm，大鼠從第三象限入水，引至平臺(tái)停留20 s，推入水中再次尋找平臺(tái)，訓(xùn)練5 d（4次/d），于第6天移去平臺(tái)，計(jì)算機(jī)攝像系統(tǒng)觀(guān)察大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡并記錄從入水至平臺(tái)的時(shí)間（記為逃避潛伏期）及穿越平臺(tái)次數(shù)，評(píng)估大鼠認(rèn)知功能。

1.5 TUNEL法檢測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 每組隨機(jī)抽取5只大鼠，處死并取其腦組織于多聚甲醛中固定，制作4μm常規(guī)石蠟切片，一部分使用蛋白酶K孵育（8 min）后加入平衡緩沖液處理（10 min），再添加rTdT緩沖液（50μL）避光孵育1 h，DAPI染核，封片，熒光倒置顯微鏡觀(guān)察、拍照，觀(guān)察缺血部位大腦皮質(zhì)凋亡（陽(yáng)性）細(xì)胞表達(dá)，Image J軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；另一部分用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織中Iba1表達(dá) 將1.5所得石蠟切片室溫復(fù)溫15 min后烘烤30 min，脫蠟水化后孵育山羊血清20 min，孵育Iba1一抗（1∶500）過(guò)夜，添加生物素標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗、DAB顯色、封片后Image Pro Plus 6.0觀(guān)察并計(jì)數(shù)Iba1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。

1.7 試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織中IL-10、IL-1β、ROS、MDA水平 取其余大鼠腦組織于冰上勻漿，12 500 r/min離心25 min取上清液，一部分按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定IL-10、IL-1β、ROS、MDA水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。另一部分行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.8 Western blot檢測(cè)CD68、iNOS和Arginase及Nrf2/HO-1通路中相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.7所得腦組織，BCA法檢測(cè)勻漿上清液中蛋白濃度，取蛋白樣品30μg進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜、5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗（兔抗CD68、iNOS、Arginase、β-actin、Nrf2、HO-1抗體，均1∶500）孵育過(guò)夜，TBST洗滌后山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h，ECL顯影、蛋白凝膠成像儀觀(guān)察，Image J分析條帶灰度值，計(jì)算CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+全反式維甲酸組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（單位：分）分別為0.00±0.00、2.16±0.22、0.69±0.12、1.64±0.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=10，F(xiàn)=297.020，P＜0.01）。

2.2 各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠運(yùn)動(dòng)路程、站立次數(shù)及穿越平臺(tái)次數(shù)減少，逃避潛伏期增加（P＜0.05）；模型組、電針+全反式維甲酸組及電針組運(yùn)動(dòng)路程、站立次數(shù)及穿越平臺(tái)次數(shù)依次增加，逃避潛伏期依次減少（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of the results of open field test and the water maze test between the four groups表1 各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，）

Tab.1 Comparison of the results of open field test and the water maze test between the four groups表1 各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與電針組比較，P＜0.05；表2~4同。

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)路程（cm）2 253.30±230.41 852.17±118.80a 1 695.16±161.30ab 1 233.46±127.14abc 133.590＊＊站立次數(shù)（次）70.16±6.03 42.57±3.22a 61.07±4.04ab 48.20±3.26abc 84.406＊＊組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)（次）8.93±1.02 2.04±0.50a 6.25±0.71ab 4.37±0.60abc 158.019＊＊逃避潛伏期（s）14.10±1.12 27.96±2.17a 18.40±1.22ab 22.70±1.46abc 146.818＊＊

2.3 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)比較 與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)依次增加（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖1。假手術(shù)組存在極少量小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體瘦長(zhǎng)，存在分支狀細(xì)長(zhǎng)突起，均處于未活化狀態(tài)；模型組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞突起增粗、胞體增大、數(shù)量增加、處于活化狀態(tài)；與模型組比較，電針組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，突起變細(xì)；與電針組比較，電針+全反式維甲酸組小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量增加，見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠腦組織中IL-10水平降低，ROS熒光強(qiáng)度、MDA水平增加（P＜0.05），模型組和電針+全反式維甲酸組IL-1β水平增加（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組IL-1β水平、ROS熒光強(qiáng)度、MDA水平依次增加，IL-10水平依次降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.2 Comparison of apoptosis rate of neurons and number of microglia in cerebral cortex between the four groups表2 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較（n=5）

Tab.2 Comparison of apoptosis rate of neurons and number of microglia in cerebral cortex between the four groups表2 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較（n=5）

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F細(xì)胞凋亡率（%）7.21±1.18 39.16±2.22a 18.69±1.10ab 23.64±2.25abc 278.843＊＊Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）4.12±1.02 89.87±9.08a 40.64±5.36ab 68.18±6.37abc 179.359＊＊

Fig.1 The effect of electroacupuncture on neuronal apoptosis in rat cerebral cortex(TUNEL,×400)圖1 電針對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL，×400）

Fig.2 Immunohistochemical staining results of microglia(×400)圖2 小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果（×400）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors,ROS and MDA levels in brain tissue of rats between the four groups表3 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 （n=5

Tab.3 Comparison of inflammatory factors,ROS and MDA levels in brain tissue of rats between the four groups表3 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 （n=5

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F IL-1β（mg/g）0.015±0.004 0.050±0.007a 0.023±0.005b 0.038±0.005abc 42.261＊＊IL-10（mg/g）0.053±0.004 0.018±0.003a 0.042±0.005ab 0.030±0.004abc 69.167＊＊ROS熒光強(qiáng)度125.59±18.36 284.74±25.87a 180.15±15.36ab 227.15±16.50abc 60.618＊＊MDA（mmol/mg）3.98±0.28 6.67±0.32a 5.01±0.29ab 5.80±0.30abc 73.946＊＊

2.5 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和電針+全反式維甲酸組大鼠腦組織中CD68、iNOS相對(duì)表達(dá)水平增加，Arginase、Nrf2及HO-1相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組CD68、iNOS相對(duì)表達(dá)水平依次增加，Arginase、Nrf2及HO-1相對(duì)表達(dá)水平依次降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表4。

Fig.3 Effects of electroacupuncture on expression levels of CD68,iNOS and Arginase in rat brain tissue圖3 電針對(duì)大鼠腦組織CD68、iNOS和Arginase表達(dá)的影響

Tab.4 Comparison of the expression levels of CD68,iNOS,Arginase,Nrf2 and HO-1 in brain tissue of rats between the four groups表4 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1表達(dá)比較 （n=5）

Tab.4 Comparison of the expression levels of CD68,iNOS,Arginase,Nrf2 and HO-1 in brain tissue of rats between the four groups表4 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1表達(dá)比較 （n=5）

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F CD68 0.80±0.06 1.40±0.21a 0.95±0.09b 1.29±0.21abc 15.896＊＊iNOS 0.58±0.05 1.31±0.22a 0.74±0.11b 1.20±0.20abc 24.134＊＊組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F Arginase 1.25±0.21 0.48±0.07a 1.03±0.23b 0.72±0.10abc 20.530＊＊Nrf2 1.38±0.21 0.67±0.09a 1.19±0.18b 0.80±0.10abc 23.185＊＊HO-1 1.49±0.22 0.53±0.08a 1.28±0.21b 0.92±0.11abc 32.054＊＊

3 討論

電針是傳統(tǒng)針灸和電刺激的集合，是一種穩(wěn)定且快速的治療方法，已用于缺血性中風(fēng)、抑郁等疾病的治療［11］。然而，目前關(guān)于電針對(duì)HIBD中小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響及其可能的機(jī)制還不甚明了。研究發(fā)現(xiàn)，電針能夠通過(guò)激活沉默信號(hào)調(diào)節(jié)器1（silence information regulator-1，SIRT1）/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1（forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)OXO1）信號(hào)通路，有效改善腦缺血再灌注損傷鼠血腦屏障、學(xué)習(xí)及記憶障礙，抑制腦梗死［12］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)路程、站立次數(shù)、穿越平臺(tái)次數(shù)降低，逃避潛伏期增加；而與模型組比較，電針組大鼠運(yùn)動(dòng)路程、站立次數(shù)及穿越平臺(tái)次數(shù)增加，逃避潛伏期縮短，表明電針可有效提高HIBD大鼠自主活動(dòng)及認(rèn)知能力，改善其認(rèn)知障礙。Iba1、CD68為小膠質(zhì)細(xì)胞及其活化的標(biāo)志物，在其活化時(shí)表達(dá)顯著增加［13］。本研究結(jié)果顯示，電針能夠有效抑制HIBD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，并在一定程度上促進(jìn)其由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，由此抑制炎癥反應(yīng)，改善腦損傷。

當(dāng)大腦受到損傷時(shí)，由于ROS的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，釋放大量氧自由基及炎癥介質(zhì)，加重氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，加重腦損傷［14］。因此，有效抑制氧化應(yīng)激可避免小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化，減輕腦組織損傷。本研究結(jié)果亦顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中ROS、MDA水平增加，表明腦組織中存在氧化應(yīng)激損傷；而與模型組比較，電針組上述指標(biāo)水平降低，提示電針可抑制HIBD大鼠腦組織氧化應(yīng)激。Nrf2作為核因子，在正常狀態(tài)下，與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）相結(jié)合，當(dāng)受到壓力時(shí)，會(huì)從Keap1中釋放，轉(zhuǎn)移到核內(nèi)激活HO-1表達(dá)［15］。Nrf2/HO-1作為一個(gè)抗氧化通路，在腦損傷中的保護(hù)作用已被證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，喜樹(shù)堿通過(guò)激活A(yù)KT/Nrf2/HO-1通路，抑制帕金森病模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，改善神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［16-17］。電針預(yù)處理可通過(guò)激活Keap1/Nrf2通路來(lái)改善創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠的焦慮行為并預(yù)防海馬神經(jīng)損傷［18］。本研究結(jié)果亦顯示，與模型組比較，電針組Nrf2及HO-1相對(duì)表達(dá)水平增加，提示電針可能通過(guò)激活HIBD大鼠腦組織中Nrf2/HO-1信號(hào)通路來(lái)抑制氧化應(yīng)激，降低炎癥反應(yīng)，從而改善腦損傷。在電針處理的基礎(chǔ)上使用Nrf2/HO-1通路抑制劑全反式維甲酸處理大鼠結(jié)果顯示，全反式維甲酸能夠逆轉(zhuǎn)電針對(duì)HIBD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用，加重腦部炎癥損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)，表明電針可能通過(guò)促進(jìn)Nrf2/HO-1通路激活來(lái)抑制HIBD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，從而改善腦組織炎癥損傷。

綜上所述，電針可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路抑制HIBD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，并促進(jìn)其由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，以此抑制炎癥反應(yīng)，改善腦組織炎癥損傷。