自發(fā)氣調(diào)包裝對芥藍采后葉綠素降解及品質(zhì)保持的影響

王 玲，戴凡煒，吳繼軍，葉明強，陳飛平，戚英偉，羅 政，陳敏惠，陳于隴

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室， 廣東 廣州 510610)

芥藍(Brassicaoleraceavar. Alboglabra)屬于十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)植物，富含豐富的維生素C、類胡蘿卜素、酚類化合物、葡萄糖苷等活性成分，在抗氧化及抗癌等方面作用顯著，是一種具有豐富營養(yǎng)和藥用價值的蔬菜[1]。鮮食是芥藍主要的消費方式，但芥藍葉片表面積大、含水量高，由于呼吸代謝、蒸騰作用導致其貨架期短、損耗高[2]。在常溫下貯藏2～3 d芥藍即出現(xiàn)葉片黃化、萎蔫、薹莖空心等現(xiàn)象，嚴重影響其商業(yè)價值和食用價值。研究發(fā)現(xiàn)，利用氯吡苯脲(CPPU)、1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)，或復合保鮮劑通過熏蒸及浸泡等處理能有效減緩芥藍采后品質(zhì)劣變，此外真空預冷、低溫貯藏等物理保鮮技術(shù)也是延長芥藍貯藏保鮮期的重要方法[3-7]。但是，熏蒸、浸泡處理需要精準地控制濃度和時間，增加了生產(chǎn)環(huán)節(jié)及成本，而真空預冷、低溫貯藏都需要結(jié)合相應的設備才能實施。因此，采用綠色安全、方便操作的保鮮技術(shù)減緩葉片黃化對芥藍采后品質(zhì)保持具有重要意義。

自發(fā)氣調(diào)貯藏利用果蔬自身的呼吸作用以及包裝袋薄膜的透氣、透濕功能，通過微環(huán)境改變，抑制呼吸代謝和減少乙烯的生物合成，達到保持果蔬品質(zhì)的目的[8]。已有研究表明：自發(fā)氣調(diào)包裝可有效保持桑葉菜采后品質(zhì)[9]，減緩荔枝失水褐變[10]等，對延緩果蔬衰老具有良好的控制作用。自發(fā)氣調(diào)貯藏既可以在常溫貨架期發(fā)揮對果蔬的保鮮作用，同時結(jié)合低溫貯藏可達到更優(yōu)的保鮮貯藏效果。研究發(fā)現(xiàn)對于富含葉綠素的果蔬，高CO2條件能有效抑制葉綠素的分解，達到保綠效果，維持果蔬品質(zhì)[11-12]。葉綠素的降解是葉菜類蔬菜葉片黃化的直接原因，目前人們對葉綠素降解機制已進行了深入的研究，葉綠素降解途徑受到多種關(guān)鍵酶及編碼基因調(diào)控，脫鎂葉綠酸a加氧酶(pheide a oxygenase，PAO)途徑是主要的生化途徑[13]。但目前，通過自發(fā)氣調(diào)包裝控制芥藍采后葉片黃化的貯藏保鮮研究較少，對芥藍采后葉片葉綠素降解途徑的研究尚需進一步完善。本研究采用不同的自發(fā)氣調(diào)袋包裝芥藍，通過測定袋內(nèi)環(huán)境氣體組分及葉綠素代謝相關(guān)酶活性和基因表達水平變化，篩選可有效延緩采后芥藍葉綠素降解及品質(zhì)變化的自發(fā)氣調(diào)包裝，以期為自發(fā)氣調(diào)包裝在芥藍采后保鮮中的應用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白花芥藍，2021年4月19日采購自廣州市郊東升農(nóng)場。低密度聚乙烯(LDPE)微孔保鮮袋，厚度為0.01 mm，佳能公司。自發(fā)氣調(diào)袋1(modified atmosphere packaging 1，MAP1)、自發(fā)氣調(diào)袋2(modified atmosphere packaging 2，MAP2)，廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所改良的低密度聚乙烯配方，委托廣東寶德利新材料科技股份有限公司生產(chǎn)。2種改性氣調(diào)袋性能分別為：1)MAP1，厚度為0.02 mm、O2透過率為11 643 cm3/(m2·d)、CO2透過率為17 460.5 cm3/(m2·d)、透濕性為62.586 g/(m2·d)；2)MAP2，厚度為0.03 mm、O2透過率為5 625 cm3/(m2·d)、CO2透過率為8 437.5 cm3/(m2·d)、透濕性為17.812 g/(m2·d)。無水乙醇、丙酮、考馬斯亮藍、氫氧化鈉、鹽酸，分析純，上海源葉生物有限公司；液氮，佛山市普雷克斯公司；脫鎂葉綠酸a加氧酶(pheide a oxygenase，PAO)、植物脫鎂葉綠素酶(pheophytin pheophorbide hydrolyase，PPH)活性檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，北京天根生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

CTHI- 150B型恒溫恒濕箱，STIK施都凱儀器設備(上海)有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；Direct- Q3型純水儀，德國Merck Millipore公司；Checkmate 9900型頂空氣體分析儀，丹麥 PBI 公司；CFX ConnectTM型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀器，美國Bio-Rad公司；UltraScan VIS型色差儀，美國Hunter Lab公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品處理

芥藍采收后立即運至實驗室，在冷庫4 ℃進行預冷，隨后選取無機械損傷，長度、莖粗細均勻的新鮮芥藍進行包裝，分別用市售LDPE微孔保鮮袋(對照)、改性LDPE氣調(diào)袋(MAP1、MAP2)進行包裝，袋子大小390 mm×300 mm，每袋(300 ±1)g，熱封機密封，貯藏于15 ℃恒溫箱，在0、3、6、9 d取樣，每個處理每次隨機、均勻取3袋，進行相關(guān)指標的測定。

1.3.2氣體組分變化測定

用頂空氣體分析儀測定包裝袋內(nèi)O2與CO2含量，每個包裝袋上、下各選取3個部位分別貼上密封橡膠墊片，探頭針緩慢插入包裝袋內(nèi)，進行測定，每組處理重復測定3袋。

1.3.3芥藍顏色測定

將待測芥藍葉(從上往下數(shù)展開葉第4片)正面放在色度儀的檢測孔上運行程序，測定葉片的L*值、a*值、b*值。每袋芥藍至少隨機測10次色度值并取平均值，每組處理重復3袋。

1.3.4商品率測定

芥藍葉片綠色，無黃葉，記為0級，商品率為100%；芥藍葉片出現(xiàn)輕微黃化，黃葉面積約為25%，記為1級，商品率為75%；芥藍黃葉面積約為50%，記為2級，商品率為50%；芥藍大部分葉片黃化，75%≥黃葉面積≥50%，記為3級，商品率為25%；芥藍衰老，葉片黃化，黃葉面積≥75%，記為4級，商品率為0?？偤唾A藏過程中芥藍葉片黃化衰老變化，商品率按式(1)計算。

商品率=∑[(每級芥藍的數(shù)量×

所在級數(shù)的商品率)/調(diào)查總數(shù)]×100%。

(1)

1.3.5葉綠素含量測定

參考Zhang等[14]的方法，在黑暗條件下使用體積分數(shù)80%丙酮浸提葉片葉綠素，利用分光光度計測定663、645 nm處吸光度，按式(2)計算葉綠素質(zhì)量濃度(mg/L)，再按式(3)計算組織中葉綠素質(zhì)量比，單位為mg·g-1。

ρ(葉綠素)=20.29×A645+8.05×A663；

(2)

(3)

式(3)中，V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品鮮重，g。

1.3.6可溶性蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法進行測定，單位為mg·g-1。

1.3.7失重率測定

失重率計算見式(4)。

(4)

式(4)中，m1為貯藏前芥藍質(zhì)量，g；m2為貯藏后芥藍質(zhì)量，g。

1.3.8維生素C含量測定

采用2，4二硝基苯肼比色法測定維生素C的含量，單位為mg·g-1。

1.3.9葉綠素降解酶酶活測定

CLH活性參考Han等[15]的方法測定。PPH、PAO活性采用試劑盒進行測定，酶活單位為U·g-1。

1.3.10qRT-PCR分析

葉片組織RNA提取使用植物總RNA提取試劑盒進行，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。qRT-PCR分析參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成得到cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為反應模板，參照艾瑞科生物公司的SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR反應試劑盒說明書進行qRT- PCR擴增分析，內(nèi)參基因beta-actin及目的基因PaO、PPH、CLH1、RCCR(紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶，red chl catabolite reductase)、CHLI(鎂螯合酶Ⅰ亞基，magnesium-chelatase Ⅰ subunit)、CHLD(鎂螯合酶D 亞基，magnesium-chelatase D subunit)、CS(葉綠素合成酶，chlorophyll synthase)、NYC(葉綠素b還原酶，non-yellow coloring)基因引物序列參考文獻[16]，委托上海生工生物公司合成。采用Livak和Schmittgen(2001)的2-ΔΔCT公式計算基因相對表達量[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和相關(guān)性分析，并利用 Duncan多重性比較，進行差異顯著性分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差，不同字母代表P<0.05水平上差異顯著，P<0.01水平上差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同包裝對芥藍貯藏期品質(zhì)變化規(guī)律的影響

2.1.1不同包裝芥藍貯藏期袋內(nèi)氣體組分變化

貯藏袋中的各組分氣體的體積分數(shù)對果蔬的生理活動有重要影響。3組包裝袋內(nèi)的O2及CO2氣體體積分數(shù)變化見圖1。由圖1(a)可知，在整個貯藏期間，CK組袋內(nèi)O2體積分數(shù)無明顯變化，維持在20%上下；而MAP1、MAP2 組O2體積分數(shù)極顯著低于CK組(P<0.01)，O2體積分數(shù)在貯藏 3 d時明顯下降，分別下降至3.13%、1.12%；在貯藏3～9 d時，MAP1組O2體積分數(shù)呈上升趨勢，MAP2組O2體積分數(shù)趨于穩(wěn)定，在貯藏9 d時MAP1組O2體積分數(shù)極顯著高于MAP2組(P<0.01)。

由圖1(b)可知，在整個貯藏期間，CK組內(nèi)CO2體積分數(shù)呈不斷上升的趨勢，在貯藏9 d時，CO2體積分數(shù)積累至 1.33%；而MAP1、MAP2處理組明顯不同于CK組，在貯藏 3 d時，MAP1、MAP2組CO2體積分數(shù)已分別迅速上升至4.33%、4.63%，并且在3～9 d時，CO2維持在一定的平衡狀態(tài)，均極顯著高于CK組(P<0.01)，未出現(xiàn)明顯的變化趨勢，但在貯藏9 d時，MAP2組較MAP1組維持了較高的CO2體積分數(shù)，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明：MAP1與MAP2包裝處理通過快速降低O2體積分數(shù)，積累CO2改變了袋內(nèi)貯藏的微環(huán)境，且在貯藏 9 d時，MAP1與MAP2 組氣體體積分數(shù)極顯著不同(P<0.01)。

圖1 不同包裝袋中O2和CO2體積分數(shù)變化Fig.1 Changes of O2 and CO2 volume fractions at different packaging bags

2.1.2不同包裝對芥藍貯藏期外觀品質(zhì)及商品率的影響

不同包裝對芥藍貯藏期外觀的影響如圖2。3種包裝對芥藍貯藏期的外觀品質(zhì)保持有不同的影響。貯藏0 d時的芥藍，薹莖粗壯多汁，葉片飽滿、肥厚，并覆蓋有厚厚的白色蠟粉，呈深藍綠色，花球緊密，花蕾未開放。隨著貯藏時間的延長，15 ℃下芥藍葉片逐漸變黃，CK組貯藏3 d時整株葉片已發(fā)黃，花蕾開放，失去食用價值，商品率為51.25%；而MAP1、MAP2包裝組在貯藏3 d時葉片呈現(xiàn)深綠色，葉片上的白色蠟粉減少，花蕾少部分開放，仍具有食用價值，商品率分別為95.83%、96.43%。在貯藏6 d時，3種包裝的芥藍已全部發(fā)黃，葉片有明顯的失水現(xiàn)象，CK組黃葉最為嚴重，只有葉片局部呈現(xiàn)黃綠色，且花蕾開放后，掉落花朵，商品率為6.25%；MAP1、MAP2包裝組芥藍黃化略好于CK組，花蕾尚有部分未開放，但也失去食用價值，商品率分別為25.00%、36.10%。在貯藏9 d時，CK組葉片已呈現(xiàn)干、黃狀，葉片全部黃化，花朵全部脫落，商品率為0；MAP1組葉片全部黃化，花蕾開放、部分脫落；MAP2組仍有葉片局部呈現(xiàn)黃綠色，尚有花蕾未開放，商品率分別為2.50%、5.00%?？梢姡琈AP1、MAP2包裝可減緩芥藍葉黃化速率，延緩花蕾的開放，尤其是在貯藏前期(0～3 d)保持良好的外觀品質(zhì)。

2.1.3不同包裝對芥藍貯藏期葉綠素含量及顏色的影響

葉片黃化是評價芥藍感官品質(zhì)及可食性的主要因素，而葉綠素含量是影響葉片是否呈現(xiàn)綠色的主要原因之一，與黃化密切相關(guān)。不同包裝下芥藍葉綠素質(zhì)量比及色度值變化見圖3。由圖3(a)可知，各包裝處理的芥藍葉綠素質(zhì)量比均隨著貯藏時間的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，其中CK組下降最快，貯藏3 d時下降了26.47%，其次是MAP1組下降了14.67%，MAP2組葉綠素質(zhì)量比僅下降了4.74%，3組葉綠素質(zhì)量比差異顯著(P<0.05)；在貯藏9 d時，CK、MAP1、MAP2組葉綠素質(zhì)量比分別為0.07、0.12、0.22 mg/g，各包裝處理間差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明：MAP1與MAP2包裝能夠減緩葉綠素的下降，MAP2組較MAP1組能維持更高的葉綠素含量。

圖3 不同包裝下芥藍葉綠素質(zhì)量比及色度值變化Fig.3 Changes of chlorophyll mass ratio and chroma value in Chinese kale at different packaging bags

同時，通過色差儀測定葉片貯藏時期的L*值、a*值、b*值，也反映了不同包裝處理組的芥藍葉片在貯藏期間顏色的變化情況[圖3(b)～(d)]。亮度L*值表示葉片顏色由明到暗的變化程度，由圖3(b)可知，不同包裝處理組的芥藍L*值逐漸上升，表明隨著貯藏時間的延長葉片表面的亮度增加。在貯藏0～6 d，CK組L*值上升速率高于其他2組，在貯藏9 d時無明顯差異。由此可見，在15 ℃貯藏期間，芥藍葉片明顯由深綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，增加了亮度，而MAP1與MAP2組能夠抑制芥藍葉片顏色變化。

a*值為紅綠值，值越大表示綠色損失越多。由圖 3(c)可知，不同包裝處理組的芥藍a*值呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，說明隨著貯藏時間的延長葉片綠色呈現(xiàn)出先增加后逐漸變淺的過程。貯藏0～3 d，3組處理a*值下降，無明顯差異；貯藏3～6 d，CK組a*值不斷上升，顯著高于2個氣調(diào)袋包裝組(P<0.05)，而2組氣調(diào)袋包裝處理在貯藏6 d后，a*值才逐漸上升；貯藏9 d時，CK組a*值最大，MAP1組次之，MAP2組a*值最小，各包裝處理差異顯著(P<0.05)。結(jié)果說明，在15 ℃貯藏3 d后，芥藍葉片綠色明顯變淺；而MAP1與MAP2包裝延緩葉片轉(zhuǎn)色，在貯藏后期MAP2包裝較MAP1效果更好。

b*值代表藍黃程度，值越大表示顏色越黃。由圖3(d)可得，不同包裝處理組的芥藍b*值均呈現(xiàn)不斷上升趨勢，表明隨著貯藏時間的延長葉片黃色增加。其中CK組的上升速率最快，氣調(diào)包裝處理在貯藏0～6 d減緩了葉片黃化速率，貯藏6 d時MAP1與MAP2包裝b*值顯著低于CK組(P<0.05)，2組氣調(diào)包裝b*值無明顯差異，表明MAP1與MAP2包裝可延緩芥藍葉片黃化速率。

2.1.4不同包裝對芥藍貯藏期營養(yǎng)物質(zhì)的影響

失水導致果蔬萎蔫，新鮮度下降，而包裝處理是減少果蔬失水的重要手段之一。3組包裝處理對芥藍貯藏期失重率的影響如圖4(a)。在整個貯藏期間，3組處理失重率不斷上升。在貯藏3 d后，MAP1、MAP2組失重率開始低于CK組，并在貯藏9 d時，極顯著低于CK組(P<0.01)，但MAP1、MAP2組失重率無明顯差異。結(jié)果表明，MAP1與MAP2氣調(diào)袋包裝在貯藏后期可減緩芥藍失水。

芥藍富含豐富的維生素C，不同包裝下芥藍貯藏期維生素C質(zhì)量比的變化如圖 4(b)。在整個貯藏期間，3組包裝處理維生素C質(zhì)量比均不斷下降，CK、MAP1、MAP2組在貯藏3 d后，維生素C質(zhì)量比從64.30 mg/100 g分別下降了23.36%、6.50%、14.34%，3組處理中MAP1包裝維持較高的維生素C質(zhì)量比(60.12 mg/100 g)，極顯著高于CK組(P<0.01)。但貯藏6～9 d，3組包裝處理維生素C質(zhì)量比差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明：MAP1與MAP2包裝在貯藏前期(3 d)可延緩維生素C質(zhì)量比的下降，MAP1與MAP2組間無明顯差異。

可溶性蛋白與植物生理活動密切相關(guān)，也是果蔬貯藏品質(zhì)的重要指標之一，貯藏期間芥藍可溶性蛋白質(zhì)量比的變化見圖4(c)。由圖4(c)可知，隨著貯藏時間的延長，芥藍可溶性蛋白質(zhì)量比均呈下降趨勢，CK組下降速率最快，其次為MAP2組，MAP1組維持了較高的可溶性蛋白質(zhì)量比。MAP1組在貯藏3d時，可溶性蛋白質(zhì)量比明顯高于CK和MAP2組(P<0.05)，在6～9d時與MAP2組無差異，極顯著高于CK組(P<0.01)。可見，MAP1與MAP2包裝可有效抑制可溶性蛋白質(zhì)量比的下降。

圖4 不同包裝下芥藍營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量比的變化Fig.4 Changes of nutrients mass ratio in Chinese kale at different packaging bags

2.2 不同包裝對芥藍貯藏期葉綠素降解的影響

2.2.1不同包裝對芥藍貯藏期葉綠素降解酶活性的影響

不同包裝處理對芥藍葉綠素降解相關(guān)酶活性的影響如圖5。由圖5(a)可知，不同包裝芥藍的CLH活性均隨著貯藏時間延長不斷下降。CK組CLH活性下降最快，在貯藏6 d時，CK組CLH活性極顯著低于MAP1、MAP2組(P<0.01)；在貯藏3、9 d時，3組處理無明顯差異(P>0.05)。在整個貯藏期MAP1、MAP2這2組CLH活性無差異(P>0.05)?？梢姡琈AP1、MAP2包裝相較于CK組在貯藏期更能保持較高的CLH活性，2組氣調(diào)包裝葉綠素降解明顯受到抑制但CLH的活力反而提高，CLH可能并不是影響芥藍葉綠素降解的關(guān)鍵酶，這與宋慕波等[18]的研究結(jié)果類似，CLH不是香蕉和大蕉葉綠素降解的關(guān)鍵酶。

由圖5(b)可知，CK組的PPH活性在0～3 d先上升，3～6 d下降，6～9 d略有上升，貯藏3d時是酶活性高峰，極顯著高于MAP1和MAP2組(P<0.01)。MAP1、MAP2組PPH活性變化明顯不同于CK組，在0～3 d酶活性無明顯變化；3～9 d酶活性迅速升高，隨后下降，2組氣調(diào)包裝均在貯藏6 d時出現(xiàn)酶活性高峰，極顯著高于對照組(P<0.01)。在貯藏9 d時，MAP1組包裝保持較高的酶活性，CK組最低，3組處理間差異顯著(P<0.05)。可見，MAP1、MAP2包裝相較于CK組推遲了PPH活性高峰的出現(xiàn)，延緩了葉綠素降解；MAP2組比MAP1組PPH活性更低(P<0.05)，MAP2組較MAP1組對芥藍葉片保綠效果更好。

由圖5(c)可知，3組處理的PAO活性在貯藏 0～3 d均先下降，3～6 d逐漸上升；而6～9 d，CK組保持相對平衡狀態(tài)，但MAP1、MAP2組酶活性仍不斷上升。在貯藏6 d時，CK組的PAO活性極顯著高于其他2組(P<0.01)，MAP1、MAP2組無顯著差異(P>0.05)。貯藏9 d時，MAP2組PAO活性顯著高于CK組(P<0.05)。結(jié)果表明：貯藏 3～9 d，PAO活性不斷上升；貯藏6 d時，MAP1、MAP2包裝抑制了PAO活性上升，減緩了葉綠素降解過程和葉片黃化速率，MAP1和MAP2組無明顯差異。

圖5 不同包裝下芥藍葉綠素降解酶活性的變化Fig.5 Changes of activities of chlorophyll degradation enzymes in Chinese kale at different packaging bags

2.2.2不同包裝對芥藍貯藏期葉綠素代謝相關(guān)基因表達的影響

為進一步探究氣調(diào)包裝對芥藍黃化機制的影響，對貯藏期芥藍葉綠素代謝相關(guān)基因表達量進行了分析，見圖6。本研究分析了編碼葉綠素合成代謝通路中鎂螯合酶(magnesium-chelatase, CHL)和葉綠素合成酶(chlorophyll synthase，CS)兩類重要調(diào)控酶基因的表達差異。CHL是研究最為廣泛的一類ATP依賴的螯合酶，由I、D和H這3個亞基組成，是葉綠素合成途徑中第一個定向的步驟[19-20]。qRT-PCR結(jié)果顯示：鎂螯合酶3個編碼基因CHLI、CHLD、CHLH表達模式基本一致[圖6(a)～(c)]。CK組的3個基因表達量均隨著貯藏時間延長不斷下降，在貯藏3 d時，3個基因表達量均高于MAP1組，顯著低于MAP2組(P<0.05)，在貯藏6～9 d表達水平低于MAP1、MAP2組；MAP2組3個基因在貯藏3d出現(xiàn)表達峰，較CK和MAP1組顯著上調(diào)(P<0.05)，且在貯藏9 d表達量也顯著高于其他2組(P<0.05)。CS催化葉綠素酸酯a(chlide a)和葉綠素酸酯b(chlide b)分別生成葉綠素a和葉綠素b[21]。CS基因表達量變化如圖6(d)，在整個貯藏期CK和MAP1組CS基因表達量差異不顯著(P>0.05)，均低于MAP2組；且在貯藏3、9 d較MAP2組極顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果表明：與CK和MAP1組相比，MAP2包裝明顯促進了葉綠素合成代謝通路中CHLI、CHLD、CHLH、CS基因表達，在貯藏3 d出現(xiàn)高表達峰，而CK組這4個基因表達量均不斷下降。

葉綠素降解受組織內(nèi)多種酶類代謝調(diào)控。CLH催化葉綠素水解生成脫植基葉綠素和植醇，曾被認為是葉綠素降解代謝的第一步[22]。研究結(jié)果顯示[圖6(e)]，相比于0 d，3組處理中CLH1在采后貯藏期基因表達量均極顯著下降(P<0.01)；貯藏3 d時，CLH1在CK組的表達水平顯著高于MAP1、MAP2組(P<0.05)，在MAP1組的表達水平顯著高于MAP2組(P<0.05)；貯藏9 d時，MAP2組表達量顯著高于其他2組(P<0.05)，CK組的最低。但CLH1表達與CLH活性變化不一致，可能是CLH受多基因編碼導致，尚需進一步研究。PPH是葉綠素降解代謝的關(guān)鍵酶，去鎂葉綠素a(phein a)在PPH作用下除去植基，最后生成脫鎂葉綠酸a(pheide a)，而脫鎂葉綠酸a轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒獯x產(chǎn)物pFCCs主要依賴PAO和RCCR[23-24]。qRT-PCR結(jié)果顯示：PPH基因在CK組的表達量隨著貯藏時間延長先上調(diào)后下降，在貯藏6 d出現(xiàn)表達峰，在3 d和6 d表達量均高于MAP1和MAP2組；而MAP1和MAP2組均在貯藏9 d時表達量高于CK組，在整個貯藏期間，MAP1組在6 d時出現(xiàn)表達峰，MAP2組在9 d時出現(xiàn)表達峰[圖6(f)]。PAO基因表達量變化如圖6(g)，其表達模式類似于PPH，貯藏期CK組PAO表達量先上升后下降，且在貯藏6 d出現(xiàn)表達峰，顯著高于2組氣調(diào)袋包裝(P<0.05)，整個貯藏期CK組PAO表達量均顯著高于MAP1組，MAP1的PAO基因表達量在3 d和9 d顯著低于MAP2。葉綠素b還原酶(non-yellow coloring，NYC)基因也具有類似的表達模式[圖6(h)]，CK和MAP1組的NYC在貯藏6 d出現(xiàn)表達峰，MAP2組表達峰推遲出現(xiàn)在貯藏9 d。RCCR基因表達模式略有不同[圖6(i)]，CK和MAP1組的RCCR基因表達量先下降后上升，在貯藏后期再下降，而MAP2組呈先上升后下降的表達趨勢。在貯藏3 d時，MAP2組RCCR表達量上調(diào)，極顯著高于其他2組(P<0.01)；但CK組在貯藏6 d出現(xiàn)表達峰，高于2組氣調(diào)袋包裝，貯藏9 d時3組表達量無明顯差異。結(jié)果表明：氣調(diào)袋MAP1和MAP2包裝在貯藏前期(3、6 d)可抑制CLH1、PPH、PAO、NYC葉綠素降解酶基因的表達，推遲PPH、PAO、NYC基因表達峰的出現(xiàn)。

不同小寫字母表示同一時間組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖6 不同包裝下芥藍葉綠素合成酶及降解酶基因表達量的變化Fig.6 Changes of gene expression of chlorophyll synthesis and chlorophyll degradation enzyme in Chinese kale at different packaging bags

3 討 論

葉片褪綠轉(zhuǎn)黃是采后綠葉蔬菜貯運和銷售過程中品質(zhì)劣變的主要問題之一。綠色環(huán)保的貯藏保鮮方法成為綠葉菜采后貯藏亟須研發(fā)的方式。本研究詳細探索了自發(fā)氣調(diào)包裝對芥藍貯藏期品質(zhì)變化的影響。在室溫15 ℃貯藏條件下，氣調(diào)袋包裝處理抑制了L*值、a*值、b*值的上升[圖3(b)～(d)]，芥藍葉片保持了較高的葉綠素含量[圖3(a)]，其中MAP2氣調(diào)包裝效果最為顯著(圖2)。已有研究報道采后綠色蔬菜的氣調(diào)貯藏對保鮮的作用，如氣調(diào)包裝延緩西藍花乙烯釋放，抑制呼吸強度，延緩葉綠素下降[25]。Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)菜心貯藏在體積分數(shù)5%O2和10%CO2的條件下可有效減緩葉片黃化。將梨果實貯藏在18 kPa或2.5 kPa O2、2 kPa CO2的氣調(diào)環(huán)境下，可有效延緩梨果皮黃化[26]。在這些氣調(diào)包裝處理下貯藏期果蔬的生理代謝變化，可能與氣體組成和果蔬生理活動的相互作用有密切關(guān)系。本研究中，芥藍在MAP1、MAP2袋內(nèi)O2含量極顯著低于對照包裝(P<0.01)，CO2快速積累，維持在一定平衡狀態(tài)，最終形成低O2、高CO2的貯藏環(huán)境，減緩芥藍葉片品質(zhì)劣變。低氧環(huán)境可以有效降低果蔬新陳代謝，由于線粒體中電子傳遞鏈的末端氧化酶對氧氣有很高的親和力，但一般控制在體積分數(shù)2%～10%較為適宜，O2體積分數(shù)接近2%時，會引起組織的厭氧呼吸[27]。本研究使用的自發(fā)氣調(diào)包裝具有一定自發(fā)調(diào)節(jié)功能， MAP1、MAP2 的袋內(nèi)O2始終維持在合適范圍，可發(fā)揮良好的保鮮效果。MAP1和MAP2袋內(nèi)的O2和CO2含量變化存在差異，對芥藍失重率和維生素C、葉綠素、可溶性蛋白含量等產(chǎn)生不同的影響。因此，應針對不同的果蔬選擇適宜的氣調(diào)袋及包裝方式，達到有效保鮮的目的。

芥藍作為華南地區(qū)主要的綠色蔬菜之一，采后葉片衰老是影響其品質(zhì)的主要因素。在葉片衰老黃化過程中葉綠素不斷分解，原有的類胡蘿卜素暴露出來而使葉片黃化，這是一個從老的組織回收營養(yǎng)的主動過程[22]。葉綠素的合成及降解是由一系列酶共同作用的生化反應過程，涉及的酶由多個相關(guān)基因編碼[13]。本研究結(jié)果表明：芥藍貯藏過程中葉綠素合成酶基因CHLI、CHLD、CHLH、CS不同程度地受到自發(fā)氣調(diào)包裝的調(diào)控表達[圖6(a)～(d)]。CHL催化鎂離子螯合到原卟啉IX中，形成鎂原卟啉IX，是葉綠素合成的關(guān)鍵酶和重要調(diào)控酶[20, 28]。MAP2顯著提高了芥藍貯藏期CHLI、CHLD、CHLH基因表達量，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)葉綠素含量變化與CHLD、CHLH的表達水平呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(P<0.05，相關(guān)系數(shù)分別為0.681與0.716)。CS催化葉綠素生物合成途徑中的最終反應，并參與整個葉綠素生物合成途徑的反饋控制，其活性降低會導致代謝通量下調(diào)[29]。研究結(jié)果表明：CS在CK組貯藏期表達量較低，變化不明顯，MAP2包裝增加了CS表達量。在芥藍葉片黃化衰老過程中，葉綠素合成途徑中相關(guān)酶基因表達不斷下調(diào)，但自發(fā)氣調(diào)包裝提高了葉綠素酶合成基因的表達，可能對減緩葉綠素降解有一定的影響。因此，氣調(diào)包裝處理可通過影響芥藍葉片葉綠素的合成代謝參與調(diào)節(jié)葉片衰老進程。

研究表明，葉片衰老過程中CLH以及PPH這2種葉綠素降解途徑發(fā)揮著重要作用[30]。近年來，綠色蔬菜采后黃化衰老的葉綠素降解調(diào)節(jié)得到了廣泛關(guān)注和研究。樊艷燕等[30]研究發(fā)現(xiàn)，CLH基因在青花菜貯藏期表達水平低，CLH可能主要參與青花菜初始衰老時葉綠素的降解，在隨后的衰老中作用較??；馬陽歷等[31]研究發(fā)現(xiàn)BOSGR、BoPPH和BoRCCR參與西藍花采后貯藏過程的葉綠素代謝，BoPPH是促進黃化的主要原因。葉綠素降解是一個多酶參與、多步驟的反應。葉綠素b先轉(zhuǎn)化成葉綠素a，然后降解，NYC催化葉綠素b向7-羥甲基葉綠素a的轉(zhuǎn)化[32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NYC基因表達不斷上調(diào)，自發(fā)氣調(diào)包裝抑制了NYC基因表達，推遲了表達峰，在減緩葉綠素降解過程中起重要作用[圖6(h)]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)葉綠素含量與NYC基因表達呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)-0.641(P<0.05)。葉綠素在由脫鎂葉綠酸a轉(zhuǎn)化成pFCC的過程中，PAO和RCCR起重要的作用，PAO是葉綠素降解途徑中脫綠代謝的關(guān)鍵酶[33]。本研究結(jié)果表明：PAO基因表達在芥藍貯藏過程中逐漸上調(diào)并保持較高水平，但氣調(diào)包裝MAP2顯著降低了PAO基因上調(diào)表達[圖6(g)]，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)葉綠素含量與PAO基因表達呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)-0.591(P<0.05)。RCCR基因在貯藏3～6 d時表達量上調(diào)隨后下降[圖6(i)]。類似的變化規(guī)律也有一定報道。Fukasawa等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，花椰菜黃化過程中，對照組BoPaO、BoRCCR基因表達在貯藏前期明顯上調(diào)，隨后下降。同時，PPH活性及PPH基因表達量在芥藍葉片黃化期均呈上升及高表達量趨勢[圖6(f)]，主要影響葉綠素降解過程。此外，通過葉綠素代謝酶活性及基因表達的相關(guān)性分析，自發(fā)氣調(diào)包裝提高了葉綠素合成途徑CHLI、CHLD、CHLH、CS基因表達，抑制了葉綠素降解基因CLH1、PPH、PAO、RCCR、NYC的表達，同時，改變了不同貯藏時期芥藍CLH、PPH、PAO酶活性變化速率，達到延緩葉片黃化衰老的作用。由于氣調(diào)包裝主要是通過改變袋內(nèi)微環(huán)境的氣體組成發(fā)揮保鮮作用，本研究中氣調(diào)包裝可能通過調(diào)節(jié)芥藍所在環(huán)境的氣體組分，調(diào)節(jié)了芥藍的氧化衰老，從而進一步通過對葉綠素合成及降解代謝的調(diào)節(jié)，達到延緩芥藍褪綠衰老的目的。

4 結(jié) 論

本研究分析了氣調(diào)包裝處理對采后芥藍葉片黃化衰老的生理生化指標及葉綠素合成降解代謝的關(guān)鍵基因表達的調(diào)節(jié)。芥藍采后易發(fā)生葉綠素降解，自發(fā)氣調(diào)包裝通過改變袋內(nèi)貯藏的微環(huán)境，最終形成低O2和高CO2貯藏環(huán)境，減緩了生理代謝活動，降低了芥藍貯藏過程中失重速率和維生素C、可溶性蛋白的損失，保持良好的貯藏品質(zhì)。采后芥藍貯藏過程中，自發(fā)氣調(diào)包裝袋如MAP2通過延遲PPH活性峰出現(xiàn)，降低PAO活性增加速率，增加葉綠素合成途徑CHLI、CHLD、CHLH、CS基因表達，并在不同貯藏時期抑制CLH1、PPH、PAO、RCCR、NYC葉綠素降解基因的表達，延遲表達峰的出現(xiàn)，進而減緩葉綠素降解，延緩葉片黃化。此外，研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)氣調(diào)包裝抑制芥藍葉綠素降解，但CLH的活力反而提高，葉綠素酶可能不是芥藍葉綠素降解的關(guān)鍵酶，但尚需進一步研究。因此，氣調(diào)包裝處理可能為芥藍等綠色蔬菜的采后貯藏保鮮提供新的選擇。研究結(jié)果旨為進一步探索綠色、環(huán)保、高效的綠葉蔬菜采后貯藏保鮮方法提供一定參考。