阿魏酸對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制機(jī)理

張南海，金雨楠，陳怡冉，周靖萱，趙 亮，張列兵，吳 薇，周 峰,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100083；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院， 北京 100083)

全球范圍內(nèi)高尿酸血癥的患病率逐年增長(zhǎng)，已成為我國(guó)常見的代謝疾病和需要迅速解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-2]。高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂使體內(nèi)尿酸生成過(guò)多和(或)尿酸排泄障礙從而導(dǎo)致體內(nèi)尿酸水平超過(guò)正常范圍(男性≥420 μmol/L，女性≥360 μmol/L)而引起的疾病，抑制尿酸生成從而降低體內(nèi)尿酸水平是當(dāng)前主要的治療高尿酸血癥的手段[3]。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)是人體嘌呤代謝過(guò)程關(guān)鍵的限速酶，主要分布于哺乳動(dòng)物肝臟和腸道中，能催化次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，并進(jìn)一步氧化成尿酸[4]。抑制XO活性進(jìn)而減少尿酸生成是當(dāng)前臨床上控制高尿酸血癥和痛風(fēng)的一線治療手段[5-6]。

膳食多酚已被廣泛證明可通過(guò)抑制XO活性減少尿酸合成、抑制腎臟尿酸重吸收和促進(jìn)尿酸分泌，改善高尿酸血癥，而且已有報(bào)道通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)、光譜學(xué)和分子模擬等技術(shù)研究黃酮類化合物和XO的構(gòu)效關(guān)系及相互作用機(jī)理[7-9]。但作為多酚重要組分之一的酚酸類化合物與XO的相互作用研究相對(duì)較少。阿魏酸是一種酚酸類化合物，廣泛存在于水果、谷物和蔬菜中，具有良好的抗氧化、抗炎等功效，能改善代謝綜合征、高尿酸血癥、糖尿病、心血管疾病、癌癥等[10-11]。實(shí)驗(yàn)室前期評(píng)價(jià)了16種黃酮和酚酸類化合物對(duì)代謝綜合征大鼠的改善作用，發(fā)現(xiàn)阿魏酸降尿酸的效果最佳[12-13]。Li等[14]研究表明，阿魏酸可抑制氧嗪酸鉀和次黃嘌呤誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠肝臟XO活性。但對(duì)于阿魏酸如何抑制XO活性的研究不系統(tǒng)并存在一定爭(zhēng)議。例如：Nile等[15]從玉米中提取的阿魏酸可抑制XO活性，對(duì)XO的半抑制濃度(IC50)為(8.2±0.3)μmol/L，相互作用屬于混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Chang等[16]發(fā)現(xiàn)阿魏酸與XO相互作用屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Lin等[17]從薏仁麩皮中鑒定出的阿魏酸與XO相互作用屬于可逆的混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制，并能改變XO的三級(jí)結(jié)構(gòu)。而阿魏酸對(duì)XO的熒光猝滅機(jī)理、結(jié)合主要驅(qū)動(dòng)力及對(duì)XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響等方面少有報(bào)道。

本研究通過(guò)酶學(xué)及光譜學(xué)方法系統(tǒng)地解析阿魏酸對(duì)XO的抑制機(jī)理，包括抑制可逆性、抑制類型、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合力及XO結(jié)構(gòu)的變化等，通過(guò)分子模擬預(yù)測(cè)阿魏酸與XO的結(jié)合構(gòu)象及區(qū)域，綜合探究阿魏酸抑制XO活性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏酸、咖啡酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、沒(méi)食子酸，純度≥99%，上海麥克林生化科技有限公司；XO (Grade I)，美國(guó)Sigma公司；黃嘌呤(純度≥99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK- 80型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州邁科諾儀器有限公司；SpectraMax M2e型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；F- 7000型熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；Chirascan Plus型圓二色光譜儀，英國(guó)Applied Photophysics公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1不同酚酸對(duì)XO的抑制率測(cè)定

控制反應(yīng)體系為2 mL，以Tris- HCl (pH值7.4，50 mmol/L)為緩沖體系，將不同濃度的酚酸溶液與XO溶液(終濃度為0.075 μmol/L)于離心管中充分混合，在37 ℃恒溫水浴鍋中孵育30 min，再加入黃嘌呤溶液(終濃度為50 μmol/L)，混合均勻后，立即使用酶標(biāo)儀每隔5 s檢測(cè)反應(yīng)體系在290 nm處的吸光度，共檢測(cè)2 min，按照式(1)計(jì)算XO的相對(duì)活性，以濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo)，相對(duì)活性(%)為縱坐標(biāo)繪圖，采用GraphPad Prism 8.0計(jì)算半抑制濃度IC50。

相對(duì)活性=v/v0×100%。

(1)

式(1)中，v為酚酸存在時(shí)的反應(yīng)速率，v0為無(wú)酚酸存在時(shí)的反應(yīng)速率。

1.3.2阿魏酸對(duì)XO的抑制可逆性測(cè)定

控制反應(yīng)體系為2 mL，以Tris- HCl (pH值7.4，50 mmol/L)為緩沖體系，將不同濃度的阿魏酸溶液(0、120、160、180 μmol/L)分別與不同濃度的XO溶液(終濃度分別為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 μmol/L)于離心管中充分混合，在37 ℃恒溫水浴鍋中孵育30 min，再加入黃嘌呤溶液(終濃度為50 μmol/L)，混合均勻后，立即使用酶標(biāo)儀每隔5 s檢測(cè)反應(yīng)體系在290 nm處的吸光度，共檢測(cè)2 min，以XO濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率ν(min-1)為縱坐標(biāo)繪圖，通過(guò)相關(guān)性判斷阿魏酸對(duì)XO的抑制可逆性。

1.3.3阿魏酸對(duì)XO的抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定

控制反應(yīng)體系為2 mL，以Tris- HCl (pH值7.4，50 mmol/L)為緩沖體系，將不同濃度的阿魏酸溶液(140、160、180、200 μmol/L)與XO溶液(終濃度為0.075 μmol/L)于離心管中充分混合，在37 ℃恒溫水浴鍋中孵育30 min，再分別加入不同濃度黃嘌呤溶液(終濃度分別為25、40、50、100 μmol/L)，混合均勻后，立即使用酶標(biāo)儀每隔5 s檢測(cè)反應(yīng)體系在290 nm處的吸光度，共檢測(cè)2 min，以黃嘌呤濃度的倒數(shù)1/[S] (L/μmol)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率1/[ν](min)為縱坐標(biāo)，根據(jù)Lineweaver- Burk雙倒數(shù)方程，繪制關(guān)系曲線，判斷阿魏酸對(duì)XO的抑制類型。

1.3.4熒光滴定實(shí)驗(yàn)

以Tris- HCl (pH值7.4，50 mmol/L)為緩沖體系，取2.5 mL XO溶液(0.700 μmol/L)于1 cm石英比色皿中，向其中每5 μL滴加阿魏酸溶液(4 mmol/L)，每次滴加混勻后靜置5 min，分別在不同溫度(298、304、310 K)下，使用熒光分光光度計(jì)掃描290～500 nm熒光光譜，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm。

由于阿魏酸在280 nm (XO的激發(fā)波長(zhǎng))和330 nm(XO的發(fā)射波長(zhǎng))處有紫外吸收，會(huì)產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)，影響XO的熒光強(qiáng)度，因此熒光滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用式(2)進(jìn)行校準(zhǔn)[18]。

Fc=Fme(A1+A2)/2。

(2)

式(2)中，F(xiàn)m和Fc為校準(zhǔn)前后熒光強(qiáng)度，A1和A2為阿魏酸在280 nm和330 nm處吸光度。

1.3.5同步熒光光譜測(cè)定

反應(yīng)體系配制同1.3.4，在298 K條件下，設(shè)置發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)間隔(Δλ)分別為15 nm和60 nm，使用熒光分光光度計(jì)掃描200～350 nm同步熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，按照式(3)計(jì)算同步熒光猝滅比率(RSFQ)。

RSFQ=(1-F/F0)×100%。

(3)

式(3)中，F(xiàn)0和F分別代表未加和加入阿魏酸后XO的熒光強(qiáng)度。

1.3.6圓二色譜測(cè)定

以Tris- HCl (pH值7.4，50 mmol/L)為緩沖體系，配制阿魏酸與XO摩爾比為0∶1、10∶1、20∶1的反應(yīng)體系，并固定XO濃度為1 μmol/L，在持續(xù)氦氣流和60 nm/min掃描速度的條件下，使用圓二色光譜儀掃描190～250 nm遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜，取3次連續(xù)掃描的平均值，以Tris- HCl (pH值7.4，50 mmol/L)為空白，采用CDNN軟件計(jì)算XO二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲)含量的變化。

1.3.7分子模擬分析

采用AutoDock 4.2軟件模擬阿魏酸與XO可能的結(jié)合方式。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取阿魏酸的3D結(jié)構(gòu)，采用Sybyl X 2.0軟件Tripos力場(chǎng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.rcsb.org/pdb)中獲取XO (PDB ID：1FIQ)的晶體結(jié)構(gòu)，采用PyMOL 2.5軟件進(jìn)行去水、加氫和加Gasteiger電荷處理。設(shè)置XO活性中心的網(wǎng)格為60 ?×60 ?×60 ?，網(wǎng)格間距為0.375 ?，運(yùn)行次數(shù)為100次，選擇Lamarckian genetic algorithm (LGA)算法，其余參數(shù)默認(rèn)，將處理后的XO與配體分子阿魏酸進(jìn)行對(duì)接，選擇結(jié)合能最低且對(duì)接次數(shù)最多的構(gòu)象用于進(jìn)一步分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel軟件處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸對(duì)XO的抑制作用分析

不同酚酸對(duì)XO活性的影響見圖1。從圖1可以看出，5種酚酸均能在一定程度上抑制XO活性，且呈濃度依賴性。隨著酚酸濃度的增加，咖啡酸和對(duì)香豆酸造成XO活性呈先趨于平緩后迅速降低的趨勢(shì)，其余酚酸對(duì)XO活性的影響呈逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)酚酸達(dá)到一定濃度時(shí)，在阿魏酸、對(duì)香豆酸和綠原酸作用下，XO活性接近完全被抑制。不同酚酸對(duì)XO的抑制能力見表1。由表1可知，5種酚酸對(duì)XO的抑制能力由強(qiáng)到弱依次為阿魏酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸，對(duì)XO的IC50分別為116.2、144.2、175.7、193.5、194.6 μmol/L?？梢园l(fā)現(xiàn)羥基肉桂酸類化合物(對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸)對(duì)XO活性的抑制作用普遍強(qiáng)于羥基苯甲酸類化合物(沒(méi)食子酸)，可能與苯甲酸結(jié)構(gòu)相比，肉桂酸結(jié)構(gòu)更有利于與XO發(fā)生相互作用，從而抑制XO活性，咖啡酸的酚羥基甲基化(生成阿魏酸)或羧基酯化(生成綠原酸)均能提高對(duì)XO活性的抑制能力，Lin等[17]和Huo等[19]也發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象。而且對(duì)香豆酸的苯環(huán)甲氧基化(生成阿魏酸)可以增強(qiáng)對(duì)XO活性的抑制作用，但是增加羥基(生成咖啡酸)會(huì)降低對(duì)XO活性的抑制作用，其中阿魏酸對(duì)XO的抑制能力最強(qiáng)，可能與結(jié)構(gòu)中含有甲氧基有關(guān)，Lin等[17]也發(fā)現(xiàn)薏仁麩皮游離酚類化合物中含有甲氧基的羥基肉桂酸類化合物具有更強(qiáng)的XO抑制能力。因此，本研究選擇阿魏酸作為主要研究對(duì)象，進(jìn)一步探究其對(duì)XO抑制作用的機(jī)理。

圖1 不同酚酸對(duì)XO活性的影響Fig.1 Effect of different phenolic acids on XO activity

表1 酚酸結(jié)構(gòu)式及其對(duì)XO的抑制能力Tab.1 Structures of phenolic acids and their inhibiting abilities on XO

2.2 阿魏酸對(duì)XO的抑制可逆性分析

為了判斷阿魏酸對(duì)XO的抑制類型，建立了不同阿魏酸濃度下反應(yīng)速率v與XO濃度的關(guān)系(圖2)。所有擬合直線均經(jīng)過(guò)原點(diǎn)且具有良好的線性關(guān)系，隨著阿魏酸濃度的增加，擬合直線的斜率逐漸下降，表明阿魏酸對(duì)XO的抑制作用是可逆的，與Lin等[17]結(jié)果一致，且其分子間相互作用是非共價(jià)的，阿魏酸對(duì)XO的抑制可能是由于XO活性的降低，而不是XO有效量的減少[5]。

圖2 阿魏酸對(duì)XO的抑制可逆性Fig.2 Inhibitory reversibility of ferulic acid on XO

2.3 阿魏酸對(duì)XO的抑制動(dòng)力學(xué)分析

圖3 阿魏酸對(duì)XO的抑制類型Fig.3 Inhibitory type of ferulic acid on XO

混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)雙倒數(shù)方程見式(4)～式(6)[8]：

(4)

(5)

(6)

根據(jù)式(5)和式(6)，以斜率和截距分別對(duì)阿魏酸濃度繪圖，由圖3(b)、(c)可以看出二級(jí)方程曲線具有良好的線性擬合關(guān)系，表明阿魏酸與XO存在一個(gè)或一類結(jié)合位點(diǎn)[4]，并求得Ki為4.5 μmol/L，α為1.8，αKi大于Ki，表明阿魏酸可能與游離XO的親和力強(qiáng)于與XO-黃嘌呤復(fù)合物的親和力[5]。

2.4 阿魏酸對(duì)XO的熒光猝滅分析

本研究探討了阿魏酸對(duì)XO的抑制類型后，進(jìn)一步探究了阿魏酸對(duì)XO的抑制機(jī)理。內(nèi)源熒光猝滅是蛋白質(zhì)研究中必不可少的工具，能在分子水平提供蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化和小分子與大分子結(jié)合的信息，如結(jié)合機(jī)理、結(jié)合模式、結(jié)合常數(shù)、分子間距等[21-22]。圖4顯示了298 K下阿魏酸對(duì)XO的熒光光譜。由于內(nèi)源熒光氨基酸殘基(色氨酸和酪氨酸)的存在，XO在330 nm附近產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰；而在同等條件下，阿魏酸沒(méi)有產(chǎn)生發(fā)射峰，因此不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。隨著阿魏酸濃度的升高，330 nm處熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)阿魏酸濃度為80 μmol/L時(shí)，74.9%的XO熒光被猝滅，最大發(fā)射波長(zhǎng)產(chǎn)生10 nm的紅移，表明阿魏酸與XO發(fā)生了相互作用使得XO發(fā)色團(tuán)周圍的微環(huán)境發(fā)生改變。熒光猝滅機(jī)理分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)靜態(tài)混合猝滅，通過(guò)Stern- Volmer方程[見式(7)]進(jìn)一步探究阿魏酸與XO的相互作用機(jī)理[23]。

1～11表示阿魏酸濃度為0、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80 μmol/L時(shí)的熒光光譜；0表示僅阿魏酸存在下的熒光光譜，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K。圖4 阿魏酸對(duì)XO熒光光譜的影響Fig.4 Effect of ferulic acid on fluorescence spectra of XO

F0/Fc=1+Kqτ0[I]=1+KSV[I]。

(7)

式(7)中，F(xiàn)0和Fc分別代表未加和加入阿魏酸后XO的熒光強(qiáng)度，[I]為阿魏酸濃度，KSV為猝滅常數(shù)，Kq為生物分子猝滅速率常數(shù)(Kq=KSV/τ0)，τ0為無(wú)抑制劑情況下熒光團(tuán)平均壽命(2.8×10-9s)。

以F0/F對(duì)[I]繪圖，如圖5。由圖5(a)可知，在一定阿魏酸濃度范圍內(nèi)，阿魏酸對(duì)XO熒光猝滅的Stern- Volmer曲線明顯偏離了線性關(guān)系(向上彎曲)，表明阿魏酸與XO的相互作用機(jī)理是動(dòng)態(tài)靜態(tài)混合猝滅，應(yīng)采用修正的Stern- Volmer方程[見式(8)]進(jìn)行阿魏酸對(duì)XO的熒光猝滅分析[24]。

圖5 阿魏酸對(duì)XO熒光猝滅的Stern- Volmer曲線Fig.5 Stern- Volmer plots for fluorescence quenching of ferulic acid on XO

(8)

式(8)中，ΔF=F0-Fc，f為接近猝滅劑的分?jǐn)?shù)。以F0/ΔF對(duì)[I]繪圖并擬合直線，如圖5(b)。通過(guò)截距與斜率的比值求得不同溫度下阿魏酸與XO的KSV(表2)，分別為1.53×104L/mol (298 K)、1.57×104L/mol (304 K)、1.88×104L/mol (310 K)。隨著溫度的升高，KSV值逐漸升高，表明阿魏酸與XO的強(qiáng)親和力，溫度越高，阿魏酸- XO復(fù)合物穩(wěn)定性越低[10]。同時(shí)求得Kq分別為5.47×1012L/(mol·s) (298 K)、5.62×1012L/(mol·s) (304 K)、6.71×1012L/(mol·s) (310 K)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)[2.0×1010L/(mol·s)]，表明阿魏酸- XO復(fù)合物形成引起的靜態(tài)猝滅在XO的熒光猝滅中起主導(dǎo)作用[25-27]。

表2 不同溫度下阿魏酸- XO體系的有效猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Effective quenching constant, binging constants, number of binding sites, and thermodynamic parameters for ferulic acid-XO system at different temperatures

阿魏酸- XO復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)可通過(guò)式(9)計(jì)算[10]。

(9)

為了探究阿魏酸與XO相互作用的主要作用力，通過(guò)van’t Hoff方程[式(10)和式(11)]計(jì)算在不同溫度下阿魏酸- XO復(fù)合物形成過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)，如焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能(ΔG)等[10]。

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R；

(10)

ΔG=ΔH-TΔS。

(11)

式(10)、式(11)中，R為氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；T為溫度，298、304、310 K。由表2可知，ΔG<0，表明阿魏酸與XO之間的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)的；而ΔH<0和ΔS>0，說(shuō)明阿魏酸與XO的結(jié)合反應(yīng)是焓熵雙驅(qū)動(dòng)的放熱反應(yīng)，且其中主要驅(qū)動(dòng)力為氫鍵和疏水作用力[29]。

2.5 阿魏酸與XO的分子對(duì)接分析

為了探明阿魏酸與XO的結(jié)合位點(diǎn)及參與的氨基酸殘基，采用分子模擬技術(shù)預(yù)測(cè)阿魏酸與XO復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，見圖6。分子模擬技術(shù)能獲得小分子與生物大分子的結(jié)合姿態(tài)、結(jié)合能等信息[30-31]。圖6(a)展示了結(jié)合能最低且結(jié)合次數(shù)最多的阿魏酸與XO的結(jié)合姿態(tài)，發(fā)現(xiàn)阿魏酸進(jìn)入了XO中黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的異咯嗪環(huán)活性區(qū)域，即分子氧被還原生成超氧陰離子(O2-)或H2O2的區(qū)域，可與Glu263、Ile358、Asp360、Arg426和Lys433相互作用，阻礙了O2-的擴(kuò)散，導(dǎo)致電子從FADH2轉(zhuǎn)移到O2-，進(jìn)一步生成H2O2，從而減少了分子氧的還原，最終使尿酸生成減少[32]。阿魏酸與槲皮素、黃芩素、黃芩苷和非瑟酮等多酚類化合物作用方式一致，結(jié)合于XO的FAD區(qū)域，抑制尿酸的生成[5,29,33]。分子對(duì)接獲得的阿魏酸與XO的結(jié)合能為-23.73 kJ/mol，略高于298 K條件下熱力學(xué)分析的ΔG(-33.47 kJ/mol)，可能由于實(shí)驗(yàn)是溶劑中獲得的ΔG，而分子對(duì)接在真空環(huán)境下進(jìn)行，缺少去溶劑化能[23]。由圖6(b)可知，阿魏酸分子中酚羥基與氨基酸殘基Glu263形成鍵長(zhǎng)為2.56 ?的氫鍵，羧基與氨基酸殘基Asp360和Lys433形成了鍵長(zhǎng)為2.95、2.74 ?的氫鍵，可增強(qiáng)阿魏酸與XO復(fù)合物的穩(wěn)定性，同時(shí)分布著Ile358和Arg426等疏水性氨基酸，表明氫鍵和疏水性作用是阿魏酸與XO相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力，與熱力學(xué)分析結(jié)果一致。

圖6 阿魏酸與XO的分子對(duì)接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results of ferulic acid binding with XO

2.6 阿魏酸對(duì)XO色氨酸和酪氨酸微環(huán)境的影響

阿魏酸對(duì)XO同步熒光光譜的影響見圖7。同步熒光光譜被用來(lái)反映XO發(fā)色團(tuán)(色氨酸和酪氨酸)周圍微環(huán)境極性的變化，當(dāng)Δλ設(shè)置為15 nm和60 nm時(shí)，同步熒光分別提供了酪氨酸和色氨酸的光譜行為[34]。由圖7(a)和圖7(b)可知，隨著阿魏酸濃度的增加，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度均逐漸降低，當(dāng)阿魏酸濃度為80 μmol/L時(shí)，酪氨酸和色氨酸殘基的最大發(fā)射峰均發(fā)生了4 nm的紅移，表明阿魏酸的添加增大了XO分子中酪氨酸和色氨酸殘基周圍極性，使其疏水性降低[35]。RSFQ被用來(lái)評(píng)估酪氨酸和色氨酸殘基對(duì)蛋白熒光猝滅的影響，在同一抑制劑濃度下，對(duì)應(yīng)RSFQ越高的氨基酸殘基對(duì)蛋白熒光猝滅的貢獻(xiàn)更大[5]。從圖7(c)可以看出，在同等阿魏酸濃度條件下，Δλ=60 nm處的RSFQ高于Δλ=15 nm處的RSFQ，表明色氨酸殘基對(duì)XO內(nèi)源熒光猝滅的貢獻(xiàn)更大，阿魏酸與XO的結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸。

1～11表示阿魏酸濃度為0、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80 μmol/L。圖7 阿魏酸對(duì)XO同步熒光光譜的影響Fig.7 Effect of ferulic acid on synchronous fluorescence spectra of XO

2.7 阿魏酸對(duì)XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)測(cè)定阿魏酸添加后反應(yīng)體系的圓二色光譜來(lái)分析XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，見圖8。從圖8可以看出，阿魏酸-XO體系在210～220 nm有一個(gè)負(fù)峰，這是蛋白質(zhì)β-折疊的特征峰，與其他人研究結(jié)果一致[4, 36]。采用CDNN軟件計(jì)算XO與阿魏酸作用前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如表3。隨著阿魏酸與XO摩爾比的升高，α-螺旋含量逐漸提高，β-折疊含量逐漸減少，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量均逐漸降低。當(dāng)阿魏酸與XO摩爾比為20∶1時(shí)，α-螺旋含量從21.37%增加至29.47%，β-折疊含量從26.57%減小到20.10%，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量分別從19.20%和44.57%下降到17.30%和38.80%，表明阿魏酸能引起XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。有研究表明：β-鏈(β-折疊和β-轉(zhuǎn)角)和無(wú)規(guī)則卷曲含量升高會(huì)增加底物黃嘌呤結(jié)合到XO活性中心的機(jī)會(huì)[4]，α-螺旋含量的減少會(huì)使得部分蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊[37]，因此本研究結(jié)果中α-螺旋含量的增加會(huì)使得XO結(jié)構(gòu)的緊密性更強(qiáng)，不利于活性中心的形成，β-鏈和無(wú)規(guī)則卷曲含量的降低會(huì)阻止底物黃嘌呤進(jìn)入XO活性中心，從而減弱了XO的催化活性，該結(jié)果與多種多酚類化合物(紅陪酚、槲皮素、黃芩素、黃芩苷和高良姜素等)對(duì)XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響一致[4,23,26,34]。

圖8 阿魏酸對(duì)XO圓二色光譜的影響Fig.8 Effect of ferulic acid on CD spectra of XO

表3 XO和阿魏酸- XO體系的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Tab.3 Contents of secondary structures of XO and ferulic acid-XO systems

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)比常見的5種酚酸(對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸和沒(méi)食子酸)對(duì)XO活性的影響發(fā)現(xiàn)，阿魏酸對(duì)XO活性的抑制效果較佳，因而選擇阿魏酸進(jìn)一步全面探究其對(duì)XO的抑制機(jī)理。目前針對(duì)阿魏酸抑制XO的機(jī)理研究主要集中在抑制可逆性、抑制類型、猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及同步熒光等方面。Dumitrascu等[10]研究了阿魏酸與熱處理XO的結(jié)合性質(zhì)，而沒(méi)有針對(duì)未經(jīng)處理的XO進(jìn)行研究。Nile等[15]與Chang等[16]僅對(duì)阿魏酸與XO的抑制類型進(jìn)行了研究，本研究表明阿魏酸對(duì)XO的抑制類型為混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制，與Nile等[15]的結(jié)果一致，但與Chang等[16]的結(jié)果不一致。Lin等[17]研究了阿魏酸與XO的抑制可逆性、抑制類型、猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及對(duì)XO同步熒光的影響，與本研究有相同的抑制可逆性和抑制類型結(jié)果，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和同步熒光光譜也與本研究結(jié)果接近。而阿魏酸對(duì)XO的熒光猝滅機(jī)理、結(jié)合主要作用力及對(duì)XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響報(bào)道較少。因此，本研究在與前人相同的研究?jī)?nèi)容基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在這3方面進(jìn)行研究，并通過(guò)分子模擬技術(shù)預(yù)測(cè)可能的結(jié)合姿態(tài)及參與的氨基酸殘基，在驗(yàn)證前人結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲得了更系統(tǒng)全面的研究結(jié)果。

通過(guò)酶學(xué)、光譜學(xué)、分子模擬技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸采用可逆的混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式抑制了XO活性，在氫鍵和疏水作用力驅(qū)動(dòng)下阿魏酸自發(fā)地結(jié)合到XO的FAD活性區(qū)域，形成阿魏酸- XO復(fù)合物，阻礙了O2-擴(kuò)散，導(dǎo)致尿酸合成減少。阿魏酸結(jié)合XO的位點(diǎn)更靠近色氨酸殘基，增強(qiáng)了色氨酸殘基周圍的極性，同時(shí)降低了其疏水性，采用動(dòng)態(tài)靜態(tài)混合方式使XO的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，以靜態(tài)猝滅為主導(dǎo)，并且影響了XO的二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋含量升高，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量降低)，提高了XO結(jié)構(gòu)的緊密性。研究結(jié)果旨在為預(yù)防高尿酸血癥功能食品的開發(fā)等方面提供一定的理論依據(jù)，且阿魏酸來(lái)源廣泛，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。但阿魏酸會(huì)存在一定的性質(zhì)不穩(wěn)定性，后期將采用包埋等技術(shù)提高阿魏酸的穩(wěn)定性，進(jìn)而拓寬阿魏酸的應(yīng)用范圍；不同酚酸與XO之間是否存在一定構(gòu)效關(guān)系也將是后期研究的內(nèi)容。