乳清分離蛋白- 殼聚糖復(fù)合顆粒的構(gòu)建及其微觀結(jié)構(gòu)表征

龐志花，孫夢雅，李博睿，劉 萍，李夢飛，陳存社，劉新旗

(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院， 北京 100048)

微?；鞍资峭ㄟ^施加某些外力因素(如剪切、加熱)使得蛋白質(zhì)不再按照原有方式聚集而是形成微粒，該微粒的空間結(jié)構(gòu)相對有序且具有納微尺度。微粒化蛋白可以作為脂肪替代物或乳液穩(wěn)定劑在食品結(jié)構(gòu)中起重要作用，目前已經(jīng)有商業(yè)化的、以乳清蛋白為原料生產(chǎn)的微?；鞍子糜诘椭称返拈_發(fā)。多糖是另一類重要的生物大分子，可通過靜電吸引力的弱相互作用與蛋白質(zhì)形成高度結(jié)構(gòu)化的復(fù)雜大分子凝聚物，這種復(fù)合凝聚物往往顯示出比單獨的蛋白質(zhì)和多糖更突出的功能，比如水合作用、界面特性、穩(wěn)定性等。利用多糖對蛋白微粒進(jìn)行表面包裹，形成以蛋白為核、多糖為殼的復(fù)合結(jié)構(gòu)，已經(jīng)被證明可以有效提高蛋白微粒的穩(wěn)定性、潤滑性及輸送載體特性[1-6]。乳清蛋白是干酪加工的副產(chǎn)物，具有很好的乳化性和界面特性，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[7-8]。殼聚糖是自然界中唯一存在的天然陽離子多糖，具有良好的蛋白質(zhì)親和性，在食品領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[9-11]。二者可以在中性或弱酸性條件下發(fā)生靜電復(fù)合，是制備蛋白- 多糖復(fù)合微粒的理想原料。

蛋白質(zhì)- 多糖的復(fù)合程度及復(fù)合物結(jié)構(gòu)特征取決于環(huán)境條件及加工方式。由于復(fù)合凝聚是蛋白質(zhì)與帶電多糖之間通過靜電驅(qū)動的相互作用行為，因此復(fù)合顆粒的形成及其結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈依賴于pH值和鹽離子濃度。已有研究表明，殼聚糖在特定的鹽離子濃度和pH值條件下可以促進(jìn)或者阻礙β-乳球蛋白的熱聚集[12]。熱處理溫度直接影響蛋白質(zhì)的聚集程度，從而影響復(fù)合顆粒的大小與結(jié)構(gòu)。此外，在β-乳球蛋白與果膠的復(fù)合顆粒的研究中發(fā)現(xiàn)，混合方式即蛋白熱處理前混合或者熱處理后進(jìn)行混合，也被證明會影響復(fù)合顆粒的特性[13]。針對蛋白質(zhì)與殼聚糖的復(fù)合物研究，多集中于二者自組裝形成復(fù)合膜以及復(fù)合物的乳化、包埋性能等方面[14-17]，對于乳清蛋白- 殼聚糖復(fù)合顆粒的形成條件，特別是工藝條件對構(gòu)建其核殼結(jié)構(gòu)的影響，缺乏針對性研究。

本研究利用乳清蛋白和殼聚糖的靜電復(fù)合作用，構(gòu)建蛋白質(zhì)- 多糖復(fù)合微粒。研究pH值和鹽離子濃度對復(fù)合作用的影響，進(jìn)而以構(gòu)建核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合顆粒為目標(biāo)，研究熱處理溫度、二者混合方式、機(jī)械剪切對顆粒特性及其微觀結(jié)構(gòu)的作用，希望為構(gòu)建完整的結(jié)構(gòu)化乳清蛋白- 殼聚糖復(fù)合微粒提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(WPI)(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91%)，購于山東匯益生物科技有限公司；殼聚糖(CS)，購于上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20型pH計，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司；Cary- 60型紫外可見分光光度計，安捷倫科技(中國)有限公司；ZS90型Zeta電位儀，馬爾文帕納科(上海)公司；GHJ- 6型水浴磁力攪拌器，蘇州市國飛實驗儀器有限公司；FSH- 2型高速勻漿器，江蘇省常州市金壇區(qū)榮華儀器制造有限公司；X- 30R型離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；FOSS- 8400型全自動凱氏定氮儀，丹麥福斯分析儀器有限公司；A1Rsi型激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1WPI-CS復(fù)合體系的制備

WPI-CS復(fù)合體系的制備方法在課題組前期研究的基礎(chǔ)上加以修改[18]。準(zhǔn)確稱取適量的WPI粉末溶于去離子水，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的WPI儲備液，在25 ℃下用電子攪拌器以500 r/min攪拌30 min，置于4 ℃冰箱水化過夜。準(zhǔn)確稱取適量CS粉末溶于去離子水，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的儲備液，用1 mol/L HCl將儲備液pH值調(diào)至2.50，在25 ℃用電子攪拌器以500 r/min攪拌30 min。

混合相應(yīng)的儲備溶液，制備蛋白質(zhì)與多糖質(zhì)量比為9∶1的混合溶液，控制混合后總聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。向混合液中添加NaCl調(diào)節(jié)鹽離子濃度分別為0、20、50、100、200 mmol/L，分析鹽離子濃度對混合溶液濁度的影響。

1.3.2WPI-CS復(fù)合體系濁度的測定

采用紫外可見分光光度計對濁度進(jìn)行測定，使用1 cm石英比色皿，測定波長為600 nm。 滴定開始前，首先用1 mol/L HCl將WPI-CS混合溶液(總生物聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)pH值調(diào)節(jié)至2.00±0.20，用NaOH溶液對混合體系由酸性向中性滴定至pH值為7.00±0.20。每當(dāng)體系pH值變化0.10～0.20時，取樣測定其濁度，同時記下對應(yīng)的pH值。為保證整個體系混合均勻，滴定過程在磁力攪拌器上進(jìn)行。樣品濁度的計算公式見式(1)。

濁度=(100-T) ×100%。

(1)

式(1)中，T為透光度。

1.3.3WPI-CS復(fù)合顆粒的制備及組成測定

為了探究混合方式對制備WPI-CS顆粒特性的影響，選用先混合2種物質(zhì)再加熱和先加熱WPI再與CS混合的2種方法制備顆粒。

方法1：調(diào)節(jié)1.3.1中制備的混合溶液的pH值，分別在75、85、95 ℃熱處理30 min，然后用冰水將溶液迅速冷卻至室溫，混合液在4 ℃下以9 000 r/min離心30 min，收集沉淀物，所得顆粒稱為WPI-CS(混- 熱)。

方法2： 調(diào)節(jié)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的WPI溶液的pH值，分別在75、85、95 ℃熱處理30 min，然后用冰水將溶液迅速冷卻至室溫，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的CS儲備液，按照1.3.1中的方法制備混合溶液，混合液在4 ℃下以9 000 r/min離心30 min，收集沉淀物，所得顆粒稱為WPI-CS(熱- 混)。

分別采用凱氏定氮法和苯酚- 硫酸法測定離心后上清液中的蛋白質(zhì)和多糖含量，沉淀中蛋白質(zhì)和多糖含量的計算方法見式(2)和式(3)。

m1(沉淀)=m1-m1(上清液) ；

(2)

m2(沉淀)=m2-m2(上清液) 。

(3)

式(2)中，m1為原溶液中總蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；m1(沉淀)為沉淀顆粒中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；m1(上清液)為復(fù)合離心后上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。式(3)中，m2為原溶液中多糖質(zhì)量，g；m2(沉淀)為沉淀顆粒中多糖的質(zhì)量，g；m2(上清液)為復(fù)合離心后上清 液中多糖質(zhì)量，g。

1.3.4粒徑和ζ電位的測定

將熱處理后的混合液用高速勻漿器在剪切速度為10 000 r/min下剪切2 min，再稀釋至總生物聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。采用ζ電位儀測定剪切前后顆粒的粒徑和ζ電位，溶劑和復(fù)合顆粒的折射率分別為1.33和1.50。所有測量均在25 ℃下重復(fù)3次。

1.3.5顆粒形態(tài)觀察

使用激光共聚焦電子顯微鏡觀察顆粒中的蛋白質(zhì)和多糖分布。分別用熒光染料尼羅藍(lán)和5-氨基熒光素對WPI和CS進(jìn)行熒光標(biāo)記，室溫下攪拌1 h后，按照1.3.3中的方法制備WPI-CS復(fù)合顆粒。取400 μL顆粒分散液，滴于共聚焦小皿，并蓋上蓋玻片用于熒光觀察。尼羅藍(lán)和5-氨基熒光素的激發(fā)波長分別為633 nm和488 nm，使用60×物鏡掃描并收集熒光圖像，觀察顆粒的構(gòu)成形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析，在95%置信區(qū)間分析結(jié)果的顯著性。所有實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和鹽離子濃度對WPI-CS復(fù)合作用的影響

2.1.1pH值對WPI-CS復(fù)合作用的影響

WPI的等電點在pH值為4～5，CS的酸度系數(shù)(pKa)在6附近，對于蛋白質(zhì)和陽離子多糖復(fù)合體系，兩者結(jié)合形成復(fù)合物會改變混合體系的濁度[19]，因此，可利用濁度滴定法研究WPI與CS的復(fù)合程度。圖1為WPI和WPI-CS溶液濁度隨pH值變化的情況。從圖1可以看出，隨著pH值的增加，WPI溶液濁度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在pH值為4.45時溶液達(dá)到最大濁度值，為79.48%，說明WPI的等電點在pH值為4.45附近。隨著pH值的增加，WPI-CS溶液濁度呈現(xiàn)先增加后減小再增加最后穩(wěn)定的趨勢，在pH值5.47時達(dá)到最大濁度值，為98.34%。該結(jié)果是因為當(dāng)pH值高于WPI等電點時，WPI帶負(fù)電荷，可與帶正電荷的CS發(fā)生靜電吸引作用，表現(xiàn)為混合溶液濁度的迅速增加。當(dāng)pH值向CS的pKa靠近時，CS質(zhì)子化程度降低，與WPI的靜電吸引作用減弱[20]，因此溶液濁度減小。進(jìn)一步增加復(fù)合溶液的pH值，CS溶解度降低，以沉淀形式析出，導(dǎo)致整個體系的濁度增加[21-22]。

圖1 pH值對WPI和WPI-CS溶液濁度的影響Fig.1 Effect of pH value on turbidity of WPI and WPI-CS solutions

2.1.2鹽離子濃度對WPI-CS復(fù)合作用的影響

圖2為含有不同鹽離子濃度的WPI-CS溶液的濁度分析結(jié)果。由圖2可知，隨pH值的增加，各鹽離子濃度復(fù)合溶液的濁度曲線都呈現(xiàn)相同的變化趨勢，即先增加達(dá)到最大濁度值，隨后降低達(dá)到極小值，再增加最后趨于穩(wěn)定。與不含鹽離子WPI-CS溶液相比，添加不同鹽離子濃度的復(fù)合溶液最大濁度值均減小且達(dá)到最大濁度值對應(yīng)的pH值也降低。這是因為鹽離子的存在使WPI的等電點降低，鹽離子對表面電荷的屏蔽作用使得WPI與CS的結(jié)合程度降低[23]。在宏觀上表現(xiàn)為未添加鹽離子的復(fù)合溶液濁度更高。此外，鹽離子濃度越高，溶液濁度極小值越大，當(dāng)鹽離子濃度達(dá)200 mmol/L時，WPI-CS溶液濁度極小值最大，該現(xiàn)象是因為高濃度鹽離子對表面電荷的屏蔽作用會阻礙CS的去質(zhì)子化，從而阻止復(fù)合物解離。本部分研究表明，當(dāng)鹽離子濃度為0、pH值為5.47時WPI與CS的靜電吸引相互作用最強(qiáng)。

圖2 鹽離子濃度對WPI-CS溶液濁度的影響Fig.2 Effect of salt ionic concentration on turbidity of WPI-CS solutions

2.2 混合方式和熱處理溫度對WPI-CS顆粒特性的影響

在2.1中所得最佳鹽離子濃度和pH值的基礎(chǔ)上，探討混合方式和熱處理溫度對WPI-CS復(fù)合顆粒的顆粒特性的影響，實驗結(jié)果見表1 。

表1 WPI顆粒和WPI-CS復(fù)合顆粒的組成、粒徑和電位Tab.1 Composition, particle size and ζ potential of WPI particles and WPI-CS composite particles

2.2.1混合方式對WPI-CS顆粒特性的影響

由表1可以看出， WPI-CS(熱- 混)顆粒與WPI-CS(混- 熱)顆粒中WPI與CS的組成比例沒有顯著性差異。WPI-CS(熱- 混)顆粒的平均粒徑小于相同熱處理溫度下WPI-CS(混- 熱)顆粒的粒徑，這是因為先加熱WPI后與CS混合制備的WPI-CS顆粒的蛋白質(zhì)內(nèi)核是在沒有多糖存在的情況下形成的，顆粒粒徑主要取決于WPI在加熱過程中的聚集程度；而先混合WPI與CS，再加熱混合物制備的WPI-CS顆粒粒徑還受到CS比例的影響，會出現(xiàn)已經(jīng)形成的WPI-CS顆粒與WPI聚集體二次結(jié)合的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致最終形成的復(fù)合顆粒的粒徑更大，這在之前的報道中也有相關(guān)說明[13]。WPI-CS(熱- 混)顆粒在75 ℃時電位絕對值最大，為20.60 mV，顯著高于 WPI-CS(混- 熱)顆粒在85 ℃時達(dá)到的最大電位絕對值11.97 mV，即WPI-CS(熱- 混) 顆粒穩(wěn)定性更好。這是由于75 ℃加熱WPI時，WPI的解折疊程度低，在疏水相互作用和靜電相互作用的驅(qū)動下CS包裹在WPI表面且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，表現(xiàn)為電位絕對值大[24]；而先混合WPI和CS，再進(jìn)行加熱處理會使得已經(jīng)形成WPI-CS顆粒中的WPI構(gòu)象發(fā)生改變，WPI與CS結(jié)合作用減弱，體系變得不穩(wěn)定。研究表明，混合方式不會對WPI-CS顆粒的結(jié)合程度產(chǎn)生影響，先加熱WPI再與CS混合的方式可制備粒徑更小的復(fù)合顆粒，且該復(fù)合顆粒的穩(wěn)定性更好。

2.2.2熱處理溫度對WPI-CS顆粒特性的影響

熱處理溫度直接影響蛋白質(zhì)的聚集程度和顆粒形態(tài)。由表1可以看出，3種熱處理溫度形成的WPI-CS顆粒中WPI與CS的組成比例沒有顯著性差異，說明熱處理溫度不會對WPI-CS顆粒的結(jié)合程度產(chǎn)生影響。隨著熱處理溫度的增加，WPI和WPI-CS(熱- 混)顆粒的粒徑逐漸增加，電位絕對值逐漸減小。這是因為溫度升高，WPI的變性程度增加，解折疊程度更高，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露的更多，表面電荷隨之減少，WPI分子間的疏水相互作用得到加強(qiáng)，聚集程度增加[25]，從而形成粒徑更大、電位絕對值更小的顆粒。熱處理溫度對WPI-CS(混- 熱)顆粒的影響表現(xiàn)為隨溫度的增加，顆粒粒徑逐漸增加，電位絕對值先增大后減小，這可能是因為適當(dāng)熱處理可促進(jìn)WPI與CS的靜電絡(luò)合反應(yīng)，而溫度過高會破壞WPI-CS顆粒的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為電位絕對值下降。本研究結(jié)果表明，75 ℃熱處理WPI顆粒再與CS混合形成的復(fù)合顆粒的穩(wěn)定性最好，且顆粒粒徑較小。

2.3 剪切處理對WPI-CS顆粒特性的影響

為了明確剪切處理對顆粒粒徑和電位的影響，將WPI和WPI-CS顆粒進(jìn)行高速剪切處理，剪切后顆粒的粒徑和ζ電位的測定結(jié)果見表2。從表2可以看出，剪切處理后WPI顆粒和2種WPI-CS顆粒的粒徑值均隨溫度的升高而增大，且WPI-CS(熱- 混)顆粒的粒徑比WPI-CS(混- 熱)顆粒的粒徑更小，75 ℃時為744.5 nm；剪切后WPI顆粒和WPI-CS(熱- 混)顆粒在75 ℃獲得最大電位絕對值，WPI-CS(混- 熱)顆粒在85 ℃獲得最大電位絕對值，該現(xiàn)象與未剪切時顆粒的粒徑和ζ電位變化情況一致。結(jié)合表1和表2，對比剪切前后相同制備條件下的顆粒粒徑和ζ電位能夠看出，剪切處理可有效減小顆粒的粒徑，對WPI顆粒和先加熱WPI后與CS混合制備的WPI-CS顆粒的 ζ電位無明顯影響。本研究表明：剪切處理可獲得粒徑更小的WPI和WPI-CS顆粒，且不會改變混合方式和熱處理溫度對顆粒粒徑產(chǎn)生的影響；75 ℃或95 ℃熱處理WPI再與CS混合制備的WPI-CS顆粒經(jīng)剪切處理能形成粒徑更小、穩(wěn)定性更好的復(fù)合顆粒。

表2 剪切后WPI顆粒和WPI-CS復(fù)合顆粒的粒徑與電位Tab.2 Particle size and ζ potential of WPI particles and WPI-CS composite particles after shearing

2.4 WPI-CS復(fù)合顆粒的微觀結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)2.1、2.2、2.3中的實驗結(jié)果，制備在75、95 ℃熱處理條件下剪切處理的WPI-CS(熱- 混)顆粒。圖3為WPI和WPI-CS顆粒在60×物鏡下觀察到的熒光圖像，其中綠色熒光為CS，紅色熒光為WPI。從圖3(a)可以看到，75 ℃熱處理后的WPI以小顆粒狀均勻地分布在體系中。從圖3(b)可以看出，幾乎整個視野內(nèi)呈現(xiàn)黃色熒光。這是因為75 ℃熱處理后WPI解折疊，內(nèi)部疏水基團(tuán)展開，在疏水相互作用下發(fā)生聚集。CS在靜電相互作用和疏水相互作用下包裹在聚集的WPI表面，發(fā)生共定位現(xiàn)象，表現(xiàn)為黃色熒光，形成以WPI為核、CS為殼的復(fù)合顆粒。觀察圖3(c)可以發(fā)現(xiàn)，視野內(nèi)呈現(xiàn)紅色、綠色、黃色3種熒光，說明只有部分WPI與CS發(fā)生共定位現(xiàn)象，這是因為95 ℃熱處理后WPI解折疊程度過高，疏水相互作用增強(qiáng)，聚集程度更高，CS難以完全覆蓋WPI表面，最終形成 “核殼”結(jié)構(gòu)殘缺的復(fù)合顆粒。本研究表明，75 ℃熱處理條件下WPI能夠更好地與CS結(jié)合，形成的復(fù)合顆粒結(jié)構(gòu)更加完整。

圖3 WPI顆粒和WPI-CS復(fù)合顆粒的微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of WPI particles and WPI-CS composite particles

3 結(jié) 論

乳清蛋白和殼聚糖是構(gòu)建具有核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合微粒的理想原料。當(dāng)鹽離子濃度為0、pH值為5.47時，二者復(fù)合程度最高。熱處理溫度越高，顆粒粒徑越大。采用先加熱WPI再與CS復(fù)合，所制備的顆粒粒徑更小且電位絕對值更大。剪切處理可有效降低顆粒粒徑。本研究表明，75 ℃熱處理、熱- 混方式可以制備具有完整“核殼”結(jié)構(gòu)、粒徑為744.5 nm的復(fù)合微粒。研究結(jié)果旨在為蛋白質(zhì)- 多糖生物聚合物顆粒的制備及將其作為包封材料或脂肪替代物的開發(fā)提供重要數(shù)據(jù)。本研究探索了WPI-CS復(fù)合顆粒的形成條件及結(jié)構(gòu)特性，后續(xù)可進(jìn)一步研究顆粒體系的流變性、乳化性能、潤滑性等，明確WPI-CS復(fù)合顆粒的應(yīng)用特性。