白皮杉醇對阿爾茨海默病小鼠認知功能的改善作用

楊 薇，王宗偉，王子元，劉 潔，張 民，王 靜,*

(1.北京工商大學 食品與健康學院， 北京 100048；2.天津農學院 基礎科學學院， 天津 300392；3.天津農學院 食品科學與生物工程學院， 天津 300392)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)主要表現(xiàn)為認知障礙和記憶功能衰退[1]，在老年人中具有較高發(fā)病率，且病因復雜多樣，AD的一個重要臨床病理特征是β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)異常聚集[2]。Aβ的大量聚集和沉積致使細胞膜的完整性和功能性嚴重受損，進而促使細胞內活性氧自由基(ROS)的大量生成，引起大腦氧化應激反應，誘導細胞凋亡，引發(fā)機體認知障礙[3]。Aβ由39～43個氨基酸組成，以含有40個氨基酸的Aβ1-40和含有42個氨基酸的Aβ1-42為主。小膠質細胞 (microglia, MG)是一種存在于中樞神經系統(tǒng)中的主要免疫細胞，即特殊巨噬細胞[4], 游走在腦組織中，吞噬死亡、受傷的細胞以及外來入侵者，對維持大腦功能穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[5]。由于AD具有復雜的發(fā)病機制，研究表明Aβ沉積、膠質細胞活化增生、氧化應激和炎癥等多種因素都參與了AD病情的發(fā)生和發(fā)展[6-7]，減輕Aβ的沉積、氧化應激和炎癥成為目前防控AD的關鍵手段[8-9]。相較于具有副作用和依賴性的藥物治療，采用膳食營養(yǎng)干預對于AD預防和治療具有重要意義。

白皮杉醇(piceatannol，PIC)是一種存在于多種可食用植物(藍莓、葡萄、百香果等)中的天然多酚類化合物。PIC具有多種健康提升功能，如抗肥胖、抗糖尿病、神經保護、心臟保護、抗過敏、抗衰老等[10-11]。有研究表明，在細胞模型中，PIC可以通過激活α-分泌酶和基質金屬蛋白酶-9有效地降低β淀粉樣蛋白水平[12]。此外，PIC還被發(fā)現(xiàn)對Aβ誘導的神經突碎片有保護作用并抑制神經元凋亡[13]，可以通過提升線粒體功能保護神經細胞免于氧化損傷[14]。然而，關于PIC在AD改善方面的研究多停留在細胞水平，PIC能否在動物機體水平發(fā)揮相應認知保護功能尚需進一步明確；同時PIC對AD小鼠認知保護作用也需要進一步確認。本研究擬探討PIC對AD小鼠認知障礙和氧化應激反應的影響，以期為PIC輔助預防和治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性無特定病原體級的雄性昆明小鼠72只，7～8周齡，體質量(20±2) g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養(yǎng)期間，保持良好通風，自由飲水、進食標準小鼠飼料，室內適度通風、室溫25 ℃、濕度60%±5%，采用12 h/12 h晝夜間斷照明。

1.2 材料與試劑

PIC(質量分數(shù)≥98%)，購自上海源葉生物科技有限公司；D-半乳糖(D-galactose，D-gal)、三氯化鋁(AlCl3)，購自國藥集團化學試劑有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，購自上海拜力生物科技有限公司；鹽酸多奈哌齊(Donepezilhydrochloride)，購自衛(wèi)材(中國)制藥有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；Aβ1-42淀粉樣蛋白試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF-α)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗Iba1多克隆抗體，購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；尼氏(Nissl)染色液，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 儀器與設備

Spark型多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；CR22N型低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；EXF24086型- 80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo Fisher公司；CLYS2- AO型組織勻漿機，法國Bertin公司；ZS-001型Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司；IX72型熒光正置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.4 實驗方法

1.4.1AD小鼠模型構建

將72只小鼠隨機分為6組, 每組12只, 即正常對照組(Control)、模型對照組(AD Model)、陽性對照組(Donepezil)、白皮杉醇低劑量干預組(50 μg/mL，PIC-L)、中劑量干預組 (100 μg/mL，PIC-M)和高劑量干預組(200 μg/mL，PIC-H)。除Control，其余各組小鼠采用AlCl3和D-gal聯(lián)合誘導的方法，連續(xù)給藥70 d，構建阿爾茨海默病小鼠模型。造模期間每天早上9:00給藥，根據(jù)體質量按照20 mg/kg的劑量灌胃AlCl3，120 mg/kg的劑量腹腔注射D-gal。AlCl3溶解于超純水，D-gal溶解于生理鹽水，PIC溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。Control小鼠灌胃同體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。實驗模型構建35 d后，每日灌胃不同劑量PIC干預組小鼠相應的PIC劑量，連續(xù)干預35 d。Donepezil按4 mg/kg灌胃鹽酸多奈哌齊溶液。鹽酸多奈哌齊是一款處方藥物，適應癥為輕度或中度AD癥狀的治療。所有的實驗都得到了北京大學實驗動物中心動物倫理委員會批準(倫理號：LA2018143)。

1.4.2Morris水迷宮實驗

造模后給予小鼠5 d水迷宮訓練，并通過定位航行和空間探索了解本實驗小鼠的各項功能。水迷宮裝置由圓形水箱(高度50 cm、直徑120 cm)組成，實驗進行前，在第三象限的固定位置放置一個隱形逃生平臺。通過安裝于水池正上方中心位置的Morris軟件視覺跟蹤系統(tǒng)追蹤記錄小鼠的活動軌跡，計算小鼠到達平臺的時間和游泳距離作為逃避潛伏期，本實驗逃避潛伏期設為60 s。定位航行過程中小鼠學會尋找固定位置的隱藏平臺，空間認知的形成可以側面反映出小鼠的學習能力。在Morris水迷宮測試6 d后，撤去水中的隱藏平臺，對小鼠進行為期1 d的空間探索實驗。選擇距離原平臺最遠的入水點將小鼠面向池壁放入水池中，記錄其在60 s內的游泳軌跡、在目標象限的活動時間和穿越平臺次數(shù)用于評估小鼠的記憶能力。

1.4.3腦組織生化指標檢測

取腦組織于冰上，加入0.2 mL蛋白裂解液后，將其充分研磨至無絮狀物產生。隨后利用ELISA試劑盒檢測神經炎癥因子TNF-α水平和Aβ1-42蛋白水平。

1.4.4血清氧化應激指標檢測

行為學實驗后所有小鼠在禁食12 h后進行麻醉處理，通過眼眶取血，得到的全血于室溫下靜置35 min后離心(3 000 r/min、4 ℃、15 min)，分離上清液獲得血清，用于MDA、SOD和GSH-Px的測定。

1.4.5免疫熒光染色實驗

每組隨機選取4只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉5 min，固定小鼠后打開胸腔，經心臟灌注0.9%生理鹽水排空血液，再灌注質量分數(shù)為4%多聚甲醛溶液進行全身各器官固定。將腦取出后浸沒于25%的蔗糖PBS緩沖溶液(0.1 mol/L)中固定2 h，4 ℃冰箱中保存。將冰凍切片機干冰預冷，將腦組織從PBS緩沖液中取出，水平置放在冰凍切片機臺面上，調整切片厚度為40 μm。取小鼠腦組織切片，采用免疫熒光染色法分析小鼠大腦皮層、海馬CAI 區(qū)內Iba1表達情況。室溫下將腦切片于封閉液中孵育30～60 min，封閉結束后，進行抗體孵育和封片，顯微鏡下分析觀察。

1.4.6相對臟器指數(shù)測定

行為學實驗結束后所有小鼠在禁食12 h后進行麻醉處理，并迅速解剖小鼠，取全腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟等，將其在預冷的生理鹽水中漂洗除去血液，濾紙吸干水分，稱重記錄并計算各臟器指數(shù)[臟器指數(shù)為臟器質量(g)與動物體質量(g)的比值]，隨后置于液氮中迅速冷凍，于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計學軟件，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示，采用單因素方差分析對多組間數(shù)據(jù)進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 PIC對小鼠學習記憶功能的影響

Morris水迷宮測試常被用來評估小鼠的空間定位學習能力和記憶能力，本研究對小鼠進行了5 d的定位航行實驗，結果見圖1。由圖1可知，測試1 d各組小鼠找到水下隱藏平臺的時間相差不大，處于探索階段。與Control相比，AD Model小鼠的逃避潛伏期從第2天的訓練開始表現(xiàn)出顯著的增加(P<0.05)，表明AD model小鼠學習能力出現(xiàn)明顯的下降；而Donepezil和PIC-H顯著降低了AD小鼠的逃避潛伏期(P<0.05)。從3 d開始，AD model和PIC低、中、高劑量干預組與Control的小鼠逃避潛伏期均無顯著差異。訓練5 d，AD Model小鼠的逃避潛伏期最長，而Donepezil、PIC干預組均顯著改善了這種情況，其中PIC-H組的表現(xiàn)效果最好。將5 d學習期的逃避潛伏期進行橫向對比，結果如圖2。由圖2可知，PIC干預可以有效緩解由D-gal+AlCl3引起的小鼠認知障礙，實驗結果均表明PIC可以緩解AD小鼠學習能力的下降。

圖2 各組小鼠逃避潛伏期對比Fig.2 Comparison of escape latency of mice in each group

*表示同Control相比存在顯著性差異(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在顯著性差異(P<0.05)。圖3 各組小鼠的目標象限活動時間及穿越平臺次數(shù)Fig.3 Target quadrant activity time and times of crossing platform of mice in each group

在定位航行實驗結束的2 d后撤去水中的隱藏平臺，對小鼠進行為期1 d的空間探索實驗。測定小鼠在60 s內在目標象限的活動時間和穿越平臺次數(shù)，結果如圖3。由圖3可知，與Control相比，AD Model小鼠在目標象限的游泳時間顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05)，表明AD Model小鼠記憶功能出現(xiàn)明顯的下降。與AD Model小鼠相比，Donepezil和PIC干預組在目標象限的游泳時間沒有顯著性差異，但PIC-L、PIC-M和PIC-H穿越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05)。與Control相比，PIC-H的平臺穿越次數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，表明PIC的攝入可以明顯提高AD小鼠的記憶功能，相關表現(xiàn)也可從小鼠的運動視蹤軌跡得到印證，結果見圖4。以上結果表明，灌胃AlCl3和腹腔注射D-gal造模小鼠表現(xiàn)出明顯的學習和記憶能力下降，PIC的攝入可以明顯改善AD小鼠的學習記憶功能，表明PIC可以緩解AD小鼠的認知功能障礙。

圖4 小鼠運動視蹤軌跡Fig.4 Visual tracking trajectory viscera of mouse movement

2.2 PIC對小鼠相對臟器指數(shù)的影響

在毒理學評價中臟器指數(shù)是評價器官損傷的重要指標，本研究探究了PIC是否對AD小鼠的臟器指數(shù)有一定的調控作用。通過稱量小鼠全腦、心、肝、脾、雙腎的質量，進行臟器質量系數(shù)的計算，心、肝、脾、雙腎的臟器指數(shù)檢測結果如表1，全腦指數(shù)如圖5。由表1和圖5可知，各組小鼠的臟器指數(shù)沒有明顯差異，但是AD Model小鼠和PIC-L小鼠的全腦指數(shù)顯著降低(P<0.05)，可能是灌胃AlCl3和腹腔注射D-gal造模過程中小鼠出現(xiàn)腦組織萎縮的現(xiàn)象，而Donepezil、PIC-M和PIC-H與Control沒有顯著差異(P>0.05)，表明PIC的攝入改善了AD導致的全腦指數(shù)降低的情況。實驗結果表明，AD不僅影響認知功能，還影響全腦指數(shù)，而PIC能夠在一定程度上改善AD小鼠全腦指數(shù)的下降，緩解了AD小鼠腦萎縮現(xiàn)象。腦萎縮與認知功能衰退呈正相關，因此實驗結果與水迷宮學習記憶功能的行為學評估結果相對應。

表1 各組小鼠相對臟器指數(shù)Tab.1 Relative organ index of mice in each group 10-2 g·g-1

*表示同Control相比存在顯著性差異(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在顯著性差異(P<0.05)。圖5 各組小鼠全腦指數(shù)Fig. 5 Whole brain index of mice in each group

2.3 PIC對小鼠腦組織Aβ1-42含量的影響

Aβ蛋白的聚集是造成AD病理的主要原因之一，而Aβ斑塊負荷毒性最大的是Aβ1-42[15]。因此，本實驗通過對小鼠腦組織中Aβ1-42蛋白水平進行檢測，分析PIC對AD小鼠認知功能的影響，結果如 圖6。由圖6可知，與Control相比，AD Model和Donepezil小鼠腦中的Aβ1-42含量顯著升高(P<0.05)，PIC低、中劑量組腦中的Aβ1-42含量顯著升高(P<0.05)，而PIC-H與Control沒有顯著差異(P>0.05)，說明PIC-H能顯著改善AD導致的小鼠腦組織中Aβ1-42毒性蛋白聚集的情況。

2.4 PIC對小鼠腦組織TNF-α表達水平的影響

*表示同Control相比存在顯著性差異(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在顯著性差異(P<0.05)。圖6 腦組織勻漿中Aβ1-42的質量濃度 Fig.6 Levels of Aβ1-42 in brain tissue homogenate

TNF-α主要由活躍的巨噬細胞和單核細胞分泌，是一種多效性細胞因子，在免疫功能中起著至關重要的作用。此外，大腦海馬區(qū)小膠質細胞活化受TNF-α的過度表達調控，引發(fā)機體認知功能障礙[16]。腦組織勻漿中TNF-α的水平如圖7。由圖7可知，與Control相比，AD Model小鼠的腦組織的神經炎癥因子TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。與AD Model相比，PIC低、中、高劑量組中的TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，表明攝入PIC可以緩解AD小鼠的炎癥反應。

2.5 PIC對小鼠腦組織小膠質細胞的影響

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的主要免疫細胞，在維持中樞神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的生理作用，其在一定程度上反映了神經元活性，不完全激活或失控的小膠質細胞可能會引發(fā)神經毒性作用，分泌促炎因子，從而導致神經退行性疾病[17]。由于PIC干預顯著降低腦組織中炎癥因子TNF-α含量，鑒于TNF-α通過調控小膠質細胞活化影響機體認知功能作用，提示PIC可能通過降低小膠質細胞的活化改善機體認知功能。各組小鼠腦組織小膠質細胞(Iba1+)的表達水平，結果如圖8所示。由圖8可知，與Control相比，AD Model小鼠的腦組織中Iba1+呈現(xiàn)出明顯的聚集反應，表明AD Model小鼠體內有明顯的炎癥反應；與AD Model相比，PIC干預組顯著改善了小鼠腦組織中Iba1+的聚集情況，其相對數(shù)量均明顯減少，證明PIC可以抑制小鼠海馬中的炎癥反應，其中PIC-H的改善效果更加明顯。

*表示同Control相比存在顯著性差異(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在顯著性差異(P<0.05)。圖7 腦組織勻漿中TNF-α的質量濃度Fig.7 Levels of TNF-α in brain tissue homogenate

圖8 小鼠腦組織小膠質細胞分布Fig.8 Distribution of microglia in mice brain

2.6 PIC對小鼠血清氧化應激指標的影響

氧化應激是指機體在受到各種內外環(huán)境的有害因素刺激時，體內產生大量自由基，氧化程度遠超出機體對氧化物的清除，造成機體抗氧化和氧化水平失衡，從而造成機體組織器官和細胞的生理及病理損傷[18]。因此，氧化應激反應被認為是由機體超負荷自由基造成的一種負面反應，也是導致AD等神經退行性疾病的至關重要因素[19]。研究表明氧化損傷還會造成線粒體受損加劇[20]，進而引發(fā)Aβ和神經纖維纏結，導致突觸變性和突觸功能紊亂[21]，加快AD病理進程。研究表明機體SOD和GSH-Px能有效清除體內多余的自由基，對于改善機體神經細胞氧化損傷具有重要作用[22]。前期研究表明食品功能因子例如多不飽和脂肪酸以及β-胡蘿卜素等都被證實通過提升血清SOD和GSH-Px活力，并降低血清中MDA含量，來減少機體氧化應激水平，改善大腦神經細胞氧化應激損傷[23]。本研究測定小鼠血清中氧化應激關鍵指標(SOD、GSH-Px及MDA)的水平，結果如圖9。由圖9可知，與Control相比，AD Model小鼠的SOD活力顯著降低(P<0.05)(圖9)。與AD Model相比，鹽酸多奈哌齊和PIC干預后可以不同程度地改善這種現(xiàn)象，顯著提高SOD的活力，并且PIC呈現(xiàn)劑量相關性，表明PIC可以有效提高AD小鼠的抗氧化能力。另外，與Control相比，AD Model小鼠的GSH-Px含量顯著降低(P<0.05)，鹽酸多奈哌齊和PIC干預可以不同程度地提高血清中GSH-Px的含量，表明PIC可以保護細胞免受過氧化物的損害。此外，在生物體內自由基作用于脂質發(fā)生過氧化反應，生成的氧化終產物MDA會對細胞代謝和功能產生重大影響，其含量高低反映了機體的氧化應激水平[24]。與Control相比，腹腔注射D-gal聯(lián)合灌胃AlCl3導致AD Model小鼠的MDA濃度顯著增高(P<0.05)，鹽酸多奈哌齊和PIC干預后可以顯著降低小鼠血清中MDA的濃度，并且PIC呈現(xiàn)劑量相關性，結果表明PIC可以有效降低AD小鼠體內的氧化應激水平。

*P<0.05表示同Control相比存在顯著性差異，# P<0.05表示同AD Model相比存在顯著性差異。圖9 各組小鼠血清SOD活力及GSH-Px和MDA濃度Fig.9 Enzyme activity of SOD and content of GSH-Px and MDA in each mice group

3 結 論

AD作為常見的神經退行性疾病，其發(fā)病率隨著人口老齡化而呈指數(shù)增長。由于AD的發(fā)病機制尚不清楚，目前全球尚沒有藥物來有效治療AD。近年來研究表明通過營養(yǎng)干預等手段有助于AD的防控。PIC是在百香果和藍莓中發(fā)現(xiàn)的天然多酚類化合物，具有廣泛的生物活性，能夠改善由代謝紊亂引起的高血糖癥和胰島素抵抗。在本研究中，通過水迷宮實驗表明PIC干預35 d能夠顯著改善AlCl3和D-gal聯(lián)合誘導小鼠認知障礙，小鼠空間認知記憶能力得到顯著提升。大腦切片免疫熒光分析表明，PIC干預能夠顯著降低小膠質細胞活化，緩解腦部炎癥，腦組織萎縮狀況也得到顯著改善。腦組織勻漿生化指標測試表明，相對于AD Model，PIC干預能夠顯著降低腦中Aβ1-42水平，減少腦內Aβ的聚集并降低腦組織中炎癥反應TNF-α水平。血液生化指標證實，PIC干預能夠顯著提升血清中SOD活力和GSH-Px濃度，降低血清中MDA濃度。研究結果表明PIC對于機體認知功能的提升可能通過其提高機體抗氧化能力、降低機體炎癥因子的表達來實現(xiàn)的，相關結論旨在為PIC調控機體認知障礙作用提供基礎理論依據(jù)。