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    大球蓋菇干制過程香氣變化規(guī)律及與關鍵酶促反應的關聯性

    2023-02-09 07:25:42李佳霖陳萬超劉曉風
    食品科學技術學報 2023年1期
    關鍵詞:辛烯蓋菇大球

    李佳霖,楊 焱,李 文,陳萬超,3,*,劉曉風

    (1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院, 甘肅 蘭州 730050;2.上海市農業(yè)科學院食用菌研究所/農業(yè)農村部南方食用菌資源利用重點實驗室/國家食用菌工程技術研究中心, 上海 201403;3.上海百信生物科技有限公司, 上海 201403)

    大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)是一種藥食兼用的食用菌,別名皺環(huán)球蓋菇、裴氏球蓋菇、赤松茸等,為擔子菌門(Basidiomycota),層菌綱(Hymenomycetes),傘菌目(Agaricales),球蓋菇科(Strophariaceae),球蓋菇屬(Stropharia)真菌[1]。研究表明,大球蓋菇富含蛋白質、多糖、酚類及多種維生素等營養(yǎng)成分,是各種生物活性物質的良好來源[2]。大球蓋菇環(huán)境適應能力極強、栽培模式粗放、經濟效益高,聯合國糧農組織(FAO)已向發(fā)展中國家推薦種植[3]。

    新鮮的大球蓋菇保質期短,主要是由于其較高的含水量和采后強烈的呼吸作用造成的。為延長大球蓋菇的貨架期,現主要通過干燥、罐裝和腌制等方法對其子實體進行加工處理。干燥具有操作簡易、成本低的優(yōu)點,是食品工業(yè)中最傳統(tǒng)、最有效的保鮮技術之一。該處理會直接影響食用菌風味特征,從而影響消費者選擇偏好,通過合理的方式控制食用菌產生良好的風味特性是對其品質評估的重要指標之一。目前,食用菌加工中最常用的干制方式有自然風干、熱風干燥、微波干燥、真空干燥和真空冷凍干燥[4]。與新鮮蘑菇相比,干蘑菇具有更濃郁的風味,并且在干制過程中營養(yǎng)成分和生物活性物質會發(fā)生改變[5]。胡思[6]研究發(fā)現,熱風干燥可更好地保留大球蓋菇菇粉中的滋味成分,并采用氣質聯用技術從熱風干制菇粉中檢出35種揮發(fā)性成分。李文等[7]對比不同干制方法處理的香菇樣品,發(fā)現熱風干燥后的樣品含硫化合物含量最高且香味濃郁。

    已有研究報道,食用菌干制過程中香氣的形成主要是通過酶促反應及非酶促反應[8-9]。酶促反應主要基于生物合成途徑,子實體內的酶受熱激活,不飽和脂肪酸發(fā)生降解,開始形成風味前體物質及部分香氣成分,后經關鍵酶的作用生成其他特征性香氣成分;非酶促反應是由于連續(xù)的高溫環(huán)境,使機體內部溫度持續(xù)升高,水分活度不斷下降致使酶的活性降低,加劇機體美拉德等熱化學反應的進行,最終共同形成食用菌特有的香味。由于干制過程伴隨多種中間產物的生成且反應變化快,這為食用菌風味研究帶來諸多困難。現階段對干燥大球蓋菇的研究主要聚焦于干燥方式及成品的風味,而對干制過程中特征性香氣成分的合成代謝及變化規(guī)律鮮有報道。

    本研究基于頂空固相微萃取結合氣相色譜- 質譜聯用技術(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS- SPME- GC- MS)對大球蓋菇55 ℃恒溫熱風干制處理過程中揮發(fā)性化合物的變化規(guī)律進行分析,利用氣味活度值(odor activity value,OAV)及偏最小二乘判別分析法(partial least squares-discriminant analysis,PLS- DA)篩選出關鍵氣味化合物,測定揮發(fā)性化合物代謝途徑中關鍵香氣代謝酶酶活,并將酶活與相應化合物含量進行相關性分析,闡述大球蓋菇在干制過程中特征性香氣的變化規(guī)律及形成機理,以期為大球蓋菇進一步的開發(fā)和利用提供理論依據。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)鮮菇子實體,購自上海菇林源菌業(yè)專業(yè)合作社(上海崇明)。鮮菇采用林下栽培模式栽培,培養(yǎng)基為稻草,菌種為球蓋菇5號[滬農品認食用菌(2004)第062號]。

    1,2-二氯苯(內標物),國藥集團化學試劑有限公司;C7~C30正構烷烴標準品,美國Sigma公司;脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)活性測定試劑盒、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)活性測定試劑盒,蘇州夢犀生物醫(yī)學科技有限公司。

    1.2 儀器與設備

    DGG- 9240B型電熱恒溫鼓風干燥箱,上海森信實驗儀器有限公司;MA100C- 000230V1型水分儀,德國Sartorius AG公司;HS- SPME進樣器,美國Supelco公司;75 μm DVB/CAR/PDMS型萃取纖維,美國Supelco公司; 7890A- 5975C型氣質聯用儀,安捷倫科技(上海)有限公司;DB- 5 ms型色譜柱,美國J&W Scientific公司; EPOCH2型酶標儀,美國伯騰儀器有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1樣品處理

    將鮮菇進行清洗修剪,使用恒溫鼓風干燥機在55 ℃條件下進行干制處理,從鮮菇(0 h)開始每隔 1 h 取樣,直至子實體水分質量分數小于10%時取樣完畢。本實驗共取樣13個(分別為0~12 h),干制過程中大球蓋菇水分含量如表1。將取得的樣品子實體切成均勻的薄片,準確稱取1.0 g,置于20 mL頂空瓶中待測。

    表1 大球蓋菇干制樣品水分含量Tab.1 Moisture content of dried samples of Stropharia rugosoannulata %

    1.3.2頂空固相微萃取提取條件

    采用頂空固相微萃取對樣品中的揮發(fā)性化合物進行提取,后通過氣相色譜- 質譜鑒定揮發(fā)性化合物。參考Li等[10]的方法,向裝有樣品的頂空瓶中,加入5 mL去離子水及10 μL 1,2-二氯苯(內標物,質量濃度為100 μg/mL),迅速密封瓶口混勻待測。頂空瓶置于55 ℃條件平衡10 min,將75 μm DVB/CAR/PDMS型萃取纖維經230 ℃老化20 min后插入頂空瓶中,在55 ℃水浴保溫吸附30 min,后立即將復合萃取纖維抽出并轉移到GC- MS進樣口中,在250 ℃下解吸10 min。

    1.3.3氣相色譜-質譜聯用分析條件

    色譜條件:色譜柱為DB- 5ms毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度保持在260 ℃;柱溫箱升溫程序設置為起始溫度50 ℃,保持1 min,以10 ℃/min速率升溫至280 ℃,并保持5 min;載氣體積分數為99.99%的氦氣;流速為1.0 mL/min;不分流進樣。

    質譜條件:電子轟擊離子源(EI),電離電壓70 eV;電流為35 μA;傳輸線溫度和離子源溫度分別保持在280 ℃和220 ℃;質量掃描范圍m/z35~450 u。

    質譜數據采用安捷倫GC- MS MSD ChemStation 數據分析軟件處理,并采用NIST11和Wiley譜庫檢索,根據C7~C30正構烷烴標準品計算化合物保留指數(retention index,RI),對揮發(fā)性化合物進行鑒定和分析。

    選用1,2-二氯苯作為內標物,通過內標法計算被測組分中揮發(fā)性化合物相對含量,計算方法見式(1)。

    (1)

    式(1)中,Ax為樣品中待測化合物的峰面積;mi為加入內標物的質量,μg;Ai為內標物的峰面積;mx為稱取的樣品質量,kg;Ci為樣品中待測化合物的質量分數,μg/kg。實驗結果均以干重表示。

    1.3.4氣味活度值評價

    氣味活度值通常用于單一化合物對樣品整體氣味的貢獻,是揮發(fā)性風味化合物的濃度與其閾值之比。一般認為,當OAV大于1時,說明該香氣成分為樣品的關鍵風味成分[11]。OAV計算方法見式(2)。

    (2)

    式(2)中,Ci為風味物質的質量分數,μg/kg;OTi為該風味物質的氣味閾值,μg/kg。

    1.3.5香氣代謝酶活性測定

    1.3.5.1 LOX活性測定

    LOX催化底物亞油酸氧化,生成的產物在 234 nm 處具有特征吸收峰,可通過測定樣品在 234 nm 波長處吸光度增加的速率計算LOX酶活。LOX活性單位定義:25 ℃中單位質量(mg)蛋白在單位體積(mL)反應體系中每分鐘催化吸光度變化0.01為一個酶活單位。

    按照LOX活性測定試劑盒上的方法檢測。稱取約0.1 g菇粉,加入1 mL硫酸緩沖液[含二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)]冰浴勻漿,15 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液待測。樣品組:在EP管中依次加入0.05 mol/L硼酸緩沖液(pH值9.0)790 μL 、亞油酸鈉10 μL 及上清液20 μL,混勻??瞻捉M用去離子水替代樣品組中的上清液,其他溶液及加入順序與樣品組相同。樣品組、空白組各取200 μL混合液移至96孔板中,25 ℃反應5 min,于234 nm處讀取吸光度,ΔA=A(測定)-A(空白),LOX酶活計算方法見式(3)。

    LOX酶活=ΔA×V(總)÷[Cpr×V(樣)]÷0.01÷t=820×ΔA÷ρ(蛋白質)。

    (3)

    式(3)中,V(總)為反應總體積,820 μL;V(樣)為上清液體積,20 μL;t為反應時間,5 min;ρ(蛋白質)為上清液蛋白質量濃度,mg/mL;LOX酶活單位為U/mg。

    1.3.5.2 ADH活性測定

    ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+,NADH在340 nm處有吸收峰,而NAD+沒有。可通過測定樣品340 nm波長處吸光度下降的速率計算ADH活性。ADH活性單位定義:25 ℃中單位質量(mg)蛋白每分鐘氧化1 nmol NADH為一個酶活單位。

    按照ADH活性測定試劑盒上的方法進行檢測。稱取約0.1 g菇粉,加入0.1 mol/L PBS(pH值6.0)1 mL,冰浴勻漿,15 000 r/min、4 ℃離心20 min,取上清液置冰上待測。在96孔板中加入Na2HPO4·12H2O、DTT、EDTA、PVPP、免疫染色通透液(Triton-X-100)和NADH的混合液160 μL,再加入乙醛20 μL及上清液20 μL,混勻。于340 nm處讀取吸光度,記錄15 s和75 s時的吸光度,分別記為A1和A2,ΔA=A1-A2,ADH酶活計算方法見式(4)。

    ADH酶活=[ΔA÷ε÷d×V(總)×109]÷[ρ(蛋白質)×V(樣)]÷t=3 215×ΔA÷ρ(蛋白質)。

    (4)

    式(4)中,ε為NADH摩爾消光系數,6.22×103L/(mol·cm);d為96孔板光徑,0.5 cm;V(總)為反應總體積,200 μL;V(樣)為上清液體積,20 μL;t為反應時間,1 min;ρ(蛋白質)為上清液蛋白質量濃度,mg/mL;ADH酶活單位為nmol/(min·mg) 。

    1.4 統(tǒng)計分析

    利用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘判別分析;采用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析,數據用平均值±標準差(SD)表示,實驗重復3次;采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對不同干燥時間段樣品進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著;相關性分析通過https:∥www.chiplot.online在線平臺繪制。

    2 結果與分析

    2.1 干制過程中揮發(fā)性化合物成分分析

    采用HS- SPME- GC- MS對不同干制時間段的大球蓋菇樣品中揮發(fā)性風味化合物進行分析,結果見圖1。在整個干制過程中共鑒定出245種揮發(fā)性化合物,其中包括34種醛類化合物、40種醇類化合物、37種酮類化合物、29種酯類化合物、7種酸類化合物、24種烷烴類化合物、26種烯烴類化合物及48種其他類化合物。不同時間段化合物數量及相對含量統(tǒng)計結果見圖1(a)和(b)。由圖1(a)和(b)可知,干制過程中揮發(fā)性化合物組成及含量存在明顯差異。多種化合物在干制過程中生成,又被快速消耗,這說明干制是一個復雜的過程,其中伴隨多種化合物的代謝[12]。整個干制過程主要揮發(fā)性組分為醛類、醇類及酮類物質,三者含量之和占總化合物干質量的65.49%~89.30%,其中醛類化合物占比在整個過程始終保持最高,其次是醇類化合物,而烯烴類、酸類和酯類化合物占比較低,干制完成時烯烴化合物的種類及含量明顯高于鮮菇。

    隨著干制時間的推進,揮發(fā)性化合物總含量變化趨勢如圖1(c)。由圖1(c)可知,干制0~3 h,揮發(fā)性化合物總含量趨于穩(wěn)定;在4~5 h總含量呈明顯下降趨勢,在5 h時達到最低值,為4.402 87 mg/kg。這可能是因為長時間的加熱使細胞失水,參與揮發(fā)性物質合成的相關酶受熱脅迫的影響,使其酶活降低,即酶促反應受到了抑制。干制6~12 h,揮發(fā)性化合物總含量呈現先上升后下降的趨勢,6~8 h總量上升,可能原因是非酶促反應加劇,如Maillard反應、類脂氧化反應、Amadori重排、Strecker降解等,并伴隨少量酶促反應的發(fā)生;8 h后揮發(fā)性化合物總量呈下降趨勢,這是由于組織的大量失水使子實體內部機體反應停滯,以及自身物質的消耗導致的[13]。

    圖1 大球蓋菇干制過程中揮發(fā)性化合物的變化趨勢Fig.1 Variation trend of volatile compounds in Stropharia rugosoannulata during drying process

    在大球蓋菇整個干制過程中醛類化合物最為豐富[圖1(b)],其味覺閾值較低,對整體氣味貢獻度高。醛類化合物主要來源于支鏈和芳香氨基酸或半胱氨酸的降解及C16~C22不飽和脂肪酸的氧化分解[14]。醛類化合物具有多種香氣,微量的醛賦予物質醇厚的香氣,過量則會產生刺激性氣味。在整個干制過程中,大球蓋菇揮發(fā)性醛類化合物占總含量的29.15%~65.99%,其含量呈“M”形變化趨勢,干制2 h時含量達到最大值,為12.857 mg/kg[圖1(d)]。乙醛、2-甲基丁醛、異戊醛、正戊醛、正己醛、2-乙基-2-己烯醛、(E)-2-辛烯醛、苯甲醛等醛類物質存在于整個干制過程,其中含量最多的醛類物質為乙醛(0.192~2.472 mg/kg)、正己醛(1.236~6.705 mg/kg),前者具有水果風味,后者可賦予大球蓋菇青香氣味[15]。這兩種物質隨著干制時間的延長含量降低,這主要是因為干制后期該化合物受熱易散失而造成損失[16]。苯甲醛和異戊醛作為干制過程中另外兩種主要風味化合物,分別具有獨特的苦杏仁香及麥芽香氣,隨著時間的延長兩者含量呈上升趨勢,這主要是因為長時間高溫脅迫使得大分子糖類物質受熱分解為葡萄糖和果糖,加速了美拉德反應的發(fā)生,同時伴隨亮氨酸的Strecker降解,最終導致該類物質的生成,賦予干菇獨特的風味。

    醇類化合物主要是多不飽和脂肪酸在一系列酶的作用下發(fā)生脂質氧化的下游產物,是一類閾值較高的揮發(fā)性化合物,當含量足夠高時才可對風味起貢獻作用[17]。大球蓋菇干制過程中揮發(fā)性醇類化合物占總含量的5.17%~48.84%[圖1(b)],是第二大揮發(fā)性化合物,其含量變化波動較大[圖1(d)],這可能是因為醇類化合物是代謝下游物質,易受酶活、溫度等外界因素的影響。1-辛烯-3-醇、正己醇、甲醇是干制過程中含量較高的醇類化合物,其中1-辛烯-3-醇的質量分數最高(0.122~1.887 mg/kg),這與先前大多報道的1-辛烯-3-醇是食用菌中的典型揮發(fā)性八碳化合物的結論一致[18]。1-辛烯-3-醇又稱為“蘑菇醇”,具有標志性的蘑菇氣味,在干制過程中其含量呈“M”形變化趨勢,在干制11 h時達到最大值(1.887 mg/kg)。正己醇具有花香、脂肪香氣味,對大球蓋菇的呈味起輔助作用,并且隨干制進行含量下降。

    酮類化合物是一類重要的揮發(fā)性化合物,根據鏈的長度酮類化合物具有不同呈味特性,短鏈酮具有脂香和焦香味,長鏈酮具有較強的花香味[19]。干制過程中酮類化合物的變化趨勢為0~5 h先上升后下降,在干制4 h時達到最大值,5.212 mg/kg,隨后變化不明顯[圖1(d)]。干制期間主要的酮類化合物為3-辛酮、1-辛烯-3-酮、甲基壬基甲酮和仲辛酮,值得注意的是3-辛酮和1-辛烯-3-酮具有蘑菇味和土壤腥味,在整個干制過程中其含量逐漸降低,鮮菇中含量明顯高于烘干樣品,可以很好地解釋新鮮大球蓋菇中濃烈的泥土腥味主要是由3-辛酮和1-辛烯-3-酮發(fā)揮的作用。

    酯類化合物通常具有典型的果香味及輕微油脂香味,為許多果蔬的主要揮發(fā)性化合物。大球蓋菇中酯類化合物含量較低,且隨干制時間延長逐漸降低,主要原因在于酸、醇類等前體物在長時間熱脅迫條件下大量損失,且后期受非酶促反應影響生成雜環(huán)類及酮類物質,最終賦予大球蓋菇輕微豆香及水果風味[20]。酸類化合物主要呈現腐敗的味道,給人帶來不愉快的感覺,脂肪酸具有油脂味。大球蓋菇干制過程中酸類化合物占比均小于2.75%[圖1(b)],且通常閾值較高,即該類化合物對大球蓋菇的氣味影響不大。烷烴類化合物是一類閾值較高的化合物,干制過程中主要烷烴類物質為正戊烷,可賦予大球蓋菇薄荷香味,干制后期烷烴類化合物含量增加,可能是因為烷氧自由基的裂解造成的[21]。除上述化合物外,隨著干制時間增加,子實體中產生如2-正戊基呋喃、吡咯等雜環(huán)類化合物,可增加干制品特有的堅果或烤焙香氣,這類小分子主要是由美拉德反應生成的[22]。

    2.2 利用氣味活度值和偏最小二乘判別分析對關鍵風味物質的鑒定結果

    風味感官呈現受化合物含量和閾值影響,氣味活度值(OAV)用來描述該揮發(fā)性風味化合物對樣品氣味的貢獻程度[23]。已有研究報道,OAV在0.1~1.0的化合物具有修飾風味的作用,大于1.0表明該化合物為關鍵風味物質,且值越大對樣品的整體氣味特性貢獻越大[24]。本研究對已報道閾值的風味化合物進行OAV計算,根據OAV結果共篩選出45種關鍵風味化合物(OAV>1),結果見表2[25-27]。由表2可知,在大球蓋菇整個干制過程中,1-辛烯-3-酮閾值較低,對應得到的氣味活度值最高,說明1-辛烯-3-酮是大球蓋菇子實體中風味貢獻最大的化合物。此外,異戊醛、正己醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、三甲胺均具有較高的OAV(數值遠大于1.0),即這些化合物對大球蓋菇的整體風味具有較高的貢獻。

    表2 大球蓋菇干制過程中關鍵揮發(fā)性化合物的OAVTab.2 OAV of key volatile compounds in Stropharia rugosoannulata during drying process

    為了更直觀地觀察干制過程中45種關鍵化合物的變化,本研究對這45種化合物進行OAV熱圖分析,見圖2,通過顏色梯度變化反映不同干制時間點在各分類水平上化合物組成的相似性和差異性。圖2中紅色表示OAV較高,藍色表示OAV較低。聚類分析結果表明:干制1 h和2 h OAV相似度高,主要氣味貢獻物質是(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-酮等;干制4 h和5 h時OAV相似度高,主要氣味貢獻物質是1-辛烯-3-酮、三甲胺等;干制7 h和9 h OAV相似度高,主要氣味貢獻物質是1-辛烯-3-酮等;干制8 h和11 h時OAV相似度高,主要氣味貢獻物質是1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇等;干制10 h和12 h時OAV相似度高,主要氣味貢獻物質是1-辛烯-3-酮、2(5H)-呋喃酮等。干制6 h與干制4、5 h可形成二次聚類,說明其具有相似性;同樣干制10、12 h與干制8、11 h形成二次聚類;以此類推逐級向上分,級數越高相似度越低。從整個干制過程的聚類圖來看,可以將13個干制時間段大致分為兩大類:干制前期0~6 h(Ⅰ類)及干制后期7~12 h(Ⅱ類)。對熱圖進一步分析表明,1-辛烯-3-酮在整個干制過程中始終是風味貢獻最大的化合物,(E,E)-2,4-癸二烯醛、己酸乙酯、正己醛的氣味貢獻度隨著干制的進行逐漸減小,而2(5H)-呋喃酮、異戊醛、2-甲基丁醛、2-正戊基呋喃等化合物主要在干制后期發(fā)揮貢獻作用。由此可知,干制過程中大球蓋菇的氣味變化特點是,鮮菇具有強烈的土腥味、青香味,隨干制進行該類物質的含量逐漸減少,干制后期呈現麥芽香、堅果香等風味,但整個過程中蘑菇味、土腥味仍是大球蓋菇的關鍵風味特征。

    圖2 大球蓋菇干制過程中關鍵揮發(fā)性風味物質的氣味活度值熱圖Fig.2 Heatmap of OAV of key volatile flavor compounds in Scropharia rugosoannulata during drying process

    利用偏最小二乘判別法(PLS- DA)對干制過程中45種關鍵揮發(fā)性化合物的種類及含量的動態(tài)變化進行可視化呈現,見圖3。由PLS- DA模型提取出3個主成分模型參數:R2X(cum)為0.618(>0.5),R2Y(cum)為0.973(>0.5),足以對X,Y矩陣數據做出解釋,Q2(cum)為0.788(>0.5),說明預測模型擬合度合理。由載荷得分圖[圖3(a)與圖3(b)]可知,兩個階段樣品(紫色點)在主成分1(PC1)上呈負相關,表明組間差異顯著;對于組內(黃色點)分析可知,每個樣本點均獨立存在,說明樣本之間差異性顯著。對載荷圖中的信息進一步分析,得到樣本與關鍵揮發(fā)性化合物之間具有一定的相關性,如C11(2-己烯醛)、C19[(E,E)-2,4-癸二烯醛]始終分布在干制2 h樣本點周圍,賦予該階段大球蓋菇葉片氣味、青香氣味;而C29(異戊醇)始終分布在干制8 h周圍,可賦予該階段大球蓋菇麥芽香氣。由此得出結論:不同時間點呈現的氣味特性,是由其獨特化合物導致的[28]。此外,經VIP得分值分析得到干制前期(0~6 h)和后期(7~12 h)的差異關鍵揮發(fā)性化合物(VIP>1)共20個,見圖3(c)。結合表2的呈味特征分析,干制前期貢獻成分為乙酸乙酯、2-己烯醛、巴豆醛、異戊醇、(Z,E)-2,4-二烯醛、戊酸Z酯、(E,E)-2,4-二烯醛和己酸葉醇酯等8個化合物,風味呈現以青草、葉片清香為主(OAV遠大于1.0);其他12個化合物為干制后期貢獻成分,風味呈現麥芽、果香和蘑菇香味。由此結論進一步論證了熱圖分析的結果,隨著干制時間增加,大球蓋菇風味特征由青草味向濃郁的蘑菇香氣轉變。

    圖3 關鍵揮發(fā)性風味物質偏最小二乘法分析Fig.3 Analysis of key volatile flavor compounds by partial least square method

    2.3 香氣代謝關鍵酶活性變化及其與主要香氣成分關系

    揮發(fā)性風味化合物主要是通過機體內部的非揮發(fā)性前體物質經過一系列生物化學反應生成的。本研究通過對大球蓋菇干制過程中揮發(fā)性化合物組成、含量及氣味活度值的綜合評定,結果表明,影響其風味呈現的關鍵揮發(fā)性物質主要是醛類、酮類及醇類化合物,以醛類最為豐富。植物機體內醛類物質大致有3種產生途徑:通過以不飽和脂肪酸為前體物的LOX代謝途徑合成,在一系列酶的作用下進行醛、酮、酸及醇類等化合物的相互轉換[29];通過游離氨基酸介導的Strecker降解反應合成;通過非酶促美拉德反應獲得。LOX代謝途徑是合成C6、C8、C9醛類化合物的主要途徑[30],所生成代謝產物包含本研究得到的關鍵揮發(fā)性風味化合物。所以本研究進一步對大球蓋菇干制過程中涉及的關鍵酶促反應進行分析,見圖4。LOX代謝途徑主要分為4個階段[圖4(a)]:1)?;饷甘诡愔猱a生游離脂肪酸(主要是亞油酸和亞麻酸);2)游離脂肪酸在LOX作用下被氧化為C9-、C10-、C13-氫過氧化物;3)在氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase, HPL)的作用下氫過氧化物被進一步分解為C6-、C8-、C9-醛、酮類化合物;4)HPL酶解產物在ADH的還原作用下實現對相應醇類化合物的轉換[31]。香氣代謝合成酶的活性會導致風味化合物成分及含量的變化,直接影響食品的風味[32]。

    本研究對LOX代謝途徑中的關鍵酶LOX及ADH活性進行測定,分析在整個干制過程中風味酶酶活性的變化趨勢,見圖4(b)。結果表明,酶活隨干制時間的延長整體呈顯著下降的趨勢,在干制 10 h 后酶活性達到最低且隨時間延長不再變化。對于LOX活性,在干制0~3 h呈“V”形變化趨勢,干制3 h時酶活達到最大值(1 784.84 U/mg),隨后酶活呈下降趨勢。這是因為干制使得子實體外界環(huán)境突然升高,導致機體內部平衡紊亂使酶活下降;隨干制時間的延長,機體適應環(huán)境,內部平衡恢復,合成酶發(fā)生熱激活,有利于風味前體物的形成;后期溫度持續(xù)升高,使細胞失水、細胞通透性降低,最終導致酶活下降。對于ADH活性,在整個干制過程中呈“M”形變化趨勢,干制1 h和5 h時ADH受熱激活,其活性顯著高于其他時間點,這說明在55 ℃的干制條件下該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。值得注意的是,LOX的酶活明顯高于ADH的酶活,這為合成醛類化合物提供了足夠的前體物,這也是大球蓋菇中醛類化合物整體含量較多的原因之一。

    圖4 大球蓋菇干制過程中關鍵酶活性分析Fig.4 Analysis of key enzyme activity in Stropharia rugosoannulata during drying process

    將LOX和ADH兩種香氣代謝合成酶酶活與醛、醇類關鍵風味化合物含量及8類化合物總含量進行相關性分析[圖4(c)],結果表明:LOX酶活與大部分醛類化合物含量呈現正相關性,其中與大球蓋菇關鍵香氣組分乙醛、正己醛及2-己烯醛呈顯著正相關(P<0.05),該類化合物的前體物在LOX酶活較高的干制前期(0~6 h)得到迅速積累,為大球蓋菇特征香氣中略帶青草味奠定基礎;LOX酶活與酮類化合物總量亦呈顯著正相關(P<0.05),與醛類同屬不飽和脂肪酸氧化降解產物,產生的短鏈酮增加了大球蓋菇脂香和焦香味。ADH活性與醇類化合物含量具有較強的負相關性,這是因為ADH介導的醇與醛、酮之間的相互轉化是一個可逆反應,致使大球蓋菇醇類化合物同樣保持較高的含量,且整個干制過程波動較大;ADH活性與1-辛烯-3-醇和苯乙醇呈顯著負相關(P<0.05),隨著干制后期(7~12 h)酶活降低,這兩種化合物得到累積,其OAV分別為122.32~2 887.34和0.18~2.69(表2),從而呈現較為濃郁的蘑菇香氣。

    3 結 論

    本研究通過頂空固相微萃取結合氣質聯用技術在大球蓋菇干制過程中共鑒定出245種揮發(fā)性化合物,包括34種醛類化合物、40種醇類化合物、37種酮類化合物、29種酯類化合物、7種酸類化合物、24種烷烴類化合物、26種烯烴類化合物及48種其他類化合物。干制過程中揮發(fā)性化合物組成及含量存在明顯差異,其中醛、酮及醇類占比最大,為大球蓋菇中主要的揮發(fā)性物質。通過氣味活度值結合熱圖聚類分析,篩選出45種關鍵風味化合物,其中1-辛烯-3-酮始終是干制過程中氣味貢獻最大的化合物,其次是1-辛烯-3-醇、正己醛等物質;通過偏最小二乘判別分析法對45種關鍵化合物進行分析,得出干制前后期共有20種差異性化合物,綜合分析表明,隨著干制的進行,大球蓋菇土腥味、青草味逐漸減弱,干制后期由于美拉德反應生成多種雜環(huán)類小分子化合物賦予大球蓋菇焦香、麥芽香等風味,豐富了大球蓋菇的風味,但整個過程中蘑菇味、土腥味仍是大球蓋菇的關鍵風味特征。由于香氣代謝合成酶的活性會導致風味化合物成分及含量的變化,本研究通過對合成醛、醇、酮類化合物的主要酶促反應LOX途徑中相關香氣代謝酶活性進行測定,分析整個干制過程中該類酶活性變化趨勢,旨在為干制過程中醛、醇、酮類化合物含量的動態(tài)變化提供理論依據。結果表明,LOX、ADH具有熱激活現象,有利于干制過程中醛、醇、酮類化合物的生成,酶活隨干制的進行整體呈顯著下降的趨勢,在干制終點香氣代謝酶幾乎沒有活性。對代謝酶活性與對應化合物含量進行相關性分析發(fā)現,LOX活性與醛類化合物含量具有較強的正相關性,其中與乙醛、正己醛及2-己烯醛呈顯著正相關(P<0.05),為大球蓋菇特征香氣中略帶青草味奠定基礎。ADH活性與醇類化合物含量具有較強的負相關性,該酶可催化醇與醛、酮類化合物之間發(fā)生可逆轉換。ADH活性與1-辛烯-3-醇和苯乙醇具有顯著負相關性(P<0.05),從而使得大球蓋菇呈現較為濃郁的蘑菇香氣。本研究旨在揭示大球蓋菇干制過程的氣味特性的變化趨勢,希望為大球蓋菇進一步的開發(fā)利用提供理論依據。

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