網(wǎng)狀蛋白1C水平與三陰性乳腺癌新輔助化療療效的相關(guān)性研究

張曼麗，劉唯唯，王麗娟，李衛(wèi)東

三陰性乳腺癌（TNBC）占乳腺癌的19%～38%，其復(fù)發(fā)率和病死率均較高［1-2］。TNBC對(duì)靶向治療和激素治療均不敏感，其主要治療方法為化療和手術(shù)［3］。新輔助化療是TNBC的主要治療方法之一，若新輔助化療后病理學(xué)完全緩解，則預(yù)示TNBC 患者預(yù)后良好［4］。腫瘤形態(tài)分類及傳統(tǒng)影像學(xué)技術(shù)對(duì)新輔助化療療效評(píng)估具有滯后性［5］。因此，臨床需要準(zhǔn)確度高的指標(biāo)預(yù)判新輔助化療療效。網(wǎng)狀蛋白1C（RTN-1C）是網(wǎng)狀蛋白家族的一員，其主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能［6］。有研究報(bào)道RTN-1C 與細(xì)胞自噬關(guān)系密切，干擾RTN-1C表達(dá)可抑制細(xì)胞自噬［7］。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著雙重角色，適度自噬可幫助腫瘤細(xì)胞在放化療后在不利的條件下存活，而過(guò)度自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此，腫瘤細(xì)胞的自噬程度與新輔助化療療效有關(guān)［8-10］。然而，RTN-1C 表達(dá)和TNBC 新輔助化療療效是否有關(guān)目前研究較少。因此，本研究分析RTN-1C和TNBC新輔助化療療效的關(guān)系，以期為評(píng)價(jià)新輔助化療療效提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年7月—2020年12月在滄州市人民醫(yī)院接受治療的TNBC 女性患者為研究對(duì)象。TNBC 診斷參照《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范》［11］。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理活檢及免疫組化檢查確診為TNBC。（2）TNM 分期Ⅱ～Ⅲ期。（3）接受新輔助化療聯(lián)合手術(shù)治療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）于新輔助化療前接受免疫治療。（2）臨床資料不完整。（3）既往有惡性腫瘤史。（4）存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究最終納入154例TNBC患者，年齡29～66歲，平均（45．21±6．59）歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》，所有受試者知情同意并簽署知情同意書，經(jīng)滄州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床信息收集 收集所有受試者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、病理類型、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)和Ki-67表達(dá)＞30%情況、腫瘤直徑。

1.3 新輔助化療方案 所有受試者均給予新輔助化療，方案如下：多西他賽（75 mg/m2，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093092）、表柔比星（60 mg/m2，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041211）聯(lián)合環(huán)磷酰胺（500 mg/m2，山西普德藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023686），21 d 為1個(gè)療程，所有受試者術(shù)前均接受≥4個(gè)療程的新輔助化療。本研究將新輔助化療療程結(jié)束后乳腺原發(fā)病灶中未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的組織學(xué)證據(jù)或僅存在原位癌成分定義為病理學(xué)完全緩解［11］。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)RTN-1C 表達(dá)水平 抽取所有受試者化療前（T0）、化療7 d（T1）、化療14 d（T2）和化療21 d（T3）空腹肘正中靜脈血10 mL，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C 表達(dá)水平：（1）用RIPA 裂解液裂解單個(gè)核細(xì)胞，獲取總蛋白。（2）BCA 法蛋白定量。（3）10%的SDS-PAGE 分離膠電泳，電壓120 V 至溴酚藍(lán)跑出膠面，恒流300 mA 轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。（4）兔抗人RTN-1C單克隆抗體（武漢維克賽斯科技有限公司），稀釋比為1∶1 000，4 ℃孵育過(guò)夜。（5）山羊抗兔二抗（北京百奧萊博科技有限公司），稀釋比為1∶5 000，室溫下孵育2 h。（6）ELC發(fā)光液顯影，內(nèi)參為β-actin，用Image J軟件讀取灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R（3．6．3 版）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析。計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)RTN-1C 判斷新輔助化療療效的效能。Logistic 回歸分析新輔助化療療效的風(fēng)險(xiǎn)因素。構(gòu)建列線圖回歸模型預(yù)測(cè)新輔助化療后病理學(xué)完全緩解，一致性指數(shù)（C-index）、校準(zhǔn)曲線（Cilibration）和決策曲線（DCA）評(píng)估模型效能。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組RTN-1C 表達(dá)水平比較 154 例患者中絕經(jīng)者55 例；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌134 例，浸潤(rùn)性小葉癌13例，髓樣癌7例；T1期11例，T2期106例，T3期37例；N0期42例，N1期70例，N2期42例；TNM分期：Ⅱ期100 例，Ⅲ期54 例；按照組織學(xué)分級(jí)，Ⅰ級(jí)27 例，Ⅱ級(jí)105 例，Ⅲ級(jí)22 例；Ki-67 表達(dá)＞30%122 例。根據(jù)新輔助化療療效將患者分為完全緩解組（47 例）和未完全緩解組（107 例）。T1和T3時(shí)點(diǎn)完全緩解組的RTN-1C均低于未完全緩解組（P＜0．05）；2組T0、T1、T2時(shí)點(diǎn)的RTN-1C相對(duì)表達(dá)水平隨時(shí)間進(jìn)展均降低（P＜0．01）。見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of RTN-1C expression levels between the two groups表1 2組RTN-1C表達(dá)水平比較（±s）

Tab.1 Comparison of RTN-1C expression levels between the two groups表1 2組RTN-1C表達(dá)水平比較（±s）

＊＊P＜0．01；a與T0比較，b與T1比較，c與T2比較，P＜0．05。

組別完全緩解組未完全緩解組t n T0 T1 T2 T3 F 47 2．15±0．32 1．52±0．21a 1．06±0．17ab 0．88±0．09abc 320．408＊＊107 2．16±0．34 1．65±0．31a 1．02±0．20ab 0．97±0．08ab 510．894＊＊0．088 3．128＊＊1．028 6．797＊＊

Fig．1 Western blot assay of RTN-1C expression in the two groups圖1 2組RTN-1C表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫印跡圖

2.2 RTN-1C 評(píng)價(jià)新輔助化療療效的價(jià)值 T3-RTN-1C判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的ROC曲線下面積（AUC）高于T0-RTN-1C、T1-RTN-1C 和T2-RTN-1C（Z分別為4．652、3．098 和4．509，P＜0．01），最佳截?cái)帱c(diǎn)為0．91，見表2、圖2。

Tab.2 RTN-1C in judging the efficacy of neoadjuvant chemotherapy表2 RTN-1C判斷新輔助化療療效

2.3 完全緩解組和未完全緩解組的基線資料比較 完全緩解組和未完全緩解組的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、病理類型和腫瘤直徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。完全緩解組Ki-67＞30%、T3-RTN-1C≤0．91、N0 期和組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)占比均高于未完全緩解組（P＜0．05），見表3。

Fig．2 ROC curve of RTN-1C in judging pathological complete remission after neoadjuvant chemotherapy圖2 RTN-1C判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的ROC曲線

2.4 新輔助化療療效的風(fēng)險(xiǎn)因素分析 以病理學(xué)是否完全緩解為因變量（完全緩解=0，未完全緩解=1），Ki-67（≤30%=0，＞30%=1）、T3-RTN-1C（≤0．91=0，＞0．91=1）、N 分期（N0=0，N1＋N2=1）和組織學(xué)分級(jí)（Ⅰ＋Ⅱ=0，Ⅲ=1）為自變量，納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示T3-RTN-1C＞0．91、N1 期或N2期、組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)是新輔助化療后病理學(xué)未完全緩解的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0．05），見表4。

2.5 新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的列線圖模型構(gòu)建及評(píng)價(jià) 用Logistic 回歸分析篩選的危險(xiǎn)因素構(gòu)建列線圖模型，由N分期、組織學(xué)分級(jí)和T3-RTN-1C 構(gòu)建的列線圖模型A，見圖3A；由N 分期和組織學(xué)分級(jí)構(gòu)建的列線圖模型B，見圖3B。經(jīng)1 000次自助重抽樣，與實(shí)際情況比較，結(jié)果顯示模型A的擬合曲線和理想曲線重合度較高，均方誤差（MSE）為0．002，見圖3C；模型B 的擬合曲線和理想曲線重合度較差，MSE 為0．003，見圖3D。模型A、B 的Cindex 分別為0．866和0．772。DCA 顯示，當(dāng)閾值概率大于0．40 時(shí)，模型A 判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的凈收益高于模型B，見圖3E。

Tab.3 Comparison of baseline data between the two groups表3 2組的基線資料比較［例（%）］

3 討論

Tab.4 Logistic regression analysis of risk factors of neoadjuvant chemotherapy表4 新輔助化療療效風(fēng)險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

TNBC對(duì)化療具有一定敏感性，但經(jīng)過(guò)常規(guī)化療后預(yù)后仍較差。有研究顯示，新輔助化療可提高腫瘤手術(shù)完全切除率，延長(zhǎng)生存時(shí)間，但新輔助化療后未得到病理性完全緩解的TNBC 患者的預(yù)后較差［12］。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)新輔助化療后病理性完全緩解不僅可用于手術(shù)切除程度評(píng)價(jià)，還可作為TNBC 患者預(yù)后標(biāo)志物［13］。

化療、放療等抗癌療法可誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬，從而增加抗藥性［14］。目前已有研究表明癌細(xì)胞自噬與抗癌治療療效有關(guān)，準(zhǔn)確了解癌細(xì)胞自噬程度或可預(yù)判抗癌治療療效［15-17］。細(xì)胞自噬是依靠溶酶體將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)降解的過(guò)程，包括以下4個(gè)過(guò)程：雙層膜的杯狀分隔膜形成、自噬體形成、自噬體運(yùn)輸其包裹物與溶酶體融合、自噬體被溶酶體降解［18］。RTN-1C在細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其可上調(diào)LC3和自噬體積累，從而促進(jìn)自噬小體形成［19］。此外，RTN-1C 還可靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成，從而調(diào)節(jié)自噬［7］。腫瘤及腫瘤相關(guān)免疫等疾病狀態(tài)與外周血單個(gè)核細(xì)胞中部分基因或蛋白表達(dá)差異有關(guān)［20］，外周血單個(gè)核細(xì)胞中某基因或蛋白表達(dá)差異可能對(duì)腫瘤診斷及預(yù)后評(píng)估有潛在價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示完全緩解組T1和T3時(shí)點(diǎn)RTN-1C 均低于未完全緩解組，2 組RTN-1C 相對(duì)表達(dá)水平隨時(shí)間進(jìn)展均降低，提示外周血單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C 表達(dá)水平與新輔助化療療效有關(guān)，其表達(dá)水平或可評(píng)價(jià)新輔助化療療效。本研究構(gòu)建RTN-1C 判斷新輔助化療療效的ROC 曲線結(jié)果顯示T3-RTN-1C判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的AUC高于T0-RTN-1C、T1-RTN-1C 和T2-RTN-1C，表明T3-RTN-1C判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的效能較高，可輔助評(píng)價(jià)新輔助化療療效。

本研究中Logistic 回歸分析結(jié)果顯示T3-RTN-1C＞0．91是新輔助化療后病理學(xué)未完全緩解的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測(cè)其原因是RTN-1C調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，新輔助化療21 d后RTN-1C表達(dá)水平降低時(shí)癌細(xì)胞自噬程度降低，癌細(xì)胞此時(shí)較難通過(guò)自噬途徑抑制化療藥物誘發(fā)的損傷。因此，新輔助化療后RTN-1C表達(dá)水平降低預(yù)示病理學(xué)完全緩解。劉杰娜等［5］研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者Ki-67 高表達(dá)是新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的預(yù)測(cè)因子。劉德樟等［13］研究結(jié)果表明，Ki-67表達(dá)水平與新輔助化療療效無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示Ki-67 表達(dá)與新輔助化療療效無(wú)關(guān)，推測(cè)該差異與乳腺癌類型、樣本量及地域等因素有關(guān)，關(guān)于Ki-67 表達(dá)水平與新輔助化療療效的關(guān)系還需大樣本、多中心研究進(jìn)行證實(shí)。

Fig．3 Construction and evaluation of nomogram model圖3 列線圖模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

為彌補(bǔ)單指標(biāo)T3-RTN-1C 評(píng)價(jià)新輔助化療療效的不足，本研究構(gòu)建了基于T3-RTN-1C、N分期和組織學(xué)分級(jí)的列線圖回歸模型。模型A判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的C-index 高于模型B，MSE低于模型B，表明模型A有更高的區(qū)分度和精準(zhǔn)度。此外，當(dāng)閾值概率大于0．40時(shí)，模型A判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的凈收益高于模型B。因此，本研究認(rèn)為模型A對(duì)于新輔助化療后病理學(xué)完全緩解有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，當(dāng)然，還需要大樣本研究驗(yàn)證模型A的價(jià)值。

綜上所述，TNBC患者新輔助化療后21 d外周血單個(gè)核細(xì)胞中RTN-1C表達(dá)水平高提示病理學(xué)未完全緩解風(fēng)險(xiǎn)增加。模型A判斷新輔助化療后病理學(xué)完全緩解有較高的區(qū)分度、精準(zhǔn)度和臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究尚存在一定不足：一是本研究為單中研究，納入樣本量有限，且樣本選擇可能存在一定選擇偏倚，后續(xù)還需開展大樣本、多中心研究；二是本研究未評(píng)價(jià)RTN-1C 與TNBC 遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系，后續(xù)將隨訪TNBC，以了解RTN-1C與TNBC遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系；三是未開展基礎(chǔ)研究分析RTN-1C 參與TNBC 化療的病理生理機(jī)制；四是僅分析了T0、T1、T2和T3時(shí)點(diǎn)的RTN-1C 與新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的關(guān)系，對(duì)于其他時(shí)點(diǎn)的RTN-1C與新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的關(guān)系還未可知。