STAT4 rs7574865單核苷酸多態(tài)性與ANCA相關(guān)性血管炎的關(guān)系

曹越琦，薛超

原發(fā)性抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）相關(guān)性血管炎（AAV）是一種以ANCA 陽性為特征、累及全身多臟器的自身免疫性疾病，根據(jù)病理表現(xiàn)分為顯微鏡下多血管炎、嗜酸性肉芽腫性多血管炎和肉芽腫性血管炎3種類型［1］。我國約80%的AAV患者表現(xiàn)為顯微鏡下多血管炎，肉芽腫性多血管炎次之，占比小于20%，嗜酸性肉芽腫性血管炎相對少見［2］。近年來，隨著治療手段的進步，AAV 已從致死性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)槁约膊。浒l(fā)病機制仍不明確。研究認為其與遺傳因素密不可分［3-4］。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子-4（STAT4）基因編碼產(chǎn)物主要局限于淋巴系統(tǒng)及髓系內(nèi)，表達于炎癥部位的免疫相關(guān)性細胞胞漿，在體內(nèi)調(diào)控多種炎癥介質(zhì)信號通路，介導輔助性T（Th）1 細胞和Th17 細胞分化、凋亡。多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）和干燥綜合征中均存在Th1、Th17 細胞數(shù)量及功能紊亂［5-7］，故推測STAT4 基因可能在自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。目前有關(guān)STAT4單核苷酸多態(tài)性與AAV 易感性的相關(guān)研究較少，STATA4 在AAV中的遺傳機制不詳，本研究選取STAT4 rs7574865位點，探尋該位點在AAV中的遺傳學意義以及與AAV臨床癥狀之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 選取2005年1月—2018年12月就診于廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院的AAV 患者。納入標準：（1）診斷符合2018年增編版第二屆Chapel Hill 國際血管炎命名會議診斷標準［8］。（2）ANCA 陽性。（3）原發(fā)AAV 患者。排除標準：腫瘤、藥物、多臟器衰竭、妊娠以及繼發(fā)于其他自身免疫性疾病所致的血管炎。共納入145例為AAV組，其中男59例，女86 例，年齡19～82 歲，平均（53．99±14．97）歲；選取同期216 例體檢的健康人群作為對照組，其中男84 例，女132 例，年齡18～81歲，平均（51．35±12．65）歲。收集患者就診時是否伴發(fā)熱、蛋白尿、血尿、咯血癥狀。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2018 第KY-0100 號）。所有研究對象均知情同意。

1.2 基因信息 通過千人基因組計劃（http：//grch 37．ensembl．org/）查閱STAT4rs7574865 基因位點的信息，STAT4 rs7574865 符合最小等位基因頻率（MAF）≥0．05，且位于STAT4 基因的功能區(qū)?；蚍譃橐吧停℅G）、雜合突變型（GT）、純和型（TT）。遺傳模型：隱性模型（TTvs.GT+GG）、顯性模型（GT+TTvs.GG）、超顯性模型（GG+TTvs.GT）。

1.3 基因分型 采用多重PCR結(jié)合高通量測序（MPCR-HTS）方法［9-10］（上海生工生物工程有限公司）進行基因分型。設(shè)計引物序列，上游引物5'-TGTATGCAGTAAAAGTATGAAAAGTTGGTG-3'，下游引物5'-TTTTTCCACTTCTTGCTTTAGGAGTTCTAA-3'。合成位點引物池。第一輪擴增STAT4 rs7574865序列，PCR體系包含DNA模板2 μL、上游引物池1 μL、下游引物池1 μL、2×PCR Ready Mix 15 μL、RNase-free H2O 6 μL。使用PCR 儀器（BIO-RAD，T100TM）進行擴增，步驟：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8個循環(huán)；98 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個循環(huán)后以72 ℃延伸5 min。以上過程結(jié)束后，產(chǎn)物以4 ℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳測試產(chǎn)物大小，AMPure XP磁珠純化PCR產(chǎn)物。第二輪PCR反應(yīng)體系包括：第一輪PCR產(chǎn)物2 μL、通用P7引物1 μL、通用P5引物1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL、RNase-free H2O 11 μL（總反應(yīng)體積30 μL）?；靹蝮w系后進行PCR反應(yīng)：98 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束以4 ℃保存產(chǎn)物。終PCR 產(chǎn)物用AMPure XP 磁珠純化回收后利用HiSeq XTen 測序儀（Illumina，SanDiego，CA）進行測序。

1.4 統(tǒng)計學方法 Hardy-Weinberg 平衡使用SHEsis 在線軟件分析，P＞0．05為符合Hardy-Weinberg 平衡，提示群體具有代表性。采用SPSS 22．0 軟件用于數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。采用Logistic 回歸分析基因型與臨床癥狀發(fā)生風險的關(guān)系。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型及等位基因分布 2 組均符合Hardy-Weinberg 平衡（對照組：χ2=1．447，P=0．229；病例組χ2=0．722，P=0．396），2 組間基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of genotype and allele between the two groups表1 2組間基因型和等位基因分布對比

2.2 不同遺傳模型與AAV關(guān)系 不同遺傳模型下，2組基因型分布差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.2 Comparison of genotype in genotypic models between the two groups表2 2組不同遺傳模型基因型對比

2.3 基因型和等位基因在不同臨床癥狀中的分布 根據(jù)AAV組是否伴血尿、蛋白尿、咯血、發(fā)熱的臨床癥狀分亞組，不同亞組中基因型、等位基因分布差異均無統(tǒng)計學意義，見表3。

2.4 各臨床癥狀亞組不同遺傳模型下基因型分布 隱性模型下，血尿組TT基因型分布比例低于無血尿組（P＜0．05），余亞組間不同模型下基因型分布差異無統(tǒng)計學意義，見表4。

2.5 隱性模型下基因型與血尿發(fā)生風險分析 以是否有血尿發(fā)生（否=0，是=1）為因變量，基因型（TT=1，GG+GT=2）為自變量進行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示TT 基因型與血尿發(fā)生風險無關(guān)［（β=-1．873，SE=1．049，Wald χ2=3．187，OR（95%CI）＝0．154（0．020～1．201），P=0．074］。

Tab.3 Comparison of genotypes and allelic distribution between AAV clinical symptom subgroups表3 各AAV臨床癥狀亞組基因型及等位基因分布比較

Tab.4 Comparison of genotype distribution under different genetic models between different clinical subgroups表4 各臨床亞組不同遺傳模型下基因型分布比較

3 討論

STAT4 定位于細胞質(zhì)，具有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可特異性地介導來自干擾素誘導的靶細胞因子受體酪氨酸磷酸化的信號［11］。當其被激活后，會以二聚化的形式移至細胞核，進而影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達［12］。被激活的STAT4 具有促炎作用，參與自然殺傷細胞、肥大細胞、樹突狀細胞和Th 細胞的功能調(diào)節(jié)和分化，導致Th1/Th2 分化率向Th1 側(cè)轉(zhuǎn)移，激活特定的Th1 分化并抑制Th2 反應(yīng)［13-14］。STAT4主要表達于炎癥部位的免疫調(diào)節(jié)細胞中，被稱為“人體免疫調(diào)節(jié)劑”，在多種自身免疫性疾病中具有重要作用［15］。

目前國內(nèi)外有關(guān)STAT4 rs7574865 單核苷酸多態(tài)性與AAV易感性的研究較為缺乏，但其在其他自身免疫性疾病中的研究多有報道。有研究發(fā)現(xiàn)，在中國武陵山區(qū)的類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者中，rs7574865 的TT 基因型和T 等位基因均與RA 易感性相關(guān)，且為發(fā)病的危險因素，但與患者的類風濕因子或抗環(huán)瓜氨酸抗體抗體水平無關(guān)［16］。在RA 中，STAT4的異常激活可促進Th1和Th17細胞的分化增殖，是RA 致病的關(guān)鍵炎癥效應(yīng)因子之一［17］。一項Meta 分析顯示，T 等位基因與在亞洲人和歐洲人的SLE易感性之間存在關(guān)聯(lián)，基因型TT、GT、TT+TG和SLE 易感性相關(guān)［18］。此外，在我國北方漢族人群中研究發(fā)現(xiàn)SLE患者的T等位基因頻率明顯高于健康對照組，尤其在男性SLE 患者中［19］。一項伊朗SLE的研究也發(fā)現(xiàn)，rs7574865 T 等位基因是SLE 發(fā)病的危險因素，TT 基因型和GT 基因型與SLE 易感性相關(guān)［20］。Kariuki 等［21］發(fā)現(xiàn)歐洲和非洲裔美國人SLE患者血清中干擾素α 水平高于正常人，STAT4 rs7574865的基因多態(tài)性影響IFNα對外周血單個核細胞的敏感性，促進干擾素α誘導的基因表達，增加的干擾素α 信號通路為SLE 的危險因素，表明STAT4 rs7574865 的單核苷酸多態(tài)性與SLE 易感性有關(guān)。STAT4 rs7574865 單核苷酸多態(tài)性亦與我國江蘇省部分地區(qū)漢族人群原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）易感性有關(guān)［22］。在日本人群PBC 中發(fā)現(xiàn)，STAT4 基因遺傳變異通過影響IL-12 信號通路進而影響PBC發(fā)生，而患者血清中ANA的滴度水平也與STAT4 基因多態(tài)性有關(guān)［23］。此外，rs7574865 T 等位基因和GT 基因型與埃及患者的1 型糖尿病易感性有關(guān)［24］。rs7574865 T 等位基因攜帶者與系統(tǒng)性硬化癥（彌漫型）易感性相關(guān)，并與患者并發(fā)間質(zhì)性肺病、心臟損傷有關(guān)，與患者血清中抗拓撲異構(gòu)酶I抗體（ATA）滴度水平有關(guān)［25］。從上述研究可見，STAT4 rs7574865的單核苷酸多態(tài)性在不同人種，不同疾病中均起關(guān)鍵致病作用。本研究結(jié)果顯示，血尿組TT 基因型分布比例低于無血尿組，經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TT 基因型與血尿發(fā)生無關(guān)。本課題組既往研究顯示STAT4 rs10181656 多態(tài)性與AAV患者血尿發(fā)生有關(guān)［26］，而腎臟作為AAV較易累及的靶器官，臨床上時常會出現(xiàn)蛋白尿、血尿，甚至危及生命的腎功能衰竭，其分子機制及治療手段仍值得更多學者深入研究探索。

綜上，STAT4 rs7574865單核苷酸多態(tài)性與AAV易感性無關(guān)，與患者血尿、蛋白尿、咯血、發(fā)熱的臨床癥狀不相關(guān)。本研究結(jié)果不除外在抽樣上存在偏倚的可能，后續(xù)研究中應(yīng)擴大樣本量，并在生物機制層面深入探究。