常山酮對高原肺動脈高壓模型大鼠心肺功能的影響及其機(jī)制研究

王江濤，馬博華，沈會華，何佳，尹東鋒，王瑞，李悟△

高原肺動脈高壓（high-altitude pulmonary hypertension，HAPH）是機(jī)體暴露于海拔2 500 m 以上的高原環(huán)境后，因缺氧引起肺通氣功能代償性增加、肺血管收縮，進(jìn)而導(dǎo)致肺動脈壓力持續(xù)性增高、肺血管重構(gòu)及相關(guān)心肌疾病的發(fā)生，該病的發(fā)病率及病死率均較高［1-2］。高原缺氧環(huán)境可導(dǎo)致肺組織低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）含量顯著上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)下游血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等基因的表達(dá)，它們共同參與HAPH 的發(fā)生發(fā)展過程［3］。雖然近年來對低氧性肺動脈高壓的研究不斷增多，但其治療措施仍不理想。常山酮（halofuginone，HF）是從植物常山中提取的喹唑酮類物質(zhì)，具有抗血管肥厚、抑制細(xì)胞增殖和組織纖維化等作用，近來也被應(yīng)用于肺動脈高壓的研究［4］，但對高原環(huán)境誘導(dǎo)的肺動脈高壓療效仍不明確。本研究擬通過低壓低氧艙模擬海拔6 000 m高原環(huán)境，建立HAPH 大鼠模型，分析HF 對HAPH 的改善作用，并通過檢測HIF-1α、VEGF及ET-1表達(dá)水平探討其可能的機(jī)制，以期為HAPH的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（200±20）g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（新）2016-0003。動物實(shí)驗(yàn)方案通過新疆軍區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會審查。

1.1.2 試劑與儀器 HF（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，純度＞97%），烏拉坦（上海泰坦科技股份有限公司，純度＞99%），肝素鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司）；大鼠HIF-1α、VEGF、ET-1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙（中國人民解放軍新疆軍區(qū)總醫(yī)院），HX-200 小動物呼吸機(jī)、RM62160C 型多道生理信號采集處理系統(tǒng)及壓力傳感器（成都儀器廠），LEICA RM2135回旋式切片機(jī)（上海興曼生物科技有限公司），N-117M 顯微鏡（濟(jì)南利科醫(yī)療器械有限公司），TDZ5臺式離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司），DNM-9602酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與干預(yù) 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法從50只雄性SD大鼠中抽取40只，于模擬6 000 m高原環(huán)境的西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙中（壓力47．3 kPa，相對氧濃度10%）建立HAPH 大鼠模型，并分為模型組、低劑量組（HF 0．5 mg/kg）、中劑量組（HF 1 mg/kg）、高劑量組（HF 2 mg/kg）；另10只作為對照組于艙外喂養(yǎng)，所有大鼠均可隨意獲取水和食物。各實(shí)驗(yàn)組大鼠每天藥物灌胃1次，模型組和對照組給予等量蒸餾水灌胃，連續(xù)4周后進(jìn)行檢測。

1.2.2 平均肺動脈壓（mPAP）測定 各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉，平臥位固定于手術(shù)臺上，行氣管插管術(shù)后連接小動物呼吸機(jī)（呼吸頻率60次/min，潮氣量6 mL，呼吸比3∶2）。待生命體征穩(wěn)定后打開胸腔，充分暴露肺臟和心臟，用充滿肝素化生理鹽水（0．9%氯化鈉溶液+25 U/mL 肝素）的硬質(zhì)聚乙烯導(dǎo)管迅速插入右心室，導(dǎo)管另一端與壓力傳感器及生理信號記錄儀相連監(jiān)測壓力變化，測定各組大鼠右心室收縮壓（RVSP），mPAP=0．61×RVSP+2［4］。

1.2.3 右心室肥厚指數(shù)（RVHI）測定 測壓后處死大鼠，取出心臟，用生理鹽水沖洗，沿房室溝剪去左、右心房及大血管根部組織，沿室間隔邊緣分離出右心室（RV）、左心室+室間隔（LV+S），用濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，計算RVHI=RV/（LV+S）×100%。

1.2.4 肺血管重塑程度評定 切取大鼠左肺組織，置于4%多聚甲醛中固定后沿肺門橫斷取材，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度約4 μm，行HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺小動脈變化情況。

1.2.5 ELISA 測定大鼠血清和肺組織HIF-1α、VEGF、ET-1含量 經(jīng)大鼠下腔靜脈取血5 mL，3 000 r/min離心10 min，留上清液備用；取大鼠右肺前葉0．1 g 勻漿后，3 000 r/min 離心10 min，留上清液備用。應(yīng)用ELISA 試劑盒測定大鼠血清和肺組織中HIF-1α、VEGF、ET-1含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25．0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較方差齊用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett's T3檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mPAP 和RVHI 測定結(jié)果 與對照組比較，模型組mPAP 和RVHI 均明顯升高（P＜0．05）；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠mPAP和RVHI均明顯降低（P＜0．05）；與低劑量組比較，中、高劑量組大鼠mPAP 均明顯降低（P＜0．05）；中劑量和高劑量組大鼠mPAP 和RVHI 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 各組大鼠肺血管形態(tài)學(xué)改變 對照組大鼠肺小動脈管壁薄、管腔大；模型組大鼠肺小動脈管壁明顯增厚、管腔明顯狹窄，以動脈中膜平滑肌層增厚為主，表現(xiàn)出肺小動脈重塑的特征；低、中、高劑量組大鼠肺小動脈重塑呈現(xiàn)出不同程度的減輕，以中、高劑量組改善效果顯著。見圖1。

Tab.1 The results of mPAP and RVHI of rats in each group表1 各組大鼠mPAP和RVHI測定結(jié)果（n=10，±s）

Tab.1 The results of mPAP and RVHI of rats in each group表1 各組大鼠mPAP和RVHI測定結(jié)果（n=10，±s）

＊＊P＜0．01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量組比較，P＜0．05；表2同；1 mmHg=0．133 kPa。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組F mPAP（mmHg）15．16±0．48 37．48±0．71a 32．00±0．76b 23．57±3．17bc 22．79±1．79bc 259．020＊＊RVHI（%）22．93±1．79 54．29±4．90a 45．08±5．28b 41．52±5．59b 39．47±2．34b 71．012＊＊

2.3 大鼠血清和肺組織HIF-1α、VEGF、ET-1 含量測定結(jié)果 與對照組比較，模型組血清和肺組織HIF-1α、VEGF、ET-1含量均明顯升高（P＜0．05）；與模型組比較，中、高劑量組血清和肺組織HIF-1α、VEGF、ET-1 含量均降低（P＜0．05），而低劑量組僅肺組織VEGF、ET-1 含量降低（P＜0．05）；與低劑量組比較，中、高劑量組肺組織VEGF 及ET-1 含量降低（P＜0．05）；中劑量組和高劑量組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

3 討論

HAPH是因高原缺氧不適應(yīng)或不良適應(yīng)而引起的以肺動脈壓持續(xù)升高、肺血管重構(gòu)及肺血管平滑肌細(xì)胞過度增殖等為特征的進(jìn)展性疾病，是高原肺水腫、高原心臟病等高原性疾病的初始環(huán)節(jié)［5-6］。目前臨床上針對HAPH的治療手段主要包括脫離高原環(huán)境、長期氧療、鈣離子通道阻滯劑、前列環(huán)素類藥物、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等，但這些治療措施僅能緩解癥狀，尚不能逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展，嚴(yán)重影響了HAPH 患者的生活質(zhì)量，因此尋找新型治療藥物迫在眉睫［7］。

HF作為中藥常山的主要活性成分，已知在骨關(guān)節(jié)炎［8］、肺癌［9］、纖維化疾病［10］、自身免疫?。?1］等方面療效確切。HF能通過調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞的平衡來改善小鼠自身免疫性關(guān)節(jié)炎［12］。HF 可以通過抑制炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-18的釋放進(jìn)而抑制肺纖維化及細(xì)胞凋亡，改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷［13］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，HF 也可作為一種有效的肺血管擴(kuò)張劑，使肺血管舒張從而減輕慢性缺氧引起的肺動脈高壓，并有望成為一種治療肺動脈高壓的藥物［4］。本研究基于HAPH大鼠模型的結(jié)果也顯示，中、高劑量HF 對HAPH 有較明顯的改善作用，能有效降低HAPH 大鼠的平均肺動脈壓，減輕右心室肥厚，改善肺血管重塑。

高原環(huán)境下長期慢性缺氧會導(dǎo)致HIF-1α 在體內(nèi)迅速累積，從而進(jìn)一步激活下游基因VEGF、ET-1等異常表達(dá)［14-15］。研究表明［16］，HIF 信號參與低氧性肺動脈高壓的病理生理過程，是形成慢性高山病的重要因素。HIF-1α作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受氧氣濃度影響，并與血管生成、能量代謝、紅細(xì)胞生成密切相關(guān)；VEGF 和ET-1 作為HIF-1α 重要的靶基因，前者是促進(jìn)新生血管形成的關(guān)鍵因子，后者可引起肺血管強(qiáng)烈收縮及血管平滑肌細(xì)胞增殖，兩者共同加速肺動脈高壓的形成［3］。因此，抑制HIF-1α、VEGF 及ET-1 表達(dá)可能是防治HAPH 的重要靶標(biāo)。HF 已被證實(shí)對HIF-1α、VEGF 及ET-1 具有抑制作用。Kunimi 等［17］發(fā)現(xiàn)HF 能抑制視網(wǎng)膜缺血再灌注小鼠模型中HIF-1α的表達(dá)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。Assis等［18］進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HF能降低骨髓中VEGF含量，抑制細(xì)胞VEGF分泌和阻斷轉(zhuǎn)化生長因子-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減輕白血病小鼠模型的血管生成。Qin 等［19］在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HF能阻斷與ET-1介導(dǎo)的病理性肥大激活相關(guān)的基因表達(dá)。但目前關(guān)于HF 在HAPH中對HIF-1α、VEGF及ET-1的研究較為缺乏。

Fig．1 Morphological changes of pulmonary vessels in each group(HE staining×200)圖1 各組大鼠肺血管形態(tài)學(xué)改變（HE染色，×200）

Tab.2 Comparison of HIF-1α,VEGF and ET-1 contents in serum and lung tissue between five groups of rats表2 各組大鼠血清和肺組織HIF-1α、VEGF和ET-1含量比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of HIF-1α,VEGF and ET-1 contents in serum and lung tissue between five groups of rats表2 各組大鼠血清和肺組織HIF-1α、VEGF和ET-1含量比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0．01。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組F HIF-1α血清97．44±4．24 137．82±10．26a 128．59±12．65 116．79±9．07b 111．41±12．27b 23．533＊＊肺組織101．54±12．62 153．85±10．76a 146．54±9．39 129．36±7．29b 115．90±17．67b 31．739＊＊VEGF血清1 746．67±127．37 2 426．67±242．80a 2 315．00±165．93 1 935．00±121．02b 1 886．67±127．22b 32．135＊＊肺組織1 236．67±139．87 1 733．33±89．39a 1 488．33±103．13b 1 336．67±116．32bc 1 281．67±88．30bc 34．113＊＊ET-1血清357．27±7．11 500．00±61．54a 463．64±29．38 394．09±38．70b 374．09±19．62b 28．469＊＊肺組織315．45±33．27 460．91±38．63a 400．91±19．40b 359．55±30．23bc 331．36±36．82bc 32．724＊＊

本研究結(jié)果顯示，HAPH 大鼠血清和肺組織HIF-1α、VEGF 及ET-1 水平明顯升高，提示其與肺動脈壓升高等癥狀有一定的相關(guān)性。HF干預(yù)后，在HAPH 大鼠癥狀有效減緩的同時，血清和肺組織HIF-1α、VEGF 及ET-1 水平也明顯降低，進(jìn)一步提示HF改善HAPH大鼠平均肺動脈壓、右心室肥厚和肺血管重塑的作用可能與抑制HIF-1α、VEGF 及ET-1 水平相關(guān)，但關(guān)于HF 對VEGF 及ET-1 的抑制是直接作用還是由于抑制了上游HIF-1α 而起的間接作用，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，HF 對大鼠HAPH 具有一定的防治作用，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α、VEGF 及ET-1 表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究確定。