羊的胚胎移植技術(shù)要點(diǎn)

吳 瑛，吳 萍*

（1.畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，貴州畢節(jié) 551700；2.貴州新烏蒙生態(tài)牧業(yè)發(fā)展有限公司，貴州赫章 553200）

胚胎移植運(yùn)用在加速家畜的繁育進(jìn)程的同時(shí)可以保證生產(chǎn)性能，其商業(yè)化應(yīng)用已有30 年之久。羊的胚胎移植是指將供體羊進(jìn)行超數(shù)排卵配種后回收早期胚胎，移植到同一品種生理狀況相近的另一只受體體內(nèi)繼續(xù)妊娠產(chǎn)生后代羔羊的技術(shù)。該技術(shù)以“借腹懷胎”的方式，達(dá)到增加良種后代的目的，以胚胎冷凍保存的方式，對(duì)優(yōu)良畜禽遺傳資源進(jìn)行保護(hù)，為更好地進(jìn)行遺傳資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供了技術(shù)支撐。提供胚胎的個(gè)體稱為供體，接受胚胎的個(gè)體稱為受體[1]。胚胎移植最早應(yīng)用于牛的繁育工作，羊的胚胎移植起步晚、發(fā)展慢。我國(guó)羊的胚胎移植應(yīng)用始于20世紀(jì)后期，于1980 年在綿羊上首次應(yīng)用成功[2]。進(jìn)入21 世紀(jì)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)[3]、內(nèi)蒙古家畜改良站[4]等單位相繼報(bào)道，胚胎移植的妊娠率達(dá)56%，產(chǎn)羔率達(dá)46%，開(kāi)啟了我國(guó)胚胎移植商業(yè)化應(yīng)用的時(shí)代。近年來(lái)，關(guān)于胚胎移植在羊的生產(chǎn)應(yīng)用中的研究增多，集中在超排處理、移植妊娠率、胚胎冷凍保存等方面，為該技術(shù)的推廣及產(chǎn)業(yè)化夯實(shí)了基礎(chǔ)。本文從供受體羊的選擇與管理、移植季節(jié)選擇、藥物和器械準(zhǔn)備、手術(shù)方法選擇、沖胚及移植過(guò)程、胚胎冷凍保存、影響因素及應(yīng)用前景等方面進(jìn)行了詳細(xì)綜述，以期為開(kāi)展胚胎移植實(shí)踐提供參考。

1 供受體母羊的選擇

1.1 供體母羊的選擇原則

供體羊的選擇，是開(kāi)展胚胎移植應(yīng)用的首要環(huán)節(jié)，影響胚胎移植的效果。在實(shí)際生產(chǎn)中，供體母羊受遺傳價(jià)值、健康狀況、既住繁殖史、年齡和胎次、體質(zhì)體況等因素的影響，一般2～4周歲的經(jīng)產(chǎn)母羊較為合適[5]。供體母羊要提前選擇，群體數(shù)量要大以保證有足夠的數(shù)量供選擇，確保觀察的發(fā)情周期準(zhǔn)確，調(diào)整膘情到七成以上，不宜過(guò)肥或過(guò)瘦。若供體母羊在哺乳期內(nèi)，最好是在羔羊斷奶30d 后再選擇，斷奶之后加強(qiáng)補(bǔ)飼，盡量恢復(fù)到配種體況。

1.2 受體母羊的選擇原則

對(duì)受體母羊的選擇，不需要考慮遺傳性能、種用價(jià)值等遺傳因素，但要注重健康狀況、繁殖性能等生理因素，只要符合能適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境、繁殖性能好、母性強(qiáng)、無(wú)傳染性疾病和膘情在七成以上條件即可。生產(chǎn)中，尤其注意要節(jié)省試驗(yàn)和生產(chǎn)成本，盡量不選擇優(yōu)質(zhì)種羊。

1.3 供受體羊術(shù)前管理

供受體羊在接受胚胎移植手術(shù)前，需做好供體羊的飼養(yǎng)管理工作。一是要保持飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，避免出現(xiàn)較大的應(yīng)激；二是要提供合理的日糧及青干草，保持一定的膘情，過(guò)度肥胖會(huì)影響發(fā)情；三是要提供清潔、衛(wèi)生的飲水，保證健康，確保試驗(yàn)期間羊只不生?。淮送?，還要做好羊群的數(shù)據(jù)登記，建立胚胎移植數(shù)據(jù)庫(kù)，做到科學(xué)、精準(zhǔn)管理供受體羊，最好做到供受體羊群?jiǎn)为?dú)飼養(yǎng)管理，不混群。

1.4 胚胎移植季節(jié)的選擇

研究表明，品種、光照、溫度等均能影響羊的發(fā)情周期，大部分綿羊品種為季節(jié)性發(fā)情，少數(shù)為常年發(fā)情[6]。在每年的秋季，母羊的卵巢機(jī)能開(kāi)始活躍，卵泡發(fā)育成熟，表現(xiàn)出發(fā)情特征；在春夏冬等季節(jié)，母羊的卵巢機(jī)能基本處于靜默狀態(tài)，卵泡不發(fā)育，不表現(xiàn)發(fā)情和排卵[7]。因此，選擇適宜胚胎移植的季節(jié)，要根據(jù)氣候變化、羊的發(fā)情狀況等綜合考慮，最好是選擇羊的繁殖季節(jié)開(kāi)展，這樣效率最高。但有時(shí)候，為了配合幼畜超排技術(shù)，加快繁育進(jìn)程，則要強(qiáng)制在每年5 月份前后開(kāi)展胚胎移植。

1.5 供體羊輸精的選擇

供體羊的輸精工作是使精卵結(jié)合形成胚胎開(kāi)展后續(xù)移植工作的前提。一般而言，供體羊撤栓12h 后將試情公羊放入羊群進(jìn)行試情，根據(jù)反應(yīng)判斷發(fā)情情況，然后將發(fā)情母羊標(biāo)記、隔離。配種可以采用兩種方式：自然交配（人工輔助交配）和人工授精。前者較為簡(jiǎn)單，將公母羊合群后，觀察爬跨行為，登記即可，但要注意配后間隔8h 最好再?gòu)?fù)配1 次，直到母羊不接受爬跨為止。人工授精可以采用傳統(tǒng)人工授精或腹腔鏡人工授精技術(shù)。腹腔鏡人工授精技術(shù)是指借助腹腔鏡授精可以將精液直接送入母羊子宮角內(nèi)，該方法可以克服傳統(tǒng)輸精方法由于母羊子宮頸管道構(gòu)造特殊，精子不易通過(guò)所導(dǎo)致的情期受胎率低的問(wèn)題，大大提高了受胎率，但最好也間隔12h 再輸精一次。

1.6 藥品及手術(shù)器械的準(zhǔn)備

在胚胎移植工作中使用的藥物，必須保證產(chǎn)品可靠，有效成分含量準(zhǔn)確，經(jīng)試驗(yàn)表明性能穩(wěn)定，并且按照藥物運(yùn)輸和保存要求的條件妥善運(yùn)輸和保存[8]。主要藥物和器械分類整理如下：收卵器械包括沖卵管、腸鉗套乳注射器、膠管、帶硅膠管的16 號(hào)針頭、集卵杯、燒杯；檢卵設(shè)備包括體視顯微鏡、六孔杯、回收管、二氧化碳?xì)怏w、培養(yǎng)箱、帶硅膠管的7 號(hào)針頭、平底蒸發(fā)皿、顯微操作儀及附件；移植手術(shù)時(shí)還需要各種手術(shù)器械包括毛剪、外科剪、刀片、外科刀、創(chuàng)巾鉗、活動(dòng)刀柄、手術(shù)鑷、縫合線、止血鉗、持針器、縫合針、創(chuàng)巾若干、手術(shù)保定架、紫外燈、高壓消毒鍋；所需藥品及試劑包括促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和 孕馬血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、普魯卡因、腎上腺素及止血藥品、2%靜松靈、紗布、藥棉、抗生素及其他消毒液、生理鹽水等[9]。

2 超數(shù)排卵與同期發(fā)情

2.1 超數(shù)排卵原理

超數(shù)排卵是指在母羊發(fā)情周期的任一時(shí)間，對(duì)母羊注射外源激素，如FSH 和PMSG 等，使處理羊的血液中促性腺激素濃度升高，從而降低早期發(fā)育卵泡的閉鎖率，使成熟卵泡的數(shù)量增加，從而排出比自然發(fā)情情況下更多的卵細(xì)胞[10]，超數(shù)排卵是獲得大量胚胎的基礎(chǔ)。

2.2 超數(shù)排卵方法

目前，最常采用的超排處理方法是一是“陰道孕酮栓+PMSG+FSH”法，如郭振剛等[11]在貴乾半細(xì)毛羊上的研究表明，采取“埋置海綿孕酮栓+PMSG”法進(jìn)行同期發(fā)情及遞減法注射FSH進(jìn)行超數(shù)排卵處理及自然交配后，手術(shù)法在子宮角回收供體胚胎，結(jié)果10 只供體共計(jì)獲得胚胎106 枚，可利用胚胎73 枚，平均沖胚達(dá)10.60 枚/只，平均可用胚胎7.30 枚/只，胚胎合格率達(dá)68.87%，試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到國(guó)內(nèi)同類研究的平均水平。其次是兩次前列腺素（Prostaglandin，PG）+FSH 法，在發(fā)情周期的任意一天，對(duì)供體羊注射第一次PG（定為第0 天），觀察記錄第2～3天的發(fā)情情況，對(duì)能夠明顯觀察到發(fā)情情況的供體母羊從第11 天開(kāi)始注射FSH，每日2 次，注射劑量逐級(jí)遞減，3d 后再注射一次PG。

2.3 受體羊的同期發(fā)情

同期發(fā)情是使受體羊處于與供體羊同一生理基礎(chǔ)的先決條件，發(fā)情生理情況越接近，胚胎移植后的受胎率就越高[12]。如王玉琴等[13]研究，采用2～12h 的擴(kuò)展囊胚進(jìn)行移植，妊娠率可達(dá)94.74%。這是因?yàn)榕咛ブ荒芤浦驳脚c之發(fā)育要求相適應(yīng)的受體生殖環(huán)境中，才能繼續(xù)發(fā)育。因此若要采用鮮胚進(jìn)行移植，在供體超排的同時(shí)，必須對(duì)受體進(jìn)行同期發(fā)情處理，使之生殖生理狀態(tài)與供體同步化。而在選擇凍胚移植時(shí)，只需考慮移植的季節(jié)性，且在秋季移植可增加妊娠率[14]。

3 供體羊手術(shù)沖胚檢胚以及受體羊的手術(shù)移植

3.1 手術(shù)

術(shù)前準(zhǔn)備。超排前供受體母羊禁食至少24h，術(shù)前2h 禁水。

保定。使用胚胎移植手術(shù)架躺臥式保定，將四肢固定在手術(shù)架上，防止母羊手術(shù)過(guò)程中劇烈活動(dòng)。

備皮處理。羊只保定麻醉后，用肥皂水浸濕乳房周邊直徑約10cm 的肚腹，用刮毛刀或刀片刮凈羊毛，注意不要?jiǎng)潅つw，再使用毛巾擦拭干凈皮膚，最后用酒精噴灑消毒，覆蓋手術(shù)創(chuàng)巾，以創(chuàng)巾鉗固定四角，推進(jìn)手術(shù)室靜待手術(shù)。

手術(shù)。手術(shù)時(shí)，在乳靜脈與腹中線之間，用手術(shù)刀切開(kāi)皮膚及筋膜，倒過(guò)手術(shù)刀，以鈍頭分離腹直肌或前拉腹直肌，顯露腹股溝管處，在腹股溝管處剪開(kāi)或手術(shù)刀鈍頭直接破開(kāi)以顯露腹腔。切口不宜過(guò)大，否則影響縫合和愈合，也不能過(guò)小，過(guò)小不方便取出子宮而對(duì)子宮造成刺激或損失，適宜大小為1.5～2cm 寬。腹腔暴露后，伸進(jìn)食指和中指在骨盆腔、膀胱周圍觸摸子宮，然后輕輕勾住子宮體，將卵巢、子宮拉出，查看黃體位置并記錄。

3.2 沖胚

沖胚方法可分為輸卵管法、沖卵管法和子宮法，生產(chǎn)中多采用輸卵管法和子宮法。

輸卵管沖胚法：操作時(shí)，將沖卵管一端從輸卵管傘部喇叭口插入6～8 號(hào)頭皮針，插入2～3cm 深處，打活結(jié)或用鈍圓夾子固定，另一端接集卵器，用注射器吸取37℃沖卵液5～10mL，在子宮角靠近輸卵管部位，將針頭朝輸卵管方向扎入。一人操作時(shí)，一只手的手指在針頭后方捏緊子宮角，另一只手推注射器，沖卵液由宮管結(jié)合部流入輸卵管，經(jīng)輸卵管流至集卵器。此種方法的優(yōu)點(diǎn)是卵的回收率高、沖卵液用量少、檢卵省時(shí)，缺點(diǎn)是容易造成輸卵管傘部粘連[15]。

子宮角沖胚法：在供體羊發(fā)情授精后6～7d采卵，將子宮暴露，用套有膠管的腸鉗夾在子宮角分叉處，用注射液吸入沖卵液20～30mL，將沖卵針頭（套管針）從子宮角尖端插入。插入時(shí)確認(rèn)針頭在子宮角宮腔內(nèi)，連接注射器，緩緩注入沖卵液。當(dāng)子宮角膨脹時(shí)，立即將回收卵針頭從腸鉗基部的上方迅速插入，引導(dǎo)沖卵液收集于集卵杯內(nèi)。相同方法對(duì)另一側(cè)子宮進(jìn)行沖卵。進(jìn)針時(shí)避免損傷血管。該法的優(yōu)點(diǎn)是子宮角沖卵法對(duì)輸卵管損傷較小，主要用于超排母羊發(fā)情后的5.5～6d，從子宮可以收集到桑椹胚至擴(kuò)展囊胚，此時(shí)的胚胎可用于移植、冷凍或其他研究等，但該方法的胚胎回收率較低。

3.3 胚胎評(píng)定

鑒別可用胚胎和不可用胚胎是進(jìn)行下一步胚胎移植的關(guān)鍵，只有發(fā)育良好的胚胎才能用于移植，否則會(huì)嚴(yán)重影響移植受胎率。在收集沖胚液后，最好在20min 內(nèi)將其放置在顯微鏡下觀察，同時(shí)使用檢胚細(xì)管將獲取的胚胎移入新鮮培養(yǎng)液中，以保持胚胎活性。通常，以胚胎形狀，分裂球大小，卵裂球變形以及均勻度與透明帶間隙等項(xiàng)目對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)鑒定。一般來(lái)說(shuō)，可用胚胎的卵裂球輪廓清晰、球體圓滑又飽滿，而不可用胚胎表面不光滑、有毛邊且不圓。2 細(xì)胞的胚胎，卵裂球輪廓清楚、球體飽滿、透明度適中鑒定為1 級(jí)；1/3 卵裂球死亡的鑒定為2 級(jí)；1/2卵裂球死亡鑒定3 級(jí)；其余定為4 級(jí)[16]。只有1、2、3 級(jí)胚胎可用于移植。

3.4 移植

胚胎移植可采用手術(shù)法和腹腔鏡法。

手術(shù)法，在掏出子宮和卵巢后，查看黃體發(fā)育狀況，在黃體側(cè)，用鈍形針頭在子宮角穿孔，將移植管沿子宮角方向插入宮腔，注射胚胎，隨即輕輕復(fù)位子宮，縫合皮膚。胚胎移植時(shí)，原則上將來(lái)自輸卵管的胚胎移入輸卵管，來(lái)自子宮角的胚胎移入子宮角的前1/3 處。

腹腔鏡法，借助腹腔鏡找到子宮，再將胚胎移植針從另一側(cè)插入腹腔，將胚胎注射到相應(yīng)位置。該方法操作簡(jiǎn)便，但是需要一定的經(jīng)驗(yàn)。

3.5 縫合

創(chuàng)口縫合按照外科手術(shù)操作的原則進(jìn)行?？p合過(guò)程中不得觸碰其他無(wú)關(guān)物品。操作時(shí)要細(xì)心、迅速，不讓子宮體長(zhǎng)時(shí)間暴露。切忌多次、用力拉扯子宮。胚胎移植后，仔細(xì)檢查移植器中是否有胚胎遺漏，確認(rèn)無(wú)遺漏后方可縫合。手術(shù)創(chuàng)口縫合采用兩層縫合法，縫合內(nèi)肌層和皮膚，縫合肌肉層后撒適量青、鏈霉素粉，以防止創(chuàng)口感染，縫合皮膚后用碘酒消毒處理。

3.6 術(shù)后受體的飼養(yǎng)管理

胚胎移植后的受體，注意觀察并精心護(hù)理，定期查看是否返情。若發(fā)現(xiàn)受體發(fā)情，要做進(jìn)一步的觀察和檢查。在移植后45d 左右，可采用獸用B 超進(jìn)行早期妊娠診斷。對(duì)已妊娠的受體分群管理，預(yù)防流產(chǎn)，同時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)全面的飼草料，既要保證胎兒的正常發(fā)育，又要避免發(fā)育過(guò)度而引起難產(chǎn)。此外，還要根據(jù)當(dāng)?shù)丶膊“l(fā)生情況，及時(shí)接種相應(yīng)疫苗，讓胎兒提前獲得免疫能力。

4 影響胚胎移植效果的因素

4.1 受體品種

受體羊選擇，在胚胎移植中具有至關(guān)重要的作用。研究表明，不同品種用作受體羊移植單胚時(shí)，妊娠率和胚胎成羔率均無(wú)差異，但是移植雙胚胎時(shí)，胚胎妊娠率和胚胎成羔率有顯著差異[17]。

4.2 移植胚胎數(shù)量

趙霞等[18]報(bào)道，移植2 枚和3 枚胚胎時(shí)山羊的妊娠率顯著高于移植1 枚的。黃承俊等[19]研究也表明，移植2、3 枚胚胎的妊娠率明顯高于移植1 枚胚胎時(shí)的妊娠率。實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)羊的品種、體型大小及獲得的有效胚胎數(shù)量等來(lái)確定最佳移植數(shù)量。

4.3 采胚方法

研究表明，輸卵管法平均采集可用胚數(shù)高于子宮角法，但是子宮角法采集的胚胎具有更高的妊娠率和產(chǎn)羔率，是理想的采胚方法[20]。腹腔鏡技術(shù)可縮短單次移植時(shí)間，減少手術(shù)損傷，利于動(dòng)物健康，在加速胚胎移植的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中則更為廣泛。

5 胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用前景

作為最實(shí)用的高效繁育技術(shù)，胚胎移植可以結(jié)合優(yōu)秀公羊和優(yōu)秀母羊的品種優(yōu)勢(shì)，同時(shí)作為人工授精技術(shù)的延伸，將在家畜品種培育和改良中得到廣泛應(yīng)用。一方面，通過(guò)人工授精充分發(fā)揮良種公羊的配種能力，另一方面，胚胎移植還可以獲得優(yōu)良母羊的生產(chǎn)性能，這對(duì)羊的高效繁育具有重要意義。隨著整個(gè)胚胎移植技術(shù)體系的不斷進(jìn)步，其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用也將近一步得到發(fā)展。

6 小結(jié)

羊的胚胎移植需要同期發(fā)情、超數(shù)排卵等技術(shù)支撐，同時(shí)還需要胚胎收集、鑒定和移植等技術(shù)的配合，各項(xiàng)技術(shù)均需規(guī)范操作，因此，該項(xiàng)技術(shù)需要專業(yè)人才在整個(gè)過(guò)程中跟進(jìn)和監(jiān)督。此外，移植的季節(jié)性選擇、羊群的飼養(yǎng)管理、無(wú)菌操作環(huán)境以及藥物的合理化使用等在胚胎移植過(guò)程中也起到了重要作用。

本文從供受體羊的選擇與管理、移植季節(jié)選擇、藥物和器械準(zhǔn)備、手術(shù)方法選擇、沖胚及移植過(guò)程、胚胎冷凍保存、影響因素及應(yīng)用前景等方面的進(jìn)行了詳細(xì)綜述，以期為開(kāi)展胚胎移植取得良好效果提供參考。